包含益生菌的兒童口服營養增補劑的制作方法

專利名稱：包含益生菌的兒童口服營養增補劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及兒童營養領域。具體地，本發明涉及口服增補劑領域。本發明的一個實施方案涉及口服增補劑領域，所述口服增補劑包含益生菌和/或生物學活性非復制性益生菌，例如熱處理的益生菌。
背景技術：
兒童有特殊的營養需要。這些需要隨著兒童的年齡和發育狀態而極大不同。兒童期通常理解為在出生和青春期階段之間的時間段。因為兒童的發育，所以通常的平衡營養可能不總是足以提供充足的營養物以支持兒童的發育。此外,兒童可能患有例如食欲減退、容量不耐受(volume intolerance)、便秘或腹瀉，這不允許充足的食物攝取，或不允許從攝取的食物適當地吸收到所需營養物。已開發了專門的膳食增補劑用于此類情況，從而使得在此類不利的情況下，兒童的特殊需求仍可以得到滿足。一般地，在不充足的食物攝取的情況下，增補劑中的常量營養物被加工，以使得其更易于吸收。然而，希望還支持消化道的功能，從而使得消化系統更有效地工作。此類增補劑一 般針對特定類型的營養支持。例如，增補劑可以向個體提供額外的卡路里用于增加能量、或提供增加的鈣量以支持骨骼發育。當在病癥或手術的恢復期中使用組合物時，也期望組合物具有抗炎效果。兒童常與許多其他兒童密切接觸，并且因此需要強的免疫系統。然而，取決于發育狀態，他們的免疫系統可能仍是未成熟的。因此，進一步期望不僅給兒童提供營養支持還提供對免疫系統的支持，在兒童生病或從疾病中恢復的情況下提供允許降低炎癥程度的天然組合物、和/或提供允許消化道更好地發揮功能的手段。目前，這些需要通過提供允許容易吸收的經加工的常量營養物以及通過抗炎和/或免疫加強性食物成分或藥物進行解決。本領域仍然需要能夠根據兒童的特殊需要給兒童提供專門營養同時減少炎癥、力口強免疫系統和/或改善消化的營養增補劑。優選地這通過使用如下天然成分來達到，所述天然成分可以安全施用而無副作用，且可以容易地通過使用工業化加工而摻入營養增補劑內。本發明人解決了這一需求。因此，本發明的目的是對現有技術的改善，提供滿足上文所述需要的兒童用口服營養增補劑。本發明人很驚訝他們可以通過獨立權利要求的主題達到這個目的。從屬權利要求進一步發展本發明的想法
發明內容
由此本發明人提出提供包含益生菌的施用于兒童的特定口服營養增補劑。
為了本發明的目的，兒童應理解為1-13歲的人。
已經發現，益生菌能夠在液體口服營養增補劑的框架中提供其健康益處。
因為液體口服營養增補劑通常具有比包含益生菌的酸乳飲品長的貨架期，所以益生菌通常不加入此類營養增補劑中，因為不確定益生菌的生活力是否可以在延長的貨架期中得到保證。
本發明人現在能夠證實，即使非復制性益生菌也可以提供益生菌的健康益處，且甚至可以具有提高的益處。
因此，本發明的一個實施方案是施用于兒童的口服營養增補劑，其具有在 O. 9-1. 6kcal/ml范圍中的卡路里密度、在380_420m0sm/kg水范圍中的重量摩爾滲透壓濃度，且包含占組合物約10-13%卡路里的蛋白質來源、占組合物約43-55%卡路里的碳水化合物來源、占組合物約33-46%卡路里的脂質來源、以及益生微生物。
本發明的口服營養增補劑優選是液體口服營養增補劑。
在一個實施方案中，該液體口服營養增補劑可以作為腸道營養物經由管飼施用。
例如，口服營養增補劑可以具有在0.9-1. lkcal/ml范圍中的卡路里密度、在 380-420m0sm/kg水范圍中的重量摩爾滲透壓濃度，以及占組合物約11_13%卡路里的蛋白質來源、占組合物約53-55%卡路里的碳水化合物來源、和占組合物約33-34%卡路里的脂質來源。
此組合物可以含有例如水、糖、麥芽糖糊精、酪蛋白鈉(乳)、高油酸向日葵油、大豆油、中鏈甘油三酯、乳清蛋白濃縮物、酪蛋白鈣。
