專利名稱：生產超純低聚半乳糖的方法
技術領域：
本發明涉及從具有低的低聚半乳糖(G0Q含量的乳糖衍生糖漿開始制備高純度 (^95%)低聚半乳糖的領域。技術現狀低聚半乳糖(G0Q包括至少二糖、三糖、四糖、五糖和六糖的混合物，其中葡萄糖是游離還原端的糖，且鏈中的其他糖是以不同方式連接到彼此和連接到葡萄糖的半乳糖， 不同方式取決于用于從乳糖開始的轉糖基反應的酶。當前，對GOS的興趣穩步增長，因為最近研究已證實這些低聚糖作為益生元的功效在這種意義上，它們是非齲齒性的不可消化的低卡路里低聚糖的混合物，其刺激胃腸微生物區系的發展。GOS的另外的益處是它們的抗粘活性這些低聚糖可直接抑制由腸的病原體例如大腸桿菌引起的感染，充當通常攻擊胃腸上皮細胞的病原體的結合部位的模擬物 (mimics)。可商購的GOS通過利用從各種天然微生物(例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、 擴展青霉(Penicillium expansum)和環狀芽孢桿菌(Bacillus circulan))或改性微生物分離的半乳糖苷酶(乳糖酶)的轉糖基酶活性從乳糖合成。GOS結構根據酶源變化。 用天然酶生產的GOS的收率通常為20-45%，且可通過采用重組體或改性酶來增大。最廣泛商購的GOS形式包含按重量計約50-60%濃度的G0S，且還包含相當量的葡萄糖(G0S形成反應的副產物)和未反應的乳糖(起始材料)。這使得它們不能被患有糖尿病或乳糖不耐癥的人使用。在文獻中已知用于獲得高純度GOS (即不存在所有可消化糖(乳糖、葡萄糖、半乳糖)的GOQ的方法。這些方法包括通過色譜法、酶促氧化或微生物發酵來除去GOS中的葡萄糖和乳糖。然而，上述方法缺乏大規模適用性(在色譜法的情況下)或存在缺點。在Shoaf, K.等人 hfect. Immun. 74 (12) 6920-6928，2006 中，在實驗室中通過制備型TLC(因此以幾毫克的量)制備了含有無單糖和二糖的GOS的混合物。Splechtna, B.等人Enzyme and Microbial Technology 29 (6) 434-440，2001 描述了通過用真菌纖維二糖脫氫酶將乳糖選擇性地氧化成乳糖酸來除去剩余的乳糖。這種酶不易于得到且通過將乳糖氧化與以催化濃度存在的2，6_ 二氯-靛酚的還原結合來工作。通過將分子氧真菌漆酶催化還原成水來連續地再生被氧化的氧化還原介質。離子交換色譜法用于除去乳糖酸。Cheng, C. -C.等人 Biotechnol. Lett. 28793-797，2006 描述了通過用馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)發酵來除去剩余的乳糖該方法具有良好的收率且產生無葡萄糖、半乳糖、乳糖的高純度產物，但和乳糖一樣，在用馬克斯克魯維酵母處理之前存在于GOS混合物中的所有其他二糖也被微生物消耗。Li，Z.等人 Process Biochemistry 2008，43 (8)，896-899 描述了通過用固定在藻酸鈣上的釀酒酵母或乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)發酵來除去可消化糖。當使用乳酸克魯維酵母時，結果是良好的，但當使用釀酒酵母時，結果是不令人滿意的。使用馬克斯克魯維酵母或乳酸克魯維酵母的缺點是雖然兩者都可由公眾公開得至IJ，但它們通常不能用于食品工業中，且因此不能以即可使用的形式以低成本商購。明顯需要一種用于生產高純度GOS的可選擇的方法，該可選擇的方法還可以工業規模應用且所有的可消化糖(乳糖、葡萄糖、半乳糖)不存在或以小量存在并且使用易于得到且可廣泛得到的微生物。定義和縮寫GOS=低聚半乳糖發明概述本發明通過用于從較低純度的GOS混合物開始制備純度> 95%的GOS的方法克服了上述問題，在所述純度>95%的GOS中，可消化糖，乳糖、葡萄糖、半乳糖的總百分比 < 5%，所述方法包括采用嗜熱鏈球菌的發酵步驟和至少一個采用釀酒酵母的發酵步驟，其中通過能夠區別和量化GOS和所述可消化糖的任何分析方法來計算所述純度。該方法通過微生物凈化能夠選擇性地除去所述可消化糖。