專利名稱：糖氧化酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及糖氧化酶的變體，編碼所述變體的多核苷酸，產生所述變體的方法和使用所述變體的方法。
背景技術：
WO 99/31990公開了白小羊蹄菌(Microdochium nivale)糖氧化酶的氨基酸序列和核酸序列，以及其在烘烤中的用途。本發明的目的是提供改善的糖氧化酶。
發明內容
本發明提供了分離的糖氧化酶變體，其在對應于SEQ ID NO :2的位置4、15、19、
21、22、27、29、30、31、43、48、52、54、57、58、59、60、62、69、70、71、72、77、80、81、85、91、93、98、105、I12、I14、I18、122、129、130、131、132、133、134、135、138、140、146、147、148、152、153、157、169、170、174、184、188、201、213、221、222、223、224、227、228、231、235、248、249、
250、251、252、253、256、258、260、268、278、287、288、300、301、302、303、304、305、307、314、
315、316、317、318、319、320、321、322、323、327、330、332、342、347、349、352、353、354、355、
356、357、358、363、366、368、374、382、383、385、386、387、388、389、390、391、392、393、400、403、411、415、419、420、424、425、427、428、429、433、437、440、445、456、460、472 和 / 或 473的一個或多個(幾個)位置包含取代，其中所述變體具有糖氧化酶活性。本發明亦提供了分離的糖氧化酶變體，或具有糖氧化酶活性的分離的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列在對應于使用SEQ ID勵2進行編號的位置4、15、19、21、
22、27、29、30、31、43、48、52、54、57、58、59、60、62、69、70、71、72、77、80、81、85、91、93、98、105、112、114、118、122、129、130、131、132、133、134、135、138、140、146、147、148、152、153、157、169、170、174、184、188、201、213、221、222、223、224、227、228、231、235、248、249、250、
251、252、253、256、258、260、268、278、287、288、300、301、302、303、304、305、307、314、315、
316、317、318、319、320、321、322、323、327、330、332、342、347、349、352、353、354、355、356、
357、358、363、366、368、374、382、383、385、386、387、388、389、390、391、392、393、400、403、411、415、419、420、424、425、427、428、429、433、437、440、445、456、460、472 和 / 或 473 的至少一個或多個(幾個)位置與SEQ ID NO :2或由SEQ ID NO 1的核酸序列編碼的成熟多肽不同。
本發明還提供了編碼本發明的糖氧化酶的分離的多核苷酸，并涉及包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及涉及產生本發明的糖氧化酶的方法。本發明進一步提供了本發明的糖氧化酶在制備生面團和/或從生面團制成的烘烤產物中的用途，包括將本發明的糖氧化酶添加至所述生面團。本發明還提供了生面團和/或面包改善組合物，其包含本發明的糖氧化酶。所述生面團和/或面包改善組合物可進一步包含一種或多種生面團或面包添加劑，包括，例如第二酶如淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶或磷脂酶。
本發明進一步提供了用于將乳糖轉化為乳糖酸(LBA)的方法。LBA可用于產生食物和飲料產品，例如乳制品如乳酪，例如，通過將生成的LBA直接添加至食物和飲料產品和/或成分，或通過在食物和飲料產品或成分中原位生成LBA。LBA亦可用于化妝品。本發明還提供了包含本發明的糖氧化酶的酶顆粒、粉末和液體組合物。
具體實施例方式糖氧化酶活性術語“糖氧化酶活性”在本文中定義為在多種單糖或寡糖中催化伯醇的氧化，伴隨將分子氧還原為過氧化氫的酶活性。就本發明而言，糖氧化酶活性是根據由Blake 等,Analytical Biochemistry 177 156-160 (1989)描述的方法來確定的。一個單位的糖氧化酶活性等于在PH 6. 0，25°C每分鐘能夠釋放I y mo I過氧化氫的酶量。變體術語“變體”在本文中定義為在一個或多個(幾個)特定位置包含改變，如取代、插入和/或缺失一個或多個(幾個)氨基酸殘基的具有糖氧化酶活性的多肽。經改變的多核苷酸經過人為干預通過修飾多核苷酸序列，例如SEQID N01中公開的多核苷酸序列或其同源序列而得到。野生型酶術語“野生型”糖氧化酶表示由天然存在的微生物如見于自然界的細菌、酵母或絲狀真菌表達的糖氧化酶，即，編碼糖氧化酶的多肽并不是經過人為干預通過修飾多核苷酸序列而得到的。親本酶術語“親本”糖氧化酶用于本文指一種對其進行修飾，例如，取代、插入、缺失和/或截短(truncation)以產生本發明中的酶變體的糖氧化酶。該術語亦指變體用以比較和比對的多肽。所述親本可為天然存在(野生型)多肽或變體。舉例而言，所述親本多肽可為天然存在的多肽的變體，其氨基酸序列經修飾或改變。親本亦可為等位基因變體，其為由占據相同染色體位點的基因的兩種或更多可選形式中的任一種所編碼的多肽。分離的變體或多肽術語“分離的變體”或“分離的多肽”用于本文指一種自來源分離的變體或多肽。