此組合物是良好平衡的且支持健康生長。它可以施用于具有特殊健康需要的兒童，患有生長發育遲滯(failure to thrive)、谷蛋白不耐受、經口攝入不足、營養不良、乳糖不耐受和/或食欲減退的兒童。它還可以在手術前或后施用。
口服營養增補劑還可以具有在1.4-1.5kcal/ml范圍中的卡路里密度、在 380-400m0sm/kg水范圍中的重量摩爾滲透壓濃度，以及占組合物約11_12%卡路里的蛋白質來源、占組合物約43-45%卡路里的碳水化合物來源、和占組合物約44-46%卡路里的脂質來源。
此組合物可以含有例如水、糖、麥芽糖糊精、酪蛋白鈉(乳)、高油酸向日葵油、大豆油、中鏈甘油三酯、乳清蛋白濃縮物、酪蛋白鈣。
此組合物是良好平衡的`且支持健康生長。它可以施用于具有特殊健康需要的兒童，患有生長發育遲滯、谷蛋白不耐受、經口攝入不足、營養不良、便秘、腹瀉、兒科液體限制 (pediatric fluid restrictions)、乳糖不耐受、非故意的體重減輕和/或食欲減退的兒童。它還可以在手術，特別是口腔手術，之前或之后施用。
本發明的口服營養增補劑可以另外含有纖維。纖維含量可以至少部分是可溶性纖維。優選的是可溶性和不溶性纖維的組合。纖維可以包含大豆纖維。
此外，脂肪酸組合物可以根據兒童的需要進行調整。可以使用抗炎脂肪酸。例如， 本發明的口服營養增補劑可以包含具有在6:1-8:1范圍中的n6:n3脂肪酸比率的脂質來源。
MCT (中鏈甘油三酯)LCT (長鏈甘油三酯)比率可以在12:88至8:92范圍中。
本發明的口服營養增補劑可以包含約70-73%游離水。游離水是滿足最低限度液體需求所必需的。一般地，具有不充足的營養攝取的兒童常常也飲水不夠。依照本發明的口服營養增補劑可以包含選自來自乳的酪蛋白鈉和鈣、乳清蛋白濃縮物或其組合的蛋白質來源。蛋白質來源可以根據兒童的需要進行調整。一般地，本發明的營養增補劑可以具有在190:1-210:1范圍中的NPC:N比率。非蛋白質kcal與氮的比率(NPC:N)通過計算每天供應的氮克數(lg N=6. 25g蛋白質)并用總的非蛋白質kcal除以氮克數進行計算。一般地，具有在80:1范圍中的冊(”比率的營養增補劑用于最嚴重應激的患者，在100:1范圍中的NPC:N比率用于嚴重應激的患者，而在150:1范圍中的NPC:N比率用于非應激的患者。兒童一般不需要富蛋白質的食品，因此優選高的NPC:N比率。本發明的口服營養增補劑可以部分包含或僅包含非復制性益生微生物。本發明人驚訝地發現，例如就免疫加強效應而言和/或就抗炎效應而言，非復制益生微生物甚至可以比復制性益生微生物更有效。這是令人驚訝的，因為益生菌常被定義為“當以足夠量施用時，對宿主賦予健康益處的活微生物”(FA0/WH0指南)。絕大多數的出版文獻涉及活益生菌。此外，有幾項研究調查了由非復制性細菌遞送的健康益處，并且其中大多數指出，益生菌的滅活(例如通過熱處理)會導致據稱的益生菌的健康益處的喪失(Rachmilewitz, D.等人，2004, Gastroenterologyl26:520-528 ；Castagliuolo 等人，2005, FEMS Immunol. Med.Microbiol. 43:197-204 ；Gill, H. S.和 K. J. Rutherfurd, 2001, Br. J. Nutr. 86: 285-289 ；Kaila，M.等人，1995，Arch. Dis. Child 72:51-53·)。某些研究顯示被殺死的益生菌可以保留某些健康作用(Rachmilewitz, D.等人，2004, Gastroenterology 126:520-528 ；Gill,H. S.和 K. J. Rutherfurd, 2001，Br. J. Nutr. 86:285-289)，但明顯地，活益生菌迄今為止在本領域中被公認為更有 效。根據本發明的口服營養增補劑可以包含任何有效量的益生微生物，例如相應于約
