用于對模板dna進行復制、擴增和測序的方法

專利名稱：用于對模板dna進行復制、擴增和測序的方法
用于對模板DNA進行復制、擴增和測序的方法本發明屬于生物技術領域。具體而言,本發明涉及ー種使用Φ 29型DNA聚合酶對脫氧核糖核酸進行復制、擴增或測序的方法和ー種用于實施所述方法的試劑盒。現有摶術水平噬菌體Φ29復制其基因組所需要的唯一酶是其DNA聚合酶，這是既能催化復制起始又能催化合成鏈延伸的66KDa的単體蛋白。對于起始，該聚合酶與稱為“末端”(TP)的蛋白質結合，識別Φ29 ΝΑ的末端并催化TP-dAMP共價復合物形成。在聚合了 10個核苷酸后，DNA聚合酶/TP異ニ聚體解離，并延伸來自DNA的鏈。復制性DNA聚合酶需要與穩定酶和DNA間的結合的輔助蛋白相互作用(Kuriyan和O' Donnell. J Mol Biol. 1993 ;234 :915-925)。另ー方面，所述DNA聚合酶必須在當時未被復制的DNA鏈分離時偶聯聚合，為此它們需要與解旋酶型蛋白的功能締合。在這方面，噬菌體Φ29的DNA聚合酶具有以下使其獨特的各種內在功能特性a)高持續合成能力(定義為通過結合事件摻入的核苷酸數目)；b)高鏈分離能力，這使得其可在不存在解旋酶型輔助蛋白時復制所述噬菌體的基因組。持續合成能力和鏈分離這兩個特性使得Φ29 ΝΑ聚合酶能夠合成超過70kb長的DNA鏈(Blanco 等，J Biol Chem. 1989 ；264 :8935-8940)；c)在新鏈中插入核苷酸的高準確性(Esteban等，J Biol Chem. 1993 ；268 2719-2726)。所有這些特性導致開發各種各樣基于使用該聚合酶擴增雙鏈DNA(dsDNA)的等溫過程(恒溫)方案。在簡單構型中，Φ29 ΝΑ聚合酶利用環狀單鏈DNA(ssDNA)的能力使得可通過滾環式方法(或RCA-滾環式擴增)擴增DNA，產生很長的含有不止10個環狀模板拷貝 ssDNA 分子(Blanco 等，J Biol Chem. 1989 ；264 :8935-8940 ；US5001050, US5198543 和US5576204) ο在由 Amersham Biosciences/Molecular Staging(Dean%=, Genome Res. 2001 ；
11:1095-1099 ；Dean 等，Proc Natl Acad Sci USA. 2002 ；99 :5261-5266)開發的用于擴增dsDNA的方法中，將使用Φ29 ΝΑ聚合酶與使用六聚物(六-核苷酸)隨機序列引物聯合，使得能夠從皮克級環狀質粒DNA[GE Healthcare的Templiphi ]或從10納克基因組DNA[GE Healthcare 的 Genomiphi 和 Qiagen 的 Repli-G ]開始獲得 IO4-IO6 擴增因子。產生的產物具有高質量，并可直接被消化或測序而不需在前純化，這證明了 Φ 29DNA聚合酶是用于該目的的最強的酶。用于實施使用Φ29 ΝΑ聚合酶的擴增反應的常見緩沖液含有tris-HCl (pH 7. 5)加不同濃度(毫摩爾級)的 NaCl 或 KCl 和 MgCl2 (US20030207267)。然而，盡管這些方案在多種情況下令人滿意，但仍日益需要開發允許從更少DNA量開始的其它方案。發明簡沭本發明涉及ー種使用Φ 29型DNA聚合酶對脫氧核糖核酸進行復制、擴增或測序的方法和ー種用于實施所述方法的試劑盒。
噬菌體φ 29DNA聚合酶具有非常令人感興趣的用于擴增DNA的幾個特點，例如無需任何輔助蛋白參與的高持續合成能力；和高鏈分離能力，這使得其可在與DNA單ー結合事件中復制所述噬菌體的基因組；以及在新鏈中插入核苷酸的高準確性。這些特性導致開發各種各樣基于使用該聚合酶的用于等溫擴增DNA的方案，該聚合酶使得能夠獲得不需在前純化就可被直接消化或測序的高品質產物。然而，仍需要允許從其更小量擴增DNA的方案。本發明通過開發顯著改進反應的特異性和產量的用于擴增DNA的方法來響應該需要。在本專利實施例中顯示，將聚氧こ烯化單月桂酸山梨坦(Tween 20)和銨鹽同時加入通常用于用Φ 29DNA聚合酶來擴增的緩沖液中，一方面防止非特異性DNA擴增，另一方面使得能夠從有限量的O. I飛克(fg)的質粒DNA和作為模板的IOfg基因組DNA實現可檢測的特異性擴増。