有利地，所述方法能夠獲得具有低含量的可消化糖(乳糖、葡萄糖和半乳糖)的 GOS混合物，其中轉糖基作用中形成的所有二糖并不都通過微生物除去。有利地，發現采用嗜熱鏈球菌的發酵步驟能夠選擇性地除去乳糖，而保留具有與乳糖的HPLC保留時間非常接近的HPLC保留時間的其他二糖。對于通過HPLC可區別的具有緊接在乳糖的峰后面的峰的低聚糖的這種獨特保留使得通過本方法獲得的產物不同于本領域已知的其他產物。上述方法使用廣泛用于食品工業的低成本的可商購的微生物；它們可直接以凍干形式(購買它們時的形式)使用，而不必通過制備預發酵混合物來活化它們。上述方法可易于以工業規模，即以多公斤規模應用。附圖簡述
圖1示出實施例1的通過由環狀芽孢桿菌乳糖酶催化的轉糖基作用從乳糖獲得的 40%純度的起始GOS樣品的HPLC結果(HPLC trace)；圖2示出實施例1的根據本發明用釀酒酵母去葡萄糖基化(deglucosation)后的 GOS樣品的HPLC結果；圖3示出實施例1的根據本發明用嗜熱鏈球菌去乳糖基化(delactosation)后的 GOS樣品的HPLC結果；圖4示出實施例1的根據本發明用釀酒酵母對與圖3相對應的樣品去半乳糖基化 (degalactosation)后的GOS樣品的HPLC結果A 在發酵至少20小時后，B 在發酵至少 40小時后；圖5示出實施例1的根據本發明的方法在結束時獲得的具有> 95%的純度的GOS 樣品的HPLC結果；圖 6 示出實施例 2 的起始 GOS 樣品，即從 GTC Nutrition, Golden, Colorado, USA 購買的 I^urimune^^GO-PgO)的 HPLC 結果；圖7示出實施例2的根據本發明的方法在結束時獲得的具有> 95%的純度的GOS 樣品的HPLC結果；
圖8示出實施例4的在用馬克斯克魯維酵母發酵后獲得的GOS樣品的HPLC結果。發明詳述在本發明的方法中，具有< 95%的純度的任何GOS混合物可用作起始材料，最便利地使用其中雜質基本上由可消化糖(乳糖、葡萄糖和半乳糖)組成的具有>40%的純度的GOS混合物。為了本發明的目的，為了計算GOS混合物的純度，優選使用能夠區別和量化G0S、 乳糖、半乳糖和葡萄糖的任何HPLC方法。術語“純度”指依據HPLC與所述GOS和可消化糖的峰相對應的面積百分比。40-60%純度(或更高)的GOS混合物可商購(例如，Oligomate 55,Vivinal G0S、 PurimuneXup oligo P)或可通過由已知用于所述目的的合適的乳糖酶諸如從環狀芽孢桿菌分離的乳糖酶催化的轉糖基作用從乳糖制備。特別地，當從40-60% GOS混合物開始時， 本發明的方法是便利的。優選地，本發明的方法是所述采用嗜熱鏈球菌的發酵步驟后面是采用釀酒酵母的發酵步驟的方法。嗜熱鏈球菌水解乳糖，然后消耗產生的葡萄糖并且積累半乳糖，半乳糖然后被釀酒酵母消除。通過采用嗜熱鏈球菌的發酵步驟，乳糖含量可被降至期望的水平，優選地按HPLC面積百分比計< 5 %，且更優選地< 3 %。在起始GOS混合物具有按HPLC面積百分比計<5%的葡萄糖含量的情況下，則所述方法包括采用嗜熱鏈球菌的發酵步驟，該發酵步驟后面是采用釀酒酵母的發酵步驟。嗜熱鏈球菌水解乳糖，然后在半乳糖積累期間消耗初始存在的少量葡萄糖和其產生的葡萄糖，然后半乳糖隨后被釀酒酵母消除。因此，例如(見實施例2)，通過從其中葡萄糖以按HPLC面積百分比計2%的量存在的約近似80%純度的可商購GOS混合物開始，可通過采用嗜熱鏈球菌的直接發酵將乳糖含量降至期望的水平，即相對于GOS的面積百分比的總和按面積百分比計< 5%。在GOS起始混合物具有按HPLC面積百分比計> 5%的葡萄糖含量的情況下，采用嗜熱鏈球菌的發酵步驟之前是采用釀酒酵母的發酵步驟；因此，在這種情況下，本方法包括以下3個步驟(a)采用釀酒酵母的發酵；(b)采用嗜熱鏈球菌的發酵；(c)采用釀酒酵母的發酵。因此，例如(見實施例1)，當從通過采用環狀芽孢桿菌的轉糖基作用獲得的具有約40%的純度的GOS混合物(見圖1)開始時，采用釀酒酵母的發酵(a)能夠幾乎完全除去存在于起始GOS混合物中的葡萄糖(見圖2)。發酵(b)使乳糖降低至小于3%的HPLC面積百分比(見圖3)。