在一個方面，該變體或多肽至少是I %純的，優選至少是5%純的，更優選至少是10%純的，更優選至少是20%純的，更優選至少是40%純的，更優選至少是60%純的，甚至更優選至少是80 %純的，且最優選至少是90 %純的，其純度由SDS-PAGE確定。基本上(substantially)純的變體或多肽術語“基本上純的變體”或“基本上純的多肽”在本文中指一種多肽制備物，其包含至多10 %，優選至多8 %，更優選至多6 %，更優選至多5 %，更優選至多4%，更優選至多3 %，甚至更優選至多2%，最優選至多I %，且甚至最優選至多0. 5%以重量計的與其天然或重組結合的其他多肽物質。因此，優選地，基本上純的變體或多肽是以存在于該制備物中的總多肽物質重量計至少92%純的，優選至少94%純的,更優選至少95%純的,更優選至少96%純的,更優選至少96%純的,更優選至少97%純的，更優選至少98%純的，甚至更優選至少99%純的，最優選至少99. 5%純的，且甚至最優選100%純的。本發明的變體或多肽優選為基本上純的形式。其可通過，例如，以公知的重組方法或以經典的純化方法制備該變體或多肽而達成。成熟多肽術語“成熟多肽”在本文中定義為具有糖氧化酶活性的多肽，其為經翻譯和任何翻譯后修飾，如N末端加工、C末端截短、糖化、磷酸化等之后的其最終形式。在一個方面，所述成熟序列是SEQ ID NO :2的多肽。信號程序SignalIP3. 0程序可用于預測成熟多肽。 成熟多肽編碼序列術語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有糖氧化酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個方面，所述成熟多肽編碼序列是編碼SEQ ID N02的核苷酸。同一性兩個氨基酸序列間或兩個核苷酸序列間的相關性由參數”同一性”所描述。就本發明而言，兩個氨基酸序列之間的同一丨I"生程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman 和 Wunsch, 1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)確定，如 EMBOSS 軟件包(EMBOSS 歐洲分子生物學開放軟件組(The European Molecular Biology Open Software Suite),Rice 等，2000, Trends in Genetics 16 :276-277 http: //emboss, org)的 Needle 程序，優選為3. 0. 0版或之后的版本中執行的。所用的可選參數為缺口開放罰分(gap openpenalty) 10,缺口延伸罰分(gap extension penalty) 0. 5,和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的EMBOSS版)取代矩陣。使用標記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性并如下計算(相同的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口總數)就本發明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970,見上)確定，如 EMBOSS 軟件包(EMB0SS :歐洲分子生物學開放軟件組(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite), Rice 等，2000,見上http: //emboss. orR)的 Needle 程序，優選為 3. 0. 0 版或之后的版本中執行的。所用的可選參數為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。使用標記為”最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性并如下計算(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口總數)。同源序列術語“同源序列”在本文中定義為用白小羊蹄菌糖氧化酶CBS 100236在 tfasty 檢索(Pearson, ff. R. ,1999,于 Bioinformatics Methods and Protocols,S. Misener和S. A. Krawetz編，185-219頁)中給出小于0. 001的E值(或期望分數)的預測的多肽。多肽片段術語“多肽片段”在本文定義為從成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有糖氧化酶活性。亞序列術語“亞序列(subsequence) ”在本文中定義為從成熟多肽編碼序列或其同源序列的5'和/或3'端缺失了一個或多個(幾個)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有糖氧化酶活性的多肽片段。等位變體(allelic variant):術語“等位變體”在本文中表示占據相同染色體基因座的基因的任何兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發生，并且可導致種群內的多態性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術語“分離的多核苷 酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述分離的多核苷酸為至少I %純，優選至少5%純，更優選至少10%純，更優選至少20%純,更優選至少40%純,更優選至少60%純,甚至更優選至少80%純，并且最優選至少90%，并且甚至最優選至少95%純。