本發明第一方面涉及ー種用于對模板DNA進行復制、擴增或測序的方法，所述方法包括使所述DNA與包含至少以下的反應混合物接觸a) Φ 29 型 DNA 聚合酶；b)聚氧こ烯化單月桂酸山梨坦；c)銨鹽；d)緩沖液；e)氯化鎂；f)引物；和g)核苷三磷酸。本發明該方面的一個優選實施方案涉及ー種用于對模板DNA進行復制、擴增或測序的方法，所述方法包括使所述DNA與反應混合物接觸,所述反應混合物包含前述(a)-(g)組分，并還包含鉀鹽。優選所述鉀鹽為氯化鉀或こ酸鉀。本說明書所用術語“DNA聚合酶”涉及能夠催化脫氧核苷三磷酸聚合的酶。通常，所述酶在與模板DNA序列雜交的引物3'端起始合成，并向模板DNA鏈的5'端行進。本發明所用術語“ Φ 29型DNA聚合酶”涉及在其聚合結構域中含有TPRl和TPR2亞域的任何DNA聚合酶，所述聚合結構域為聚合酶提供將向前聚合與鏈分離偶聯的能力。可用于本發明的Φ 29型DNA聚合酶的實例選自分離自以下噬菌體的DNA聚合酶Φ 29,Cp-UPRD-I、Φ 15、<ji21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、GA-l、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、L17 或酸菌屬瓶形病毒(Acidianus Bottle-shaped virus, ABV)。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，Φ29型DNA聚合酶選自分離自以下噬菌體的DNA聚合酶Φ 29、Cp-1、PRD-1、Φ 15、Φ 21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、GA-l、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、L17 或酸菌屬瓶形病毒(ABV)。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，Φ29型DNA聚合酶具有與SEQ ID NO: I具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一個更優選實施方案中，Φ 29型DNA聚合酶具有與SEQ ID NO :1具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一個甚至更優選的實施方案中，Φ 29型DNA聚合酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :1。Φ29型DNA聚合酶的核酸外切酶結構域為已知的，并可經修飾以降低核酸外切酶活性，但保留高持續合成能力和鏈分離能力。這些經修飾的DNA聚合酶尤其可用于大分子測序。在本發明用于復制、擴增或測序的一個優選實施方案中，Φ29型DNA聚合酶在核酸外切酶結構域中具有修飾，其中所述經修飾的DNA聚合酶與相應的天然存在的DNA聚合酶或“野生型”相比具有小于10%的核酸外切酶活性。在一個更優選的實施方案中，經修飾的￠29型DNA聚合酶與相應的天然存在的DNA聚合酶相比具有小于I %的核酸外切酶活性。在又一更優選實施方案中，經修飾的￠29型DNA聚合酶相對于相應的天然存在的DNA聚合酶缺乏可檢測的核酸外切酶活性。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，￠29型DNA聚合酶(天然的或在核酸外切酶結構域中被修飾的)的濃度為5nM-75nM。 在一個更優選實施方案中，￠29型DNA聚合酶(天然的或在核酸外切酶結構域中被修飾的)的濃度為25nM-60nM。在又一更優選實施方案中，$ 29型DNA聚合酶(天然的或在核酸外切酶結構域中被修飾的)的濃度為大約50nM。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦(Tween 20)的濃度為總反應體積的0. 003% -0. 1%。在一個更優選實施方案中，聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦的比例為總反應體積的0. 006% -0. 05%。在又一更優選實施方案中，聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦的比例為總反應體積的0. 01% -0.03%。在又一更優選實施方案中，聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦的比例為總反應體積的大約0. 