106-1012cfu/g干重的量。益生微生物可以是非復制性益生微生物。“非復制”益生微生物包括已經熱處理的益生細菌。這包括滅活的、死的、無生活力的和/或作為碎片例如DNA、代謝物、細胞質化合物和/或細胞壁物質存在的微生物。“非復制”意指通過經典鋪平板方法無法檢測到活細胞和/或菌落形成單位。經典鋪平板方法在微生物學教科書中有概述James Monroe Jay, Martin J. Loessner, DavidA. Golden. 2005. Modern food microbiology.第7版，Springer Science,New York,N. Y.第790頁。一般地，活細胞的不存在可以如下顯示在用不同濃度的細菌制劑(‘非復制’樣品)接種和在合適條件下孵育(有氧和/或缺氧大氣，至少24小時)后，在瓊脂平板上無可見菌落或在液體生長培養基中無增加的濁度。為了本發明的目的，益生菌定義為“對宿主的健康(health)或康健(well-being)具有有利作用的微生物細胞制品或微生物細胞組分”。(Salminen S, Ouwehand A. BennoY.等人“Probiotics :how should they be defined”Trends Food Sc1. Technol. 1999:10
107-10)。使用非復制益生微生物的可行性提供了幾個優點。在嚴重免疫受損兒童中，活益生菌的使用可能因發展菌血癥的潛在危險而在異常的情況下受限制。非復制益生菌可以使用而無任何問題。
此外，非復制益生微生物的提供允許熱重構同時保留健康益處。
本發明的組合物包含足以至少部分地產生健康益處的量的益生微生物和/或非復制益生微生物。足以完成這點的量定義為“治療有效劑量”。對于這個目的有效的量將取決于本領域技術人員已知的許多因素，例如兒童的重量和一般健康狀態，以及食物基質的影響。
在預防應用中，根據本發明的組合物施用于對病癥敏感或有罹患病癥危險的消費者，其施用量足以至少部分地降低發展該病癥的危險。此量定義為“預防有效劑量”。再次， 精確量取決于許多因素例如兒童的健康狀態和重量，以及食物基質的影響。
本領域技術人員將能夠適當地調整治療有效劑量和/或預防有效劑量。
一般而言，本發明的組合物含有治療有效劑量和/或預防有效劑量的益生微生物和/或非復制益生微生物。
一般地，治療有效劑量和/或預防有效劑量在約0，005mg-1000mg益生微生物和/ 或非復制益生微生物/日劑量的范圍內。
就數值量而言，“短時間高溫”處理的非復制微生物可以以對應于等價的104-1012cfu/g干組合物的量存在于組合物中。明顯地，非復制微生物不形成菌落，因此，這個術語應理解為得自104-1012cfu/g復制細菌的非復制微生物量。這包括滅活的、無生活力的或死的、或作為碎片例如DNA或細胞壁或細胞質化合物存在的微生物。換言之，組合物含有的微生物的數量以該數量的微生物的菌落形成能力(cfu)來表達，就如同所有微生物是活的一樣，而不管它們事實上是否是非復制性的，例如滅活的或死的、成碎片的、或是這些狀態的任何或所有的混合物。
優選地，非復制微生物以等價于104-109cfu/g干組合物的量，更加優選以等價于105-109cfu/g干組合物的量存在。
益生菌可以通過本領域已知的任何方法而成為非復制的。
目前可用于使益生菌菌株成為非復制性的技術通常有熱處理、Y-輻射、UV光或化學試劑(福爾馬林、多聚甲醛)的使用。
優選使用在食品工業的工業化環境下相對易于應用的技術來使益生菌成為非復制性的。
目前上市的含有益生菌的大多數產品是在其生產過程中被熱處理過的。因此，有利的是，能夠連同所生產的產品一起或至少以相似方式熱處理益生菌，同時益生菌保留或改善其對于消費者的有利特性或甚至獲得新的有利特性。
然而，益生微生物通過熱處理的滅活在文獻中一般與益生活性的至少部分喪失相關。