基本上純的多核苷酸術語“基本上純的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制備物，其不含其它外來的或不期望的核苷酸，并且處于適合在遺傳工程多肽生產體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優選至多8%，更優選至多6%，更優選至多5%，更優選至多4%，更優選至多3%，甚至更優選至多2%，最優選至多1%，并且甚至最優選至多0. 5 %的與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區，如啟動子和終止子。優選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純,優選至少92%純,更優選至少94%純,更優選至少95%純,更優選至少96 %純，更優選至少97 %純，甚至更優選至少98 %純，最優選至少99 %，并且甚至最優選至少99. 5%純的。本發明的多核苷酸優選為基本上純的形式，即所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當用于本文時術語“編碼序列”的意思是直接指定其多肽產物的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的多核苷酸。cDNA :術語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉錄物是mRNA的前體,其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內含子序列。核酸構建體術語“核酸構建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或將所述核酸分子以本來不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區段或所述核酸分子是合成的。當所述核酸構建體含有表達本發明的編碼序列所需的調控序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”同義。調控序列(control sequence):術語“調控序列”在本文定義為包括編碼本發明多肽的多核苷酸表達所必需的所有組分。各個調控序列對于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各個調控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。最少的情況，調控序列包括啟動子和轉錄和翻譯的終止信號。調控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區的連接。可操作地連接術語“可操作地連接”在本文表示這樣的構型，其中將調控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調控序列指導多肽的編碼序列的表達。
表達術語“表達”包括涉及多肽產生的任何步驟，其包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術語“表達載體”在本文定義為線性的或環狀的DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，并與供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于用包含本發明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉化、轉染、轉導等是易感的(susceptible)。術語“宿主細胞”涵蓋由于在復制過程中發生的突變而與親本細胞不完全相同的親本細胞的任何后代。改善的性質術語“改善的性質”在本文中定義為與相對于親本糖氧化酶改善的變體相關的特征。此類改善的性質包括但不限于改變的溫度依存性活性概貌(profile)、熱穩定性、PH活性、pH穩定性、底物特異性、產物特異性和化學穩定性。在一個實施方案中，改善的性質包括對于溫度、過氧化氫、pH、脫酰胺、肽鍵的酰胺水解之一或多種的穩定性，和針對陰離子型表面活性劑的穩定性。改善的熱活性術語“改善的熱活性”在本文中定義為相對于親本糖氧化酶的溫度依存性活性概貌在特定溫度顯示糖氧化酶變體的溫度依存性活性概貌的改變的變體酶。所述熱活性值提供了酶在溫度范圍內進行水解反應催化的效率的量度。糖氧化酶具有特定的溫度范圍，其中多肽穩定并保留其酶活性，但隨著溫度增加而變得越來越不穩定從而活性越來越低。此外，由糖氧化酶催化的反應的起始速率可由溫度的增加而加速，這通過確定變體的熱活性來測量。改善的熱穩定性術語“改善的熱穩定性”在本文中定義為在升高的溫度溫育一定期間之后顯示相對于親本酶保留酶活性的變體酶。此種變體可能顯示或不顯示相對于親本改變的熱活性概貌。舉例而言，變體在升高的溫度溫育之后可具有相對于親本改善的重折疊能力。對于熱穩定性的測試會涉及對純化的樣品進行差示掃描量熱法(DSC)以確定糖氧化酶的熔融溫度Tm。在DSC中，相對于參照小室測量樣品小室中用于維持恒定溫度增加而消耗的熱量。維持恒定的加熱速率(例如，90°C/小時)。隨著為了維持恒定溫度增加而轉移至小室的熱的增加，觀察到吸熱過程(熱消耗過程，例如，酶/蛋白的解折疊)。DSC可使用來自MicroCal的MC2-裝置進行。將小室在20°C平衡20分鐘，然后以900C /h的掃描速率掃描至90°C。加載樣品，例如0. IM乙酸鈉，pH5. 5中的約2. 5mg/ml糖氧化酶樣品。若變體的Tm大于親本或野生型的Tm，則可認為其為改善的。在一個方面，變體糖氧化酶的熱活性與親本酶相比為至少I. 5倍，優選至少2倍，更優選至少5倍，最優選至少7倍，并且甚至最優選至少20倍的熱活性。改善的產物特異性術語“改善的產物特異性”在本文中定義為與親本相比顯示改變的產物概貌的變體酶，其中所述改變的產物概貌改善了變體與親本相比在給定應用中的性能。術語“產物概貌”在本文中定義為由酶水解產生的反應產物的化學組成。