025%。“總反應體積”應理解為將模板DNA加入到反應混合物中以后得到的體積。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，銨鹽選自硫酸銨、氯化銨或乙酸銨。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，銨鹽為硫酸銨。在一個更優選實施方案中，硫酸銨的濃度為30mM-60mM。在又一更優選實施方案中，硫酸銨的濃度為40mM-50mM。在又一更優選實施方案中，硫酸銨的濃度為大約45mM。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，銨鹽為氯化銨。在一個更優選實施方案中，氯化銨的濃度為60mM-120mM。在又一更優選實施方案中，氯化銨的濃度為80mM-100mM。在又一更優選實施方案中，氯化銨的濃度為大約90mM。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，銨鹽為乙酸銨。在一個更優選實施方案中，乙酸銨的濃度為60mM-120mM。在又一更優選實施方案中，乙酸銨的濃度為80mM-100mM。在又一更優選實施方案中，乙酸銨的濃度為大約90mM。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，緩沖液的pH為7.0-8. 5。在一個更優選實施方案中，緩沖液的pH為7. 2-8。在又一更優選實施方案中，緩沖液的pH為大約7. 5。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，緩沖液為tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個更優選實施方案中，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的pH為7. 0-8. 5。在又一更優選實施方案中，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的pH為7. 2_8。在又一更優選實施方案中，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的pH為大約7. 5。在本發明用于復制、擴增或測序的方法該方面的一個優選實施方案中，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的濃度為25mM-50mM。在一個更優選實施方案中，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的濃度為30mM-45mM。在又一更優選實施方案中，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的濃度為大約40mM。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，氯化鉀或乙酸鉀的濃度為30mM-70mM。在一個更優選實施方案中，氯化鉀或乙酸鉀的濃度為40mM-60mM。在又一更優選實施方案中，氯化鉀或乙酸鉀的濃度為大約50禮。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，氯化鎂的濃度為2mM-20mM。在一個更優選實施方案中，氯化鎂的濃度為5mM-15mM。在又一更優選實施方案中，氯化鎂為大約10mM。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦的比例為總體積的0. 01 % -0. 03 %，硫酸銨的濃度為40mM-50mM，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的濃度為30mM-45mM和pH為7. 2-8. 0，氯化鎂的濃度為5mM-15mM，且氯化鉀或乙酸鉀的濃度為40mM-60mM。 在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦的濃度為總體積的0. 025 %，硫酸銨的濃度為45mM，緩沖液tris_鹽酸、tris_乙酸或HEPES的濃度為40mM和pH為7. 