本發明人目前已驚訝 地發現，致使益生微生物非復制(例如通過熱處理)，并不導致益生菌健康益處的喪失，而是——相反地——可以增強已有的健康益處且甚至生成新的健康益處。
因此，本發明的一個實施方案是口服營養增補劑，其中非復制益生微生物通過熱處理而成為非復制性的。
此熱處理可以在至少71. 5°C執行至少I秒。可以使用長期熱處理或短期熱處理。在工業規模中，目前通常的短期熱處理例如UHT樣熱處理是優選的。這類熱處理減少細菌載量，并且減少加工時間，從而減少對營養物的破壞。本發明人首次證實，高溫短時間熱處理的益生微生物，無論其初始性質如何，均顯示出抗炎免疫譜/性質。特別地，通過該熱處理，可以發展新的抗炎譜/性質，或增強已有的抗炎譜/性質。因此，目前可以通過使用對應于一般工業上適用的熱處理的特定熱處理參數，生成具有抗炎免疫性質的非復制益生微生物，即使活的對應微生物不是抗炎菌株。因此，例如，熱處理可以是在約71. 5_150°C高溫處理約1_120秒。高溫處理可以是高溫/短時間(HTST)處理或超高溫(UHT)處理。可以對益生微生物實施在約71. 5_150°C約1_120秒的短期高溫處理。更優選可以對微生物實施在約90_140°C，例如90_120°C，約1_30秒的短期高溫處
理。 這種高溫處理致使微生物至少部分地非復制。高溫處理可以在正常大氣壓下執行，但也可以在高壓下執行。一般壓力范圍是1-50巴，優選1-10巴，更加優選2-5巴。明顯地，優選的是，當應用熱時，在液體或固體的培養基中對益生菌進行熱處理。待應用的理想壓力因此將取決于提供微生物時微生物所在的組合物的性質和使用的溫度。高溫處理可以在約71. 5_150°C、優選約90_120°C、更加優選約120_140°C的溫度范圍中執行。高溫處理可以執行約1-120秒、優選約1-30秒、更加優選約5_15秒的短時間。該給定的時幀是指對益生微生物施加該給定溫度的時間。注意，取決于提供微生物的組合物的性質和量且取決于使用的加熱器的構造，熱應用時間可以不同。然而，一般地，本發明的組合物和/或微生物通過高溫短時間(HTST)處理、巴氏瞬間滅菌(flash pasteurization)、或超高溫(UHT)處理來進行處理。UHT處理是通過將組合物在超過135°C (275 °F)的溫度(這是殺死奶中的細菌孢子所需的溫度)加熱約1-10秒的短時間，涉及至少部分地滅菌組合物的超高溫加工或超熱處理(兩者均縮寫為UHT)。例如，使用超過135°c的溫度以這種方式加工奶，允許在該必要的保持時間(至2-5秒)中細菌載量的減少，從而使得連續流操作成為可能。存在2種主要類型的UHT系統直接和間接系統。在直接系統中，通過蒸汽注射或蒸汽輸注，處理產品；而在間接系統中，使用板式換熱器、管式換熱器或刮面式換熱器來熱處理產品。UHT系統的組合可以在產品制備過程中的任何步驟或多個步驟應用。HTST處理定義如下(高溫/短時間):設計以達到奶中活微生物數目的5-log減少，即，殺死99，9999%的活微生物，的巴氏滅菌方法。這被認為足以破壞幾乎所有酵母、霉菌和常見腐敗細菌，并且還確保對常見致病性耐熱生物產生足夠破壞。在HTST過程中，將奶加熱至 71.7°C (161 °F) 15-20 秒。巴氏瞬間滅菌法是易腐飲料如果汁和蔬菜汁、啤酒和乳制品的熱巴氏滅菌方法。它在填充到容器內之前完成，以便殺死腐敗微生物，使得產品更安全且延長其貨架期。液體以受控的連續流進行移動，同時被施加于71. 50C (160 °F)-740C ( 165 0F)的溫度約15-30秒。為了本發明的目的，術語“短時間高溫處理”應包括例如高溫短時間(HTST)處理、UHT處理和巴氏瞬間滅菌。因為此熱處理提供了具有改善的抗炎性質的非復制益生菌，所以本發明的口服營養增補劑可以用于炎性病癥的預防或治療中。可以通過本發明的組合物治療或預防的炎性病癥并無特別的限制。例如，它們可以選自急性炎癥例如敗血癥；燒傷；和慢性炎癥例如炎性腸病，例如Crohn氏病、潰瘍性結腸炎、隱窩炎(pouchitis);壞死性小腸結腸炎；皮膚炎癥例如UV或化學品誘導的皮膚炎癥、濕疹、反應性皮膚(reactive skin);腸激惹綜合征；眼炎癥；變態反應、哮喘；及其組