改善的化學穩定性術語“改善的化學穩定性”在本文中定義為在減少親本酶的酶活性的天然存在的或合成的化學品存在下在一段期間的溫育之后顯示酶活性的保留的變體酶。改善的化學穩定性亦可導致更好地能夠在此類化學品存在下催化反應的變體。化學品的實例包括陰離子型表面活性劑和h202。改善的對于蛋白水解性降解的抗性術語“改善的對于蛋白水解性降解”在本文中定義為在蛋白酶存在下在一段期間的溫育之后顯示酶活性的保留的變體酶。改善的抗性亦可導致更好地能夠在蛋白酶存在下催化反應的變體。變體命名規則 就本發明而言，公開于SEQ ID NO :2中的糖氧化酶的氨基酸序列用于確定在其他糖氧化酶中對應的氨基酸殘基。將其他糖氧化酶的氨基酸序列與公開于SEQ ID N0:2中的糖氧化酶氨基酸序列進行比對，并基于該比對，可以確定SEQ ID NO :2所公開的糖氧化酶的氨基酸序列中任何氨基酸殘基對應的氨基酸位置編號。多肽序列的比對可使用，例如，“ClustalW”(Thompson, J. D. , Higgins, D. G.和Gibson，T.J.，1994，CLUSTAL W :Improving the sensitivity of progressive multiplesequence alignment through sequence weighting，positions—specific gap penaltiesand weight matrix choice，Nucleic Acids Research 22 :4673-4680)得到。DNA 序列的比對可以使用所述多肽比對作為模板，將氨基酸用來自所述DNA序列的對應密碼子替代來進行。通常使用的逐對序列比較算法(pairwisesequence comparison algorithm)足以檢測未分歧超越大約20-30 %序列同一性的點的多肽序列之間的相似性(Doolittle,1992, Protein Sci. I :191-200 ；Brenner 等，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95，6073-6078)。然而，具有相同折疊(fold)和相似生物學功能的真正同源的多肽經常分歧到傳統的基于序列的比較無法檢測出其關系的點(Lindahl和Elofsson，2000，J. Mol.Biol. 295 :613-615)。在基于序列的搜索中較高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表現(probabilistic representation)(序型)搜索數據庫的搜索程序來獲得。舉例而言，PSI-BLAST程序通過迭代的(iterative)數據庫搜索過程來產生序型，并能夠檢測出較遠的同源物(Atschul 等，1997, Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402)。當目標多肽的家族或超家族在蛋白質結構數據庫中具有一個或多個(幾個)代表時，甚至可達成更高的敏感度。程序如 GenTHREADERCJones 1999，J. Mol. Biol. 287 :797-815 ；McGuffin 和 Jones，2003，Bioinformatics 19:874-881)使用來自多個來源(PSI-BLAST、二級結構預測(secondarystructure prediction)、結構比對序型(structural alignment profile)以及溶解勢(solvation potential))的信息作為向預測查詢序列(query sequence)的結構折疊(structural fold)的神經網絡的輸入。類似地,Gough 等，2000, J. Mol. Biol. 313 :903-919的方法可用于將未知結構的序列與存在于SCOP數據庫中的超家族模型進行比對，且上述模型可就其準確度使用多種為此目的開發的工具加以評價。對于已知結構的蛋白質,可用數種工具和資源以供找回(retrieve)和生成結構比對。舉例而言，已將SCOP超家族的蛋白質進行了結構比對，且這些比對是可獲取并可下載的。兩個或更多蛋白質結構可使用多種算法，如距離比對矩陣(distance alignmentmatrix)(Holm 和 Sander,1998, Proteins 33 :88-96)或組合延伸(combinatorialextension) (Shindyalov 和 Bourne, 1998, Protein Eng. 11 :739-747)進行比對，且這些算法的執行可另外用于查詢具有目標結構的結構數據庫，以發現可能的結構同源物(例如Holm和Park, 2000, Bioinformatics 16 :566-567)。這些結構比對可用于在相同結構超家族內的蛋白質中預測結構和功能上對應的氨基酸殘基。該信息，連同來源于同源性建模與序型搜索的信息，可用于在將目標突變從一個蛋白質移到一個接近的或較遠的同源物時預測哪個殘基會突變。在描述本發明的不同糖氧化酶變體時，為了參照方便起見，采用了下面所述的命名法。在所有情況下，使用通用的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。座也。對于氨基酸取代，使用下述命名法初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相應地，在226位用丙氨酸取代蘇氨酸命名為“Thr226Ala”或“T226A”。多重突變可以用加號(“ +，，)分開，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表分別在 205 和 411 位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代絲氨酸(S)的突變。籃失。對于氨基酸缺失，使用了如下命名法初始氨基酸，位置*。相應地，在位置195缺失甘氨酸命名為“Glyl95*”或“G195*”。