5，氯化鎂的濃度為10禮，且氯化鉀或乙酸鉀的濃度為50mM。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦的比例為總體積的0.01% -0. 03%，氯化銨的濃度為80mM-100mM，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的濃度為30mM-45mM和pH為7. 2-8. 0，氯化鎂的濃度為5mM-15mM，且氯化鉀或乙酸鉀的濃度為40mM-60mM。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個更優選實施方案中，聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦的濃度為總體積的0. 025%，氯化銨的濃度為90mM，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的濃度為40mM和pH為7. 5，氯化鎂的濃度為10mM，且氯化鉀或乙酸鉀的濃度為50mM。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦的比例為總體積的0.01% -0. 03%,乙酸銨的濃度為80mM-100mM，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的濃度為30mM-45mM和pH為7. 2-8. 0，氯化鎂的濃度為5mM-15mM，且氯化鉀或乙酸鉀的濃度為40mM-60mM。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個更優選實施方案中，聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦的濃度為總體積的0. 025%,乙酸銨的濃度為90mM，緩沖液tris-鹽酸、tris-乙酸或HEPES的濃度為40mM和pH為7. 5，氯化鎂的濃度為10mM，且氯化鉀或乙酸鉀的濃度為50mM。本說明書所用術語“復制”涉及從模板DNA合成互補DNA。本說明書所用術語“擴增”涉及增加模板DNA的拷貝數。本說明書所用術語“測序”涉及測定模板DNA核苷酸的順序。“接觸”應理解為這樣的事實，即在引物延伸條件下孵育模板DNA與反應混合物。本文所用術語“引物”涉及當其在引物延伸條件下時能夠作為DNA合成起點起作用的寡核苷酸。優選引物為脫氧核糖寡核苷酸。可通過任何合適的方法制備引物，所述方法包括例如但不限于直接化學合成。可將引物設計為與模板DNA的特定脫氧核苷酸序列雜交(特異性引物)，或可隨機合成(隨意引物)。本說明書所用術語“特異性引物”涉及其序列與待擴增的模板DNA的特定脫氧核苷酸序列互 補的引物。“互補”應理解為這樣的事實，即引物可與模板DNA的區域雜交，使得當其在引物延伸條件下時可作為DNA合成起點起作用。優選該區域與模板DNA的區域具有100%互補性。換言之，與引物互補的區域中的各核苷酸可與單鏈模板中存在的核苷酸形成氫鍵。然而，具有本領域一般知識的人員將會承認，含相對于模板DNA具有小于100%互補性的區域的引物可發揮作用以實施本發明用于復制、擴增或測序的方法。術語“隨意引物”涉及其序列隨機合成并用于在模板DNA的隨機位置起始DNA合成的引物。通常，在本發明用于復制、擴增或測序的方法中，使用一組隨意引物。術語“隨意引物”涉及具有隨機序列并用于在模板DNA的隨機位置起始DNA合成的一系列引物。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，引物為特異性的。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的另一優選實施方案中，引物為隨意的。優選隨意引物受到保護免受3' -5'核酸外切酶的作用。且更優選隨意引物為6個核苷酸的寡核苷酸、“六核苷酸”或“六聚物”，其受到保護免受3' -5'核酸外切酶的作用。本說明書所用表述“受到保護免受核酸外切酶的作用”涉及經修飾的引物，使得其抵抗DNA聚合酶中存在的任何3' -5'核酸外切酶活性的核酸降解。在本發明用于復制、擴增或測序的方法中，可使用不止一種引物，能使用特異性引物和/或隨意引物。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一個優選實施方案中，引物的濃度為2 u M-100 u M0在一個更優選實施方案中，引物為的濃度20 yM-80 PM。