硫化氫生成酶抑制劑的制作方法

專利名稱：硫化氫生成酶抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種以兒茶素類作為有效成分的硫化氫生成酶抑制劑。
背景技術：
硫化氫是具有刺激性氣味的氣體，已知具有刺激皮膚粘膜和引起呼吸麻痹等毒性。其毒性在社會學領域也被視作問題，希望除去硫化氫。在自然界中，硫化氫包含于火山氣體和溫泉等中，在人為方面，硫化氫通過石油化學工業等產生。此外，硫化合物有時被厭氧性細菌等還原而產生硫化氫，例如厭氧性細菌有時在污物和廢水等中繁殖而產生硫化氫。此外，產生硫化氫的細菌中，也有作為口腔內細菌或腸內細菌在機體內生存的細菌。這些細菌以食物殘渣和機體內的蛋白質為原料產生硫化氫。還已知機體內生成內源性硫化 Μ,ο已知硫化氫的毒性機理是因硫化氫的高反應性而導致對皮膚粘膜的刺激以及細胞色素c氧化酶的抑制。細胞色素c氧化酶抑制作用迅速發生，因此暴露于高濃度的硫化氫時，肺的氧分壓急劇降低，以至昏倒。此外，認為硫化氫在腦內增強NMDA受體的活性(非專利文獻1)。如上所述，硫化氫也由口腔內細菌或腸內細菌產生。由口腔內細菌或腸內細菌產生的硫化氫與自然界中或工業水平上產生的硫化氫相比規模較小。但是，如果機體內產生硫化氫，則該個體將以非常封閉的狀態暴露于硫化氫，其影響是直接的。此外，產生的硫化氫會帶來口臭、腸內氣體臭之類的惹人厭惡、令人不快的氣味。因此，對于由口腔內細菌或腸內細菌產生的硫化氫，希望對其進行阻斷或抑制。另外，呼氣中的揮發性硫化物(VSC) 中，硫化氫、甲硫醇和二甲硫醚約占90%，硫化氫可以說是口臭的主要原因之一。在口腔內，口腔內的脫落上皮細胞和白細胞、食物殘渣等被來源于細菌的蛋白酶分解成半胱氨酸和甲硫氨酸等含硫氨基酸，然后在硫化氫生成酶和甲硫氨酸酶的作用下生成硫化氫。作為口腔內的硫化氫生成酶，報道了半胱氨酸脫硫基酶和胱硫醚β合成酶等。專利文獻1揭示了由假單胞菌屬細菌和大腸桿菌純化的揮發性硫化合物生成抑制劑。但是，該抑制劑的目的是應用于以特定的醛、十一烯醛、脂環族酮等香料作為有效成分的家用制品，無法安全地應用于人體等。專利文獻2揭示了含有水溶性難消化性糖類作為有效成分的減少腸內硫化氫的組合物。但是，專利文獻2的減少腸內硫化氫的效果僅限于腸內，其減少機理也不明。專利文獻3揭示了阻斷、抑制機體內的硫化氫的生成的鎮痛用組合物。但是，專利文獻3的包含DL-炔丙基甘氨酸和氰基苯胺的鎮痛用組合物是抑制胱硫醚Y裂合酶、 抑制機體內的內源性硫化氫的生成的組合物。非專利文獻4揭示了兒茶素衍生物抑制來源于牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)的蛋白酶。但是，關于硫化氫生成酶的抑制既沒有記載也沒有啟示。非專利文獻5揭示了綠茶兒茶素抑制金屬蛋白酶。但是，關于硫化氫生成酶的抑制既沒有記載也沒有啟示。
現有技術文獻專利文獻專利文獻1 日本專利特開2008-173441號公報專利文獻2 日本專利特開2007-99672號公報專利文獻3 日本專利特開2007-112735號公報非專利文獻非專利文獻1 :Abe, K, Kimura H, J.神經科學(Neurosci.) 16，1066-71，1996非專利文獻2 =Persson S, Edlund M-B, Claesson R, Carlsson J 口腔微生物免疫(Oral Microbiol Immunol.) 1990 ；5 :195-201非專禾丨J文獻 3 Tanaka M, Yamamoto Y, Kuboniwa M, Nonaka A, Nishida N, Maeda K，Kataoka K, Nagata H, Shizukuishi S 微生物傳染(Microbes and Infection) 2007 ；6 1078-1083非專禾丨J文獻 4 Okamoto M, Sugimoto A, Leung K~P, Nakayama K, Kamaguchi A, Maeda N 口腔微生物免疫(Oral Microbiol. Immunol.) 2004 ；19 :118-120非專禾Ij文獻 5 =Demeule M, Brossard M, Page Μ, Gingras D, Beliveau R 生物化學生物物理學報(Biochim Biophys Acta.) 2000 ； 1478 :51-60.