可看出，當用其中葡萄糖以約20 %純度存在的40-60 %純度的GOS混合物開始時， 如果采用嗜熱鏈球菌的發酵(b)之前是諸如發酵(a)的去葡萄糖基化步驟，則乳糖可被降低至3面積％以下，然而如果在不首先實施采用釀酒酵母的去葡萄糖基化步驟(a)下進行， 則采用嗜熱鏈球菌的直接發酵即使延長多于40小時，也不能使乳糖降低至期望的水平。采用釀酒酵母的發酵(C)使得在采用嗜熱鏈球菌的發酵后形成的剩余半乳糖幾乎完全被除去(見圖4)。在本方法結束時，獲得的GOS混合物具有>95%的純度，其中葡萄糖和半乳糖(如果不是不存在的話)以可忽略的量存在，然而，所述的葡萄糖和半乳糖連同乳糖一起總計 ^ 5% (見圖 5)。采用釀酒酵母的發酵優選地按以下進行在pH 6. 5 士 0.5下，在35 士 5°C的溫度下，持續至少12小時，每千克干重起始GOS使用40-15克脫水釀酒酵母。步驟(c)可甚至進行超過40小時的時間段，且在這種情況下，實際上實現在采用嗜熱鏈球菌的發酵(b)后形成的乳酸的大量除去(見圖4B)。采用嗜熱鏈球菌的發酵優選地按以下進行在40士5°C的溫度下，通過添加堿維持pH在6. 0-6. 5下，持續至少15小時，并且每千克干重起始GOS使用1-0. 4克脫水嗜熱鏈球菌。根據本發明的方法，在發酵步驟后，優選地使混合物通過陶瓷超濾、納濾、用碳脫色和離子交換樹脂去離子作用而經歷進一步的處理。根據本發明的方法，發酵步驟(b)和(C)之前是巴氏滅菌，巴氏滅菌優選地在 75 士 5 °C下進行至少5分鐘。實際上，在上述方法結束時獲得的產物表現獨特的GOS曲線；在采用嗜熱鏈球菌的發酵步驟期間，乳糖大體上被除去，這通過HPLC結果是明顯的(比較圖2與圖3，以及圖 6與圖7)，且還可注意到，在二糖區域中，仍存在具有緊接在乳糖保留時間(約12. 9分鐘) 之后的約13. 6分鐘的保留時間的組分(在實施例中以G0S6表示)。伴隨乳糖的去除，可注意到在緊接乳糖保留時間之前的具有約12. 4分鐘的保留時間的組分(在實施例中以G0S5 表示)的消失。GOS曲線的這種保留是獨特的，且不同于本領域已知的其他GOS混合物，例如通過色譜分離或在采用克魯維酵母屬微生物凈化后獲得的GOS混合物(見實施例4和比較圖1與圖8)，這些方法不加選擇地除去存在于GOS混合物中的所有二糖。因此，本發明還涉及通過本方法獲得的GOS混合物，即具有> 95%的純度的GOS混合物，其中除乳糖外的半乳二糖以的量存在，且可消化糖(乳糖、葡萄糖和半乳糖)的總百分比彡5%0通過本方法獲得的上述產物可用于已知的用途，包括藥物組合物、嬰兒配方奶粉和食品組合物的制備，這些是本發明的另外的方面。根據下面工作實施例可更好地理解本發明。實驗部分HPLC 方法這是使用與外標比較的HPLC方法。HPLC儀器與等梯度泵、自動進樣器、用于柱溫控制的珀爾帖烘箱、折光檢測器和裝備有類似前置柱的產品編碼ICE-99-9850的 Transgenomic柱ICE-SEP ICE-ION 300 一起使用。在下面的工作條件下進行分析柱溫40°C注射20 μ 1流動相H2SO4O. 015Ν流速0. 4ml/ 分鐘分析時間36分鐘積分儀Perkin Elmer Totalchrom 工作站在上述條件下，每種產物的保留時間為乳糖約12. 5分鐘，葡萄糖15. 0分鐘、半乳糖16. 2分鐘、乳酸21. 3分鐘和甘油22. 2分鐘(相對于外標)。在樣品溶液中，區分6個GOS產物峰并且標識為GOS 1 在約9. 3分鐘處的峰GOS 2 在約9. 7分鐘處的峰GOS 3 在約10. 3分鐘處的峰GOS 4 在約11. 3分鐘處的峰GOS 5 在約12. 4分鐘處的峰GOS 6 在約13. 6分鐘處的峰。在HPLC制表中，術語G0S1-6僅指歸屬于GOS的峰，與其中存在的糖單元的數目無關。積分系統通過以下公式自動計算含量%= AsX Cstd XVX 100/Astd X Ws其中Ac =樣品溶液中的峰的面積Cstd =標準溶液中的糖的百分濃度Ws=以克表示的樣品重量Astd =標準溶液中的糖峰的面積在方法監測期間，GOS峰的含量不是相對于它們自己的標準品來計算，而是通過使用乳糖的響應因子或通過評估以面積/總面積表示的其純度來計算。使用剛描述的分析方法，由于與其他低聚半乳糖的可能重疊而使乳糖的確定無效。重要的是注意到，使用上述分析方法對商用樣品中乳糖的確定和證書上提供的值之間存在巨大的差異。例如，由Friesland Foods Domo 提供的批號擬97770 的樣品 VIVINAL G0S60