多個缺失通過加號(“ + ”)分開，例如，“Glyl95*+Ser411*，，或 “G195*+S411*，，。通A。對于氨基酸插入，使用了如下的命名法初始氨基酸，位置，初始氨基酸，新插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入賴氨酸命名為“Glyl95GlyLys”或“G195GK”。多個氨基酸插入命名為[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，新插入的氨基酸#]，新插入的氨基酸#2 ;等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸記為“Glyl95GlyLysAla” 或 “G195GKA”。在此情況下，通過在插入的氨基酸殘基前的氨基酸殘基的位置號添加小寫字母而對插入的氨基酸殘基進行編號。因此，在上一例子中序列為
權利要求
1.一種分離的變體糖氧化酶，其在對應于SEQ ID NO :2的位置4、15、19、21、22、27、29、30、31、43、48、52、54、57、58、59、60、62、69、70、71、72、77、80、81、85、91、93、98、105、112、114、118、122、129、130、131、132、133、134、135、138、140、146、147、148、152、153、157、169、170、174、184、188、201、213、221、222、223、224、227、228、231、235、248、249、250、251、252、253、256、258、260、268、278、287、288、300、301、302、303、304、305、307、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、327、330、332、342、347、349、352、353、354、355、356、357、358、363、366、368、374、382、383、385、386、387、388、389、390、391、392、393、400、403、411、415、419、420、424、425、427、428、429、433、437、440、445、456、460、472 和 / 或 473 的一個或多個位置包含取代，其中所述變體糖氧化酶包含與SEQ ID NO 2或由SEQ ID NO :I編碼的成熟多肽具有至少60%同一性的氨基酸序列，而且其中所述變體具有糖氧化酶活性。
2.權利要求I的變體，其中所述變體為(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQ ID NO :2或由SEQ ID NO : I編碼的成熟多肽具有至少65%同一性，優選至少70%同一性，至少75%同一丨丨生,至少80%同一丨丨生,至少85%同一丨丨生,至少90%同一丨丨生，至少95%同一性，至少96%同一性,至少97%同一性,至少98%同一性,或至少99%同一性；或(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在中等嚴格條件，優選中-高嚴格條件，或高嚴格條件下與SEQ ID NO :1的成熟多肽編碼序列或其互補鏈雜交；或(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO :1的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性，優選至少65%同一1丨生，至少70%同一1丨生,至少75%同一1丨生,至少80%同一1丨生,至少85%同一1丨生,至少90%同一^丨生，至少95%同一丨丨生,至少96%同一丨丨生,至少97%同一丨丨生,至少98%同一丨丨生,至少99%同一'I"生的核苷酸序列。
3.權利要求I或2的變體，其中所述變體是親本糖氧化酶的變體，而且其中所述親本糖氧化酶包含具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽，或由具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多肽組成。
4.權利要求1-3任一項的變體，其在對應于一個或多個下述位置的位置包含取代15，22，27，54，98，188，201，222 和 460，使用 SEQ ID NO :2 進行編號。
5.權利要求1-4任一項的變體，其包含一個或多個下述取代D15N，Y22W，E27R，Q54D，N98D, K188R, K201R, N222D 和 / 或 T460E。
6.權利要求1-5任一項的變體，其與變體酶的親本糖氧化酶相比具有一種或多種改善的性質，其中所述改善的性質選自下組熱活性，熱穩定性，PH活性，pH穩定性，底物特異性，產物特異性和化學穩定性。
7.權利要求1-6任一項的變體，其在高pH或在高溫具有改善的穩定性。
8.—種分離的核苷酸序列,其編碼權利要求1-7任一項的變體。
9.一種重組宿主細胞,其包含權利要求8的核苷酸序列。
10.一種用于產生變體糖氧化酶的方法，包括 (a)在適于糖氧化酶的表達的條件下培養權利要求9的宿主細胞；和 (b)從培養基回收所述糖氧化酶。
11.一種用于制備生面團的方法，包括將權利要求1-7任一項的糖氧化酶添加至生面團。
12.權利要求11的方法，進一步包括烘烤所述生面團。
13.—種生面團組合物，其包含面粉和權利要求1-7任一項的糖氧化 酶。
全文摘要
本發明涉及糖氧化酶。本發明還涉及編碼變體糖氧化酶的多核苷酸，和涉及包含該核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞，以及涉及使用變體酶的方法，如制備生面團和生面團產品組合物。
文檔編號A21D8/04GK102625833SQ201080042563
公開日2012年8月1日 申請日期2010年7月9日 優先權日2009年7月24日
發明者L.H.奧斯特加德, L.德瑪利亞 申請人:諾維信公司