發明內容
發明所要解決的技術問題本發明的目的是抑制硫化氫產生，特別是提供一種硫化氫生成酶抑制劑。解決技術問題所采用的手段本發明人為了解決上述課題，著眼于無副作用且安全性高的自古以來就為人所利用的來源于綠茶的成分，實施了針對細菌的硫化氫生成的抑制實驗，結果發現，兒茶素類具有硫化氫生成酶抑制活性，從而完成了本發明。發明的效果根據本發明，通過使用兒茶素類作為有效成分，能有效地抑制硫化氫生成酶，阻斷、抑制硫化氫的生成。此外，兒茶素類是來源于綠茶的成分，安全性高，給人的感覺好。因此，以兒茶素類作為有效成分的硫化氫生成酶抑制劑容易被消費者接受。附圖
的簡單說明圖IA所示為由比色分析得到的、EGCg和氯化鋅對半胱氨酸脫硫基酶和甲硫氨酸酶的抑制活性的結果。圖IA是F. η的結果。圖IB所示為由比色分析得到的、EGCg和氯化鋅對半胱氨酸脫硫基酶和甲硫氨酸酶的抑制活性的結果。圖IB是P. g的結果。圖IC所示為由比色分析得到的、EGCg和氯化鋅對半胱氨酸脫硫基酶和甲硫氨酸酶的抑制活性的結果。圖IC是T. d的結果。圖2A所示為由氣相色譜法分析得到的、EGCg和氯化鋅對硫化氫生成酶和甲硫氨酸酶的抑制活性的結果。圖2A是F. η的結果。圖2Β所示為由氣相色譜法分析得到的、EGCg和氯化鋅對硫化氫生成酶和甲硫氨酸酶的抑制活性的結果。圖2B是P. g的結果。圖2C所示為由氣相色譜法分析得到的、EGCg和氯化鋅對硫化氫生成酶和甲硫氨酸酶的抑制活性的結果。圖2C是T.d的結果。實施發明的方式本發明提供一種以兒茶素類作為有效成分的硫化氫生成酶抑制劑。兒茶素(catechin)狹義上是指C15H1406、分子量四0· 27、在木本植物的木芯中大量含有的水溶性多酚，廣義上包括作為其衍生物的多酚。本說明書中，為了使定義明確，兒茶素是指狹義的兒茶素，提及兒茶素類時，是指兒茶素以及作為其衍生物的一系列多酚。作為兒茶素類，特別是已知茶中所含的茶兒茶素。作為兒茶素類，已知(+)_兒茶素、(-)_表兒茶素、(-)_表沒食子兒茶素、(-)_表兒茶素沒食子酸酯、(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯、 (“)-沒食子兒茶素沒食子酸酯、(“)-兒茶素沒食子酸酯等。本發明還供一種以兒茶素類的(-)_表兒茶素沒食子酸酯、(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)_沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)_兒茶素沒食子酸酯或它們的混合物作為有效成分的硫化氫抑制劑。本發明還提供一種以(-)_表兒茶素沒食子酸酯、(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)_沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)_兒茶素沒食子酸酯的任一種或它們的混合物作為有效成分的、抑制來源于具核梭桿菌(FuscAacterium nucleatum)、牙齦卟啉單胞菌 (Porphyromonas gingival is)(Treponema denticola)的？!^化S1 生成Bl的硫化氫生成酶抑制劑。具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體均已知為口腔內細菌，還已知它們的硫化氫和甲硫醇的生成能力高，是牙周病菌(非專利文獻2、非專利文獻3)。本發明還提供一種含有所述硫化氫生成酶抑制劑的飲食品。飲食品包括生鮮食品、肉、魚等動物性食品，谷物、蔬菜等植物性食品，乳制品、面包、即食食品等加工食品，點心類等嗜好食品，甜味劑、調味劑等烹飪調味用材料，保健食品，特殊用途食品，水、清涼飲料水、酒精飲料、茶等飲料，食品加工材料，食品添加劑等。本發明還提供一種含有所述硫化氫生成酶抑制劑的口腔用組合物。作為口腔用組合物，可以采用牙膏、液體牙膏、液狀牙膏、濕牙粉等牙膏類，漱口水，口腔清洗劑，含片劑， 口香糖等形態。下面例舉本發明的例子進行說明，但本發明的范圍不限定于以下的例子。