在又一更優選實施方案中，引物的濃度為40 u M-60 u M0在又一更優選實施方案中，引物的濃度為大約50 u M。本說明書所用術語“核苷三磷酸”涉及由戊糖、氮堿基和三個磷酸基團的共價鍵形成的有機分子。術語核苷三磷酸包括脫氧核苷三磷酸(dNTP)，例如但不限于dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。優選脫氧核苷三磷酸為dATP、dITP、dGTP和dCTP。甚至更優選這四種dNTP處于等摩爾條件。在本發明該方面的一個優選實施方案中，脫氧核苷三磷酸的濃度為100 ii M-800 ii M。在一個更優選實施方案中，脫氧核苷三磷酸的濃度為200 u M-600 u M0在又一更優選實施方案中，脫氧核苷三磷酸的濃度為大約500 u M。 術語核苷三磷酸亦包括雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，例如但不限于ddATP、ddCTP、ddlTP、ddUTP、ddGTP、ddTTP 或其衍生物。在本發明用于復制、擴增或測序的方法的一些優選實施方案中，通過本領域現狀中熟知的技術標記至少一種核苷三磷酸或一種引物。被標記的核苷酸可為例如脫氧核苷三磷酸或雙脫氧核苷三磷酸。可檢測的標記包括例如放射性同位素、熒光標記、化學發光標記、生物發光標記或酶標記。本說明書所用術語“模板DNA”涉及可作為用于合成互補DNA鏈的底物的DNA分子；即其涉及待復制、擴增或測序的DNA分子。在一個優選實施方案中，模板DNA為質粒DNA。在另一優選實施方案中，模板DNA為基因組DNA。在引物延伸條件下實施模板DNA的復制、擴增或測序。表述“引物延伸條件”指其中可發生在引物中起始的依賴模板DNA的合成的條件。按照本發明用于復制、擴增或測序的方法，可通過熱循環過程或在基本上恒溫下發生模板DNA合成。“等溫條件”應理解為基本上恒溫。按照本發明用于復制、擴增或測序的方法，優選模板DNA合成在基本上恒溫下發生。更優選基本上恒溫為25-40°C，甚至更優選為大約30。。。允許DNA擴增的大量方法在本領域現狀中眾所周知。一些方法需要熱循環過程，例如但不限于聚合酶鏈式反應(PCR)。其它方法不需要熱循環過程，而是在基本上恒溫下進行，例如但不限于滾環式擴增(RCA)、多重置換擴增(m ultiple detachmentamplification,MDA)、鏈置換擴增(SDA)或環介導擴增(LAMP)。按照本發明方法可通過熱循環過程或在基本上恒溫下發生模板DNA擴增。按照本發明擴增方法，優選通過滾環式擴增(RCA)、通過多重置換擴增(MDA)、鏈置換擴增(SDA)或環介導擴增(LAMPA)來進行模板DNA的擴增。本發明另一方面涉及一種包括適于實施本發明用于復制、擴增或測序的方法的組成部分的試劑盒或裝置。本發明另一方面涉及一種用于實施本發明用于復制、擴增或測序的方法的試劑盒，所述試劑盒包括a) 29 型 DNA 聚合酶；b)聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦；c)銨鹽；d)緩沖液；和e)氯化鎂。優選所述銨鹽選自硫酸銨、氯化銨或乙酸銨。在本發明該方面的一個優選實施方案中，試劑盒還包括鉀鹽。優選所述鉀鹽為氯化鉀或乙酸鉀。在本發明該方面一個優選實施方案中，試劑盒還包括引物。在一個更優選實施方案中，引物為受到保護免受3' -5'核酸外切酶作用的隨意引物。在本發明該方面一個優選實施方案中，試劑盒還包括核苷三磷酸。例如，在本發明該方面一個更優選實施方案中，試劑盒還包括脫氧核苷三磷酸和/或雙脫氧核苷三磷酸。在本發明該方面一個優選實施方案中，試劑盒包括至少一種核苷三磷酸或一種標記引物。標記的核苷可為例如脫氧核苷三磷酸或雙脫氧核苷三磷酸。試劑盒還可包括但不限于任何形式的緩沖液、防止污染的試劑等。在另一方面，試劑盒可包括用于將其付諸實施及用于其優化所需的所有支持物和容器。優選試劑盒還包括用于實施本發明方法的說明書。貫穿本說明書和權利要求書的術語"包含"及其變體不排除其它技術特征、添加齊U、組分或步驟。對于本領域技術人員而言，可部分地從本說明書和部分地從本發明的實施推知其它目的、優勢及特征。通過舉例說明提供以下附圖及實施例，其不限制本發明。