八
口 ο如果長期熱處理用于致使益生微生物非復制，那么此熱處理可以在約70_150°C的溫度范圍中執行約3分鐘-2小時，優選在約80-140°C的范圍中約5分鐘-40分鐘。雖然現有技術一般教導，就 發揮其益生特性而言，通過長期熱處理致使非復制的細菌通常比活細胞效力低，但本發明人能夠證實與其活性對應物比較，熱處理的益生菌在刺激免疫系統方面更佳。本發明還涉及包含益生微生物的口服營養增補劑，所述益生微生物通過在至少約70°C熱處理至少約3分鐘而已經是非復制性的。非復制益生菌的免疫增強效應通過體外免疫譜分析而得到證實。所用的體外模型使用來自人外周血單核細胞(PBMCs)的細胞因子譜分析，該模型在本領域中被公認為是用于測試免疫調節化合物的標準模型(Schultz等人,2003, Journal of Dairy Research70,165-173 ;Taylor 等人，2006, Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235 ；Kekkonen 等人，2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203)。該體外PBMC分析法已被幾個作者/研究組用于例如根據益生菌的免疫譜，即其抗炎或促炎特征，來分類益生菌(Kekkonen等人，2008, World Journalof Gastroenterology, 14,1192-1203)。例如，該分析法已顯示允許預測益生菌候選物在腸道結腸炎小鼠模型中的抗炎效應(Foligne，B.等人，2007，WorldJ. Gastroenterol. 13:236-243)。此外，該分析法被常規用作臨床試驗中的讀出手段，并且已經被證實導致與臨床結果相一致的結果(Schultz等人,2003, Journal of DairyResearch 70,165-173 ;Taylor 等人,2006, Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235)。變態反應疾病在過去數十年一直在穩步地增加，目前被WHO視為流行病。一般地，變態反應被認為起因于免疫系統的Thl和Th2應答之間的失衡，導致強烈地偏向Th2介質的產生。因此，通過恢復免疫系統的Thl和Th2臂之間的合適平衡，可以減輕、下調或防止變態反應。這提示減少Th2應答或增強(至少瞬時地)Thl應答的必要性。后者將是免疫加強應答的特征，通常伴隨例如更高水平的IFN Y、TNF-α和IL-12。(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203 ；ViljanenM.等人，2005, Allergy,60,494-500)因此,本發明的口服營養增補劑允許治療或預防與受損的(compromised)免疫防御有關的病癥。相應地，可以通過本發明的組合物治療或預防的與受損的免疫防御有關的病癥并無特別的限制。例如，它們可以選自感染，特別是細菌、病毒、真菌和/或寄生物感染；吞噬細胞缺陷；低至嚴重的免疫抑制水平，例如由應激或免疫抑制藥物、化療或放療誘導的那些 ’天然的低免疫活性的免疫系統狀態，例如新生兒的免疫系統；變態反應；及其組合。本發明中所述的口服營養增補劑還允許增強兒童對疫苗特別是口服疫苗的應答。任何量的非復制微生物都是有效的。然而，通常優選至少90%、優選至少95%、更優選至少98%、最優選至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地所有的益生菌是非復制的。