實施例1進行關于兒茶素類對硫化氫生成酶和甲硫氨酸酶的酶抑制活性的試驗。S卩，使用半胱氨酸和甲硫氨酸作為底物，添加來源于具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體的粗酶液，將各試劑混合，對作為甲硫氨酸酶產物的α-氧代丁酸、甲硫醇和作為硫化氫生成酶產物的丙酮酸、硫化氫進行定量，藉此測定對甲硫氨酸酶和硫化氫生成酶的抑制活性。材料及方法1-1 材料1-1-1硫化氫生成酶抑制劑候選對象使用以下試劑作為硫化氫生成酶抑制劑。即，作為兒茶素類，使用(+)_兒茶素、 (-)_表兒茶素、(-)_表沒食子兒茶素、(-)_表兒茶素沒食子酸酯、(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)_沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)_兒茶素沒食子酸酯(兒茶素類購自長良科學公司)以及沒食子酸、氯化鋅。這些抑制劑候選對象在本說明書中縮寫為(+)_兒茶素 C、(-)_表兒茶素EC、(-)_表沒食子兒茶素EGC、(-)_表兒茶素沒食子酸酯ECg、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCg、(-)_沒食子兒茶素沒食子酸酯GCg、(-)_兒茶素沒食子酸酯Cg、沒食子酸G、氯化鋅&iCl2。已知沒食子酸具有殺菌活性，其衍生物被用作口腔用組合物。已知氯化鋅具有口臭預防活性，被用于漱口水。1-1-2使用菌株作為硫化氫生成細菌，使用具核梭桿菌(本說明書中縮寫為F. η)、牙齦卟啉單胞菌(本說明書中縮寫為P. g)、齒垢密螺旋體(本說明書中縮寫為T.d)。作為菌株，具核梭桿菌使用JCM8532菌株、牙齦卟啉單胞菌使用W83菌株、齒垢密螺旋體使用ATCC保藏編號 35405的菌株。1-2試驗方法1-2-1各菌的粗酶液的制備將F. η接種于15ml胰蛋白胨大豆肉湯(Trypticase Soy Broth, TSB)，進行厭氧培養，直至生長到達穩定期為止。另外，胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)如下所述制備將3g胰蛋白胨大豆肉湯(DIFC0公司)和0. 3g酵母提取物(Yeast Extract) (DIFC0公司)溶解于IOOml水后，添加0. Iml氯高鐵血紅素(hemin) (5mg/ml，0. IN NaOH中)和0. Iml甲萘醌 (menadione) (0. 5mg/ml,50% EtOH 中)。將上述培育作為預培育，再接種于200ml TSB,于37°C厭氧培養，直至生長到達穩定期后M小時(培養時間2天)為止。接著，以3000Xg、10min、4°C的條件離心分離培養液，除去培養基成分，回收菌體。 然后，添加50mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)(將6. 05g三羥甲基氨基甲烷(分子量121)溶解于水，用HCl調整至pH7. 5后進行定容，調整至11)，再離心，洗滌菌體后，除去緩沖液，將菌體于-80°C冷凍。然后，將菌體懸浮于20-25ml的Tris-HCl緩沖液中，將細胞膜超聲波粉碎(20W，30 秒 X 15 次，0°C )。以20000Xg、30min、4°C的條件對其進行離心，將上清作為粗酶液。粗酶液用DC蛋白定量試劑盒(DC Protein Assay kit) (Pierce公司)進行蛋白質定量，在試驗體系中，按照終濃度0. 3mg蛋白質/ml的條件稀釋后使用。P. g和F. η同樣用TSB培養基培養。T. d用TYGVS培養基培養。培養時間為7天。 關于粗酶液的制備，P. g和T. d與F. η同樣進行。TYGVS培養基的制備如下所述。艮P，將下述I液 III液以及IOOml滅活兔血清混合制成。I 液5g 浸出液肉湯(heart infusion broth)、IOg 月夷蛋白月東(tryptone)、 IOg酵母提取物、IOg明膠、0. 5g硫酸銨、0. 5g K2HP04、0. Ig MgS04制成750ml的水溶液，調整至pH7. 0后，于121°C高壓釜中放置15分鐘而得；II 液將L-半胱氨酸HCl lg、葡萄糖lg、丙酮酸鈉0. 25g、