圖I顯示Tween 20和(MM)2SO4在小29DNA聚合酶擴增能力方面的作用。如主要的正文所述在所示量的質粒DNA(4. 2kpb)存在下實施測定。在30°C孵育5小時后，如主要的正文所述分析反應物。左邊為用作DNA長度標記的在用HindIII消化Φ29 ΝΑ后獲得的線性DNA片段。圖2顯示Φ29 ΝΑ聚合酶在Tween 20和(MM)2SO4存在下對不同量的質粒DNA (飛克數量級)的擴增。如主要的正文所述在O. 025%1'硏^11 20和451111(見14)2304存在下實施測定。DNA長度標記與圖I中所用相同。圖3顯示NH4+離子在Φ29 ΝΑ聚合酶擴增能力方面的作用。如主要的正文所述在O. 025% Tween 20和所示銨鹽以及所示量的質粒DNA(4. 2kpb)存在下實施測定。在30°C孵育6小時后，如主要的正文所述分析反應物。DNA長度標記與圖I中所用相同。圖4顯示Φ29 ΝΑ聚合酶在Tween 20和(MM)2SO4存在下對不同量枯草芽孢桿菌基因組DNA的擴增。如主要的正文所述在O. 025% Tween 20和45mM(MM)2SO4存在下實施測定。DNA長度標記與圖I中所用相同。 圖5顯示通過將O. 025 % Tween 20和45mM (NH4) 2S04加入到用于基于029 DNA聚合酶的DNA擴增的商業試劑盒(General Electrics HealthCare的Illustra試劑盒)的目前反應緩沖液中所表示的顯著改進。如主要的正文所述實施測定。DNA長度標記與圖I中所用相同。實施例用于Φ 29DNA聚合酶擴增多引物DNA的實駘備件的優化本專利文件中提供的以下具體實施例起闡明本發明特性的作用。包括這些實施例僅為了闡明目的，不必理解為對本文主張的本發明的限制。因此，下述實施例闡明本發明而不限制其應用領域。業已顯示Φ 29DNA聚合酶從幾皮克環狀DNA開始擴增IO4-IO6倍。為此目的，使用含有40mM tris-HCl (pH 7. 5)、50mM KCl和IOmM MgCl2 (下文稱為緩沖液A)的反應緩沖液。在測試不同去污劑和鹽條件對Φ29 ΝΑ聚合酶的DNA擴增能力的影響后，發現將O. 025%Tween 20和45mM(NH4) 2S04同時加入到緩沖液A中，大大改善所提供的有限量的DNA的擴
士豳
>曰ο用于擴增質粒DNA的反應條件。-孵育混合物含有12. 5μ I緩沖液Α、50μΜ受保護免受3' -5'核酸外切酶作用的六聚物、500 μ M的各脫氧核苷三磷酸(dCTP、dGTP、dTTP和dATP)、所示量的質粒DNA (大小為4. 2kbp)，并按所示加入45mM (NH4) 2S04或O. 025 %Tween 20或二者的組合。通過在95°C孵育3分鐘和隨后在冰中冷卻5分鐘，使DNA變性。加入50ηΜΦ29 ΝΑ聚合酶后起始反應，通過加熱到65°C持續10分鐘在30°C孵育后終止反應。為了分析結果，從反應物中取出1μ I樣品，用EcoRI限制性核酸內切酶消化擴增的DNA，并在O. 7%瓊脂糖凝膠中電泳。通過用溴化乙錠對凝膠染色來檢測DNA。用于擴增基因組DNA的反應條件。-孵育混合物含有12.5μ I緩沖液Α、45mM(NH4)2SO4^O. 025% Tween 20、50 μ M受保護免受:V 核酸外切酶作用的六聚物、500 μ M各脫氧核苷三磷酸(dCTP、dGTP、dTTP和dATP)和所示量的枯草芽孢桿菌基因組DNA(大小為4Mpb)。通過在95°C孵育3分鐘和隨后在冰中冷卻5分鐘來使DNA變性。加入50ηΜ Φ29 ΝΑ聚合酶后起始反應，通過加熱到65°C持續10分鐘在30°C孵育后終止反應。為了分析結果，從反應物中取出I μ I樣品，并在O. 7%瓊脂糖凝膠中電泳。通過用溴化乙錠對凝膠染色來檢測DNA。圖I顯示加入45mM(NH4)2SOJP O. 025% Tween 20在擴增所提供的少量質粒DNA中的作用。如所示，當使用IOOfg所提供的DNA時，Φ 29DNA聚合酶用標準緩沖液A未產生可檢測的任何擴增產物。在這些反應條件中，在不存在DNA時加入O. 025 % Tween 20導致出現痕量DNA產物，大部分可能是由于隨機六聚物引物的雜交和延伸引起的非特異性DNA擴增。用IOfg所提供的DNA觀察到同樣的痕量。然而，在IOOfg所提供的DNA存在下，力口入O. 025% Tween 20使得Φ 29DNA聚合酶能夠產生可檢測量的擴增的質粒。特異性或非特異性擴增的DNA的總產量表明，將O. 025% Tween 20加入到緩沖液A中促進了 Φ 29DNA聚合酶的擴增能力。用NP40去污劑觀察到相似的作用。相反，所分析的其它去污劑例如Triton XlOO和Triton X114未促進Φ 29DNA聚合酶的擴增能力(未顯示)。將O. 025%Tween 20和45mM(NH4)2S04同時加入到緩沖液A中，在擴增產物的產量及特異性方面具有兩種結果1)在不存在所提供的DNA時檢測不到DNA擴增；2)即使在所提供的DNA量低至IOfg時，通過擴增也獲得若干Ug的單位長度的質粒DNA。作為對照，將45mM(NH4)2SO4W入到緩沖液A中對Φ 29DNA聚合酶擴增能力不產生任何改進。