具有基于干物質的17. 5%的認證的乳糖含量，而通過在我們的分析實驗室中進行的HPLC， 乳糖含量為33.2%。評估乳糖的相似評估見于批號20081217的Purimime 樣品中，其中GOS的認證的總純度為90.4%，然而，通過在我們的分析實驗室中進行的HPLC(附上)，所述純度為 83.0%，具有按面積百分比計13. 6%的乳糖純度。因此，通過我們的分析方法確定的乳糖被過高評估，導致過度評估存在于最終產物中的乳糖濃度。為了不在本說明書中產生歧義，在下文呈現的實施例中和在附圖部分中，僅給出通過上述HPLC方法獲得的純度值，對于商用產品的值也一樣。實施例1-從乳糖開始制備的實施例將80kg —水乳糖(0. 22kmol)懸浮在1201水中，并且在溫和攪拌下加熱到70°C，
直至乳糖完全溶解。將溶液溫度控制在50°C，并且用27ml 75%磷酸將pH從5. 5調節到5. 0。添加來自環狀芽孢桿菌的乳糖酶(1500U/g)。通過HPLC監測反應，并且在22小時后，檢測到GOS的形成以及葡萄糖和半乳糖的出現，且隨之發生乳糖面積百分比純度降低至小于40%。獲得200kg 40%的粗GOS溶液，粗GOS溶液的HPLC結果在圖1中示出，并且在下面以表格形式呈現
權利要求
1.一種用于從較低純度的GOS混合物開始制備具有> 95%的純度的GOS混合物的方法，在所述具有>95%的純度的GOS混合物中，可消化糖，乳糖、葡萄糖和半乳糖的總百分比< 5%，所述方法包括一個采用嗜熱鏈球菌(Str印tococcus thermophilus)的發酵步驟和至少一個采用釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)的發酵步驟，其中通過能夠區別和量化GOS和所述可消化糖的任何分析方法來計算所述純度。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述采用嗜熱鏈球菌的發酵步驟后面是采用釀酒酵母的發酵步驟。
3.根據權利要求2所述的方法，當起始GOS混合物具有HPLC面積百分比<5%的葡萄糖含量時，所述方法包括采用嗜熱鏈球菌的發酵步驟，其后面是采用釀酒酵母的發酵步驟。
4.根據權利要求2所述的方法，其中，當所述起始GOS混合物具有HPLC面積百分比> 5%的葡萄糖含量時，所述采用嗜熱鏈球菌的發酵步驟之前是采用釀酒酵母的發酵步驟。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述采用釀酒酵母的發酵按以下進行在pH 6. 5士0. 5下，在35士。C的溫度下，持續至少12小時，每千克干重起始GOS使用 40-15克脫水釀酒酵母。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述采用嗜熱鏈球菌的發酵優選地按以下進行在40士5°C的溫度下，通過添加堿維持pH在6. 0-6. 5，持續至少15小時，并且每千克干重起始GOS使用1-0. 4克脫水嗜熱鏈球菌。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中在發酵步驟后，使混合物通過陶瓷超濾、納濾、用碳脫色和離子交換樹脂去離子作用而經歷進一步的處理。
8.具有>95 %的純度的GOS混合物，其中除乳糖外的半乳二糖以> 1 %的量存在，且可消化糖，乳糖、葡萄糖和半乳糖的總百分比彡5%。
9.藥物組合物或食品組合物，包含根據權利要求8所述的GOS混合物。
全文摘要
本發明描述了一種通過使用涉及釀酒酵母和嗜熱鏈球菌的連續微生物凈化從較低純度的低聚半乳糖(GOS)開始制備超純(≥95％)低聚半乳糖的方法。
文檔編號C12P19/04GK102471792SQ201080035013
公開日2012年5月23日 申請日期2010年8月6日 優先權日2009年8月7日
發明者盧瓦納·瓦尼奧利, 西爾維亞·柏爾吉奧里尼, 西爾維亞·賈科梅利, 賈瓦尼·斯波納蒂, 雅格布·奇尼, 馬可·馬羅尼 申請人:意納科有限公司