VFA液(將1. 7ml乙酸、0. 6ml丙酸、0. 4ml正丁酸、0. Iml正戊酸、0. Iml異戊酸、 0. Iml異丁酸、0. Iml DL-甲基丁酸和27. 9ml蒸餾水混合)5ml,TPP液(在0. 25g焦磷酸硫胺素中添加IOOml蒸餾水并混合)5ml、I-N KOH 16ml混合，再加水制成50ml的水溶液，調整至pH7. 2后，過濾滅菌而得；III液將Ig果膠溶解于IOOml蒸餾水，于121°C高壓釜中放置15分鐘而得。1-2-2采用比色定量的硫化氫生成酶(半胱氨酸脫硫基酶)抑制試驗作為硫化氫生成酶的一種的半胱氨酸脫硫基酶由半胱氨酸生成丙酮酸、氨和硫化氫。采用比色定量的硫化氫生成酶抑制試驗中，以半胱氨酸作為底物，以由半胱氨酸脫硫基酶生成的丙酮酸的量作為指標，將各試劑對硫化氫生成酶的抑制活性進行比較。溶液的制備如下所述制備300mM半胱氨酸溶液、酶-輔酶混合溶液、試樣溶液、3_甲基_2_苯并噻唑啉酮腙(MBTH)反應溶液。300mM半胱氨酸溶液將半胱氨酸用Tris-HCl緩沖液稀釋至300mM。酶-輔酶混合溶液在臨試驗前用Tris-HCl緩沖液調整，使反應體系中粗酶液的蛋白質量達到0. 3mg/ml、吡哆醛-5，-磷酸達到0. 05mM。試樣溶液將氯化鋅或兒茶素類用Tris-HCl緩沖液稀釋至各種濃度。3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)反應溶液將30mg MBTH溶解于50ml蒸餾水。 然后，添加IOOml的IM乙酸鈉緩沖液(pH5. 0)(將82. 03g乙酸鈉溶解于水，用乙酸調整至 PH5.0后進行定容，調整至11)。丙酮酸的定量在0. Iml 300mM半胱氨酸溶液和0. 2ml試樣溶液中添加0. 7ml酶-輔酶混合溶液，于37°C振蕩。1小時后，添加0.5ml 6%高氯酸終止反應，離心分離(3000Xg、10分鐘、 4°C)后，回收上清。在0. 4ml上清中添加1. 2ml MBTH反應溶液，于50°C反應30分鐘。反應液用乙酸鈉緩沖液稀釋3倍，于335nm處測定吸光度。所有試驗進行2次，求出其平均值。此外還制作了丙酮酸的校正曲線。抑制率抑制率是將加入試樣溶液時的丙酮酸量設為Pi,將添加Tris-HCl緩沖液來代替抑制劑溶液時的丙酮酸量設為Ptl，如下所述求得。抑制率(％) = (Ptl-Pi)/P。X 1001-2-3采用比色定量的甲硫氨酸酶抑制試驗作為半胱氨酸脫硫基酶的對照，測定對甲硫氨酸酶的酶抑制活性。甲硫氨酸酶以甲硫氨酸作為底物，生成甲硫醇、氨和α-氧代丁酸。采用比色定量的甲硫氨酸酶抑制試驗中，以由甲硫氨酸酶生成的α-氧代丁酸的量作為指標，將各試劑對甲硫氨酸酶的抑制活性進行比較。試劑的制備如下所述制備300mM甲硫氨酸溶液。酶-輔酶混合溶液、試樣溶液、3_甲基_2_苯并噻唑啉酮腙(MBTH)反應溶液的制備與上文中同樣地進行。300mM甲硫氨酸溶液將甲硫氨酸用Tris-HCl緩沖液稀釋至300mM。
α-氧代丁酸的定量在0. Iml 300mM甲硫氨酸溶液和0. 2ml試樣溶液中添加0. 7ml酶-輔酶混合溶液，于37°C振蕩。1小時后，添加0.5ml 6%高氯酸終止反應，離心分離(3000Xg、10分鐘、 4°C)后，回收上清。在0. 4ml上清中添加1. 2ml MBTH反應溶液，于50°C反應30分鐘。反應液用乙酸鈉緩沖液稀釋3倍，于335nm處測定吸光度。所有試驗進行2次，求出其平均值。此外還制作了 α-氧代丁酸的校正曲線。抑制率甲硫氨酸酶的抑制率是將加入試樣溶液時的α-氧代丁酸量設為Ki,將添加 Tris-HCl緩沖液來代替抑制劑溶液時的α -氧代丁酸量設為Ktl，如下所述求得。抑制率(%) = (K0-KiVK0XlOO1-2-4采用氣相色譜的硫化氫生成酶抑制試驗硫化氫生成酶由半胱氨酸生成硫化氫。