因此，可得出的結論是，將O. 025% Tween. 20和45mM(NH4)2S04同時加入到緩沖液A中(下文稱為緩沖液B)對于實施Φ29 ΝΑ聚合酶對環狀DNA的多重引發擴增的實驗條件產生明顯優化，二者皆為擴增所提供的有限量(IOfg)的DNA所絕對必需的試劑。事實上，如圖2所見，使用緩沖液B使得Φ 29DNA聚合酶能夠用低至O. Ifg(約24個分子)的所提供的質粒量在6小時反應后合成微克DNA。作為質量控制，用EcoRI消化擴增產物產生了4. 2kb的線性dsDNA片段，這表明擴增產物確實是原始質粒的串聯重復。此外，緩沖液B亦防止非特異性DNA擴增(參見圖2中對應于未提供DNA所實施的反應的泳道)。圖3顯示銨離子和O. 025 % Tween 20在改進擴增少量質粒DNA方面的作用。在O. 025% Tween 20和所示銨鹽存在下在先前所述條件中實施測定。如圖3可觀察到的，NH4Cl和NH4CH3COO 二者都在擴增產物的產量和特異性方面具有與(NH4) 2S04相似的作用。該結果表明，前述(NH4)2SO4在擴增有限量質粒DNA中的作用是由于NH4+離子。 為了測定上述優化條件是否亦適用于擴增基因組DNA，在有限濃度的枯草芽孢桿菌基因組DNA(長4Mpb)存在下，進行了所實施的同樣類型的測定。如圖4所示，在緩沖液B中存在O. 025% Tween 20和45mM (NH4)2SO4, —方面防止非特異性DNA擴增(無所提供的DNA的泳道)，另一方面使得Φ 29DNA聚合酶能夠產生可檢測的和特異性的基因組DNA擴增，即使在使用IOfg所提供的DNA時，即相比目前商業基因組擴增試劑盒所推薦的量降低至 1/106。為了測定同時加入O. 025% Tween 20和45mM(NH4)2SO4是否提高用于基于029DNA聚合酶的DNA擴增的目前商業試劑盒的擴增效率，進行了如圖1、2和3所述相同類型的質粒DNA擴增測定。圖5顯示通過將O. 025% Tween 20和45mM(NH4)2S04加入到Illustra試劑盒(GE Healthcare)的目前反應緩沖液中所表示的顯著改進。如可觀察到的，根據供應商的推薦，用Illustra試劑盒只有在所提供的質粒量等于或大于IOpg時，才可以以在瓊脂糖凝膠中可檢測的方式擴增。與此相反，將O. 025% Tween 20和45mM(NH4)2SO4同時加入到Illustra試劑盒的反應緩沖液中，顯著降低所需的可擴增的DNA的量，從所提供的Ifg質粒DNA可觀察到擴增產物，這涉及擴增的四個數量級的提高。
權利要求
1.用于對模板DNA進行復制、擴增或測序的方法，所述方法包括使所述DNA與包含至少以下的反應混合物接觸 a)Φ 29型DNA聚合酶； b)聚氧こ烯化單月桂酸山梨坦； c)銨鹽； d)緩沖液； e)氯化鎂； f)引物；和 g)核苷三磷酸。
2.權利要求I的方法，其中所述反應混合物還包含鉀鹽。
3.權利要求2的方法，其中所述鉀鹽為氯化鉀或こ酸鉀。
4.權利要求1-3中任ー項的方法，其中所述聚氧こ烯化單月桂酸山梨坦的比例為總反應體積的O. 003% -O. 1%ο
5.權利要求4的方法，其中所述聚氧こ烯化單月桂酸山梨坦的比例為總反應體積的O. 006% -O. 05%。
6.權利要求5的方法，其中所述聚氧こ烯化單月桂酸山梨坦的比例為總反應體積的O. 01% -O. 03% ο
7.權利要求1-6中任ー項的方法，其中所述銨鹽選自硫酸銨、氯化銨或こ酸銨。
8.權利要求7的方法，其中所述銨鹽為硫酸銨。
9.權利要求8的方法，其中所述硫酸銨的濃度為30mM-60mM。
10.權利要求9的方法，其中所述硫酸銨的濃度為40mM-50mM。
11.權利要求7的方法，其中所述銨鹽為氯化銨或こ酸銨。
12.權利要求11的方法，其中所述氯化銨或こ酸銨的濃度為60mM-120mM。
13.權利要求12的方法，其中所述氯化銨或こ酸銨的濃度為80mM-100mM。