采用氣相色譜的硫化氫生成酶抑制試驗中，以半胱氨酸作為底物，以由硫化氫生成酶生成的硫化氫的量作為指標，將各試劑對硫化氫生成酶的抑制活性進行比較。硫化氫的定量在試管中添加0.1ml L-半胱氨酸溶液、0.2ml試樣(抑制劑候選對象)溶液、 0. 7ml酶-輔酶混合溶液，用橡皮塞密封，在37°C水浴中邊攪拌邊保溫。60分鐘后，添加3M 磷酸水溶液終止反應后，再于37°C攪拌并保溫10分鐘。對于F. η抽取頂空氣體15μ 1，對于P. g抽取頂空氣體100 μ 1，對于T.d抽取頂空氣體50 μ 1，通過氣相色譜法測定硫化氫量。分析條件如下所述。柱HP-PL0T/Q(<ji0.53mmX30m)溫度70°C(2. 5min)—以 30°C /min 到達 190190°C (3. 5min)檢測器FPD分流比:48: 1注入量15、50及 100μ 11-2-5采用氣相色譜的甲硫氨酸酶抑制試驗作為硫化氫生成酶的對照，測定對甲硫氨酸酶的酶抑制活性。甲硫氨酸酶以甲硫氨酸作為底物，生成甲硫醇、氨和α-氧代丁酸。采用氣相色譜的甲硫氨酸酶抑制試驗中， 以由甲硫氨酸酶生成的甲硫醇的量作為指標，將各試劑對甲硫氨酸酶的抑制活性進行比較。甲硫醇的定量在試管中添加0. Iml L-甲硫氨酸溶液、0. 2ml試樣溶液、0. 7ml酶-輔酶混合溶液， 用橡皮塞密封，在37°C水浴中邊攪拌邊保溫。60分鐘后，添加3M磷酸水溶液終止反應后， 再于37°C攪拌并保溫10分鐘。對于F. η抽取頂空氣體40 μ 1，對于P. g和T. d抽取頂空氣體200μ 1，通過氣相色譜法測定甲硫醇量。分析條件如上所述。2-3 結果2-3-1采用比色定量的、兒茶素類對F.n的硫化氫生成酶(半胱氨酸脫硫基酶)和甲硫氨酸酶的抑制試驗的結果
1-2-2的結果示于表1、2，1-2-3的結果示于表3。兒茶素類對F. η的硫化氫生成酶(半胱氨酸脫硫基酶)的抑制活性從高到低依次為Cg > GCg > EGCg > ECg >沒食子酸、(+)-C，特別是Cg、GCg、EGCg和ECg具有高抑制活性。兒茶素類對F. η的甲硫氨酸酶的抑制活性從高到低依次為EGCg > ECg > EGC > EC、沒食子酸、C，特別是EGCg和ECg具有高抑制活性。關于此時的IC50, EGCg為0. 4mM, ECg為0. 8mM。[表1]表1各種兒茶素類對F. η的硫化氫生成酶(半胱氨酸脫硫基酶)的抑制率
權利要求
1.一種硫化氫生成酶抑制劑，其特征在于，以兒茶素類作為有效成分。
2.如權利要求1所述的硫化氫生成酶抑制劑，其特征在于，兒茶素類是(-)_表兒茶素沒食子酸酯、(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)_沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)_兒茶素沒食子酸酯的任一種或它們的混合物。
3.—種硫化氫生成酶抑制劑，其特征在于，以(-)_表兒茶素沒食子酸酯、(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)_沒食子兒茶素沒食子酸酯、(-)_兒茶素沒食子酸酯的任一種或它們的混合物作為有效成分，抑制來源于具核梭桿菌(FuscAacterium nucleatum)、牙齦卟 1#單1^菌(Porphyromonas gingivalis)或齒^密il旋體(Treponema denticola)的化氫生成酶。
4.一種飲食品，其特征在于，含有權利要求1 3中的任一項所述的硫化氫生成酶抑制劑。
5.一種口腔用組合物，其特征在于，含有權利要求1 3中的任一項所述的硫化氫生成酶抑制劑。
全文摘要
本發明的目的是抑制硫化氫產生，特別是提供一種硫化氫生成酶抑制劑。本發明人經認真研究后發現，兒茶素類具有硫化氫生成酶抑制活性，從而完成了本發明。即，本發明提供一種以兒茶素類作為有效成分的硫化氫生成酶抑制劑。
文檔編號A23L1/30GK102482662SQ20108003970
公開日2012年5月30日 申請日期2010年9月1日 優先權日2009年9月3日
發明者成瀨敦, 櫻井孝治, 菊池紗奈惠 申請人:羅蒂株式會社