14.權利要求1-13中任ー項的方法,其中所述Φ29型DNA聚合酶選自分離自以下卩遼菌體的 DNA 聚合酶Φ 29、Cp-1、PRD-1、Φ 15、Φ 21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、GA-1、SF5、Cp_5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、L17 或 ABV。
15.權利要求14的方法，其中所述Φ29型DNA聚合酶具有與SEQ ID NO :1具有至少80%同一性的氨基酸序列。
16.權利要求15的方法，其中所述Φ29型DNA聚合酶具有與SEQID NO 1具有至少90%同一性的氨基酸序列。
17.權利要求16的方法，其中所述Φ29型DNA聚合酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :1。
18.權利要求1-16中任ー項的方法，其中所述Φ29型DNA聚合酶在核酸外切酶結構域中具有修飾，其中所述經修飾的DNA聚合酶與相應的天然存在的DNA聚合酶相比具有小于10%的核酸外切酶活性。
19.權利要求18的方法，其中所述經修飾的Φ29型DNA聚合酶與相應的天然存在的DNA聚合酶相比具有小于1%的核酸外切酶活性。
20.權利要求19的方法，其中所述經修飾的Φ29型DNA聚合酶相對于相應的天然存在的DNA聚合酶缺乏可檢測的核酸外切酶活性。
21.權利要求1-20中任ー項的方法，其中所述緩沖液為tris-鹽酸、tris-こ酸或HEPES。
22.權利要求1-21中任ー項的方法，其中所述緩沖液的pH為7-8.5。
23.權利要求1-22中任ー項的方法，其中所述氯化鎂的濃度為2mM-20mM。
24.權利要求23的方法，其中所述氯化鎂的濃度為5mM-15mM。
25.權利要求2-24中任ー項的方法，其中所述氯化鉀或こ酸鉀的濃度為30mM-70mM。
26.權利要求25的方法，其中所述氯化鉀或こ酸鉀的濃度為40mM-60mM。
27.權利要求1-26中任ー項的方法，其中所述核苷三磷酸為dCTP、dGTP、dTTP和dATP。
28.權利要求27的方法，其中所述dCTP、dGTP、dTTP和dATP核苷三磷酸為等摩爾量。
29.權利要求1-28中任ー項的方法，其中所述引物為隨意的，并受到保護免受核酸外切酶的作用。
30.權利要求1-29中任ー項的方法，其中所述模板DNA為質粒DNA。
31.權利要求1-29中任ー項的方法，其中所述模板DNA為基因組DNA。
32.權利要求1-31中任ー項的方法，其中所述擴增在25-40°C的基本上恒溫下進行。
33.權利要求1-32中任ー項的用于擴增模板DNA的方法，其中所述擴增通過滾環式擴增(RCA)、多重置換擴增(MDA)、鏈置換擴增(SDA)或環介導擴增(LAMPA)進行。
34.權利要求1-33中任ー項的方法，其中至少ー種核苷三磷酸或一種引物被標記。
35.用于實施權利要求1-34的方法的試劑盒，所述試劑盒包括 a)Φ 29型DNA聚合酶； b)聚氧こ烯化單月桂酸山梨坦； c)銨鹽； d)緩沖液；和 e)氯化鎂。
36.權利要求35的試劑盒，所述試劑盒還包括鉀鹽。
37.權利要求35或36的試劑盒，所述試劑盒還包括引物。
38.權利要求35-37中任ー項的試劑盒，所述試劑盒還包括權利要求29的引物。
39.權利要求35-38中任ー項的試劑盒，所述試劑盒還包括核苷三磷酸。
40.權利要求37-39的試劑盒，其中至少ー種核苷三磷酸或一種引物被標記。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種使用φ29DNA聚合酶對脫氧核糖核酸進行復制、擴增或測序的方法。依據所述方法，將所述聚合酶在尤其包含以下組分的反應混合物中孵育濃度為0.003-0.01％的聚氧乙烯化單月桂酸山梨坦，以及可為30-60mM硫酸銨、60-120mM氯化銨或乙酸銨的銨鹽。本發明還涉及一種用于實施所述方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102648289SQ201080039738
公開日2012年8月22日 申請日期2010年7月2日 優先權日2009年7月2日
發明者J·M·拉扎羅博羅斯, L·布蘭科達維拉, M·德貝加霍斯, M·薩拉斯法爾蓋拉斯, M·門西亞卡瓦列羅 申請人:康斯喬最高科學研究公司