在本發明的一個實施方案中，所有的微生物是非復制的。因此，在本發明的口服營養增補劑中，至少90%、優選至少95%、更優選至少98%、最優選至少99%、理想地至少99. 9%、最理想所有的益生菌可以是非復制的。所有的益生微生物都可以用于本發明的目的。例如，益生微生物可以選自雙歧桿菌屬(bifidobacteria)、乳桿菌屬(Iactobacilli)、丙酸桿菌屬(propionibacteria)或其組合，例如長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、雙乙酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、大腸桿菌(Escherichia coli)和 / 或其混合物。本發明的口服營養增補劑可以例如包含益生微生物，所述的益生微生物選自長雙歧桿菌NCC 3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、約氏乳桿菌LaU副干酪乳桿菌NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007、羅伊氏乳桿菌DSM17983、羅伊氏乳桿菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、干酪乳桿菌NCC4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌ACA-DC 6002 (NCC1825)、大腸桿菌Nissle、保加利亞乳桿菌NCC 15、乳酸乳球菌NCC 2287或其組合。所有這些菌株或是在布達佩斯條約(Budapest treaty)下保藏和/或是可商購獲得的。在布達佩斯條約下保藏的菌株如下長雙歧桿菌 NCC 3001:ATCC BAA-999 長雙歧桿菌 ISX:C 2705:CNCM 1-2618
短雙歧桿菌ISCC 2950CNCM丨-3865
乳雙歧桿菌 ISX:C 2818:CNCM 1-3446
副千酪乳桿菌 IS1CC 2461:CNCM 1-2116 鼠李糖乳桿菌 NCC 4007:CGMCC 1.3724 嗜熱鏈球菌 NCC 2019:CNCM 1-1422
嗜熱鏈球菌 NCC 2059:CNCM1-4153 乳酸乳球菌 NCC 2287:CNCM1-4154 千酪乳桿菌 NCC 4006:CNCM1-1518
干酪乳桿菌 NCC 1825:ACA-DC 6002 嗜酸乳桿菌 NCC 3009:ATCC 700396
保加利亞乳桿菌NCC 15:CNCM -1198 約氏乳桿菌LalCNCM1-1225
羅伊氏乳桿菌DSM17983DSM17983
羅伊氏乳桿菌ATCC55730ATCC55730
大腸桿菌 Nissle 1917:DSM 6601本領域技術人員將理解它們可以自由地組合本文描述的所有本發明特征，而不脫離所公開的本發明的范圍。根據下列實施例和附圖，本發明的進一步的優點和特征是顯而易見的。附圖簡述

圖1A和B表示用“短時高溫”處理的益生菌的抗炎免疫譜的增強。圖2表示非抗炎的益生菌株在用“短時高溫”處理后變成抗炎的，即表現出顯著的體外抗炎免疫譜。圖3A和B表示商購可獲得的產品中使用的益生菌株在用“短時高溫”處理后體外表現出增強的或新的抗炎免疫譜。圖4A和B表不乳品起子菌株(diary starter strains)(即Lcl起子菌株)在高溫熱處理后體外表現出增強的或新的抗炎免疫譜。圖5表示非抗炎的益生菌株在用HTST處理后體外表現出抗炎免疫譜。圖6 :使用活的和熱處理(140°C，15秒)形式的益生菌株和乳品起子菌株產生的PBMC數據(IL-12p40、IFN-Y、TNF-a、IL-10)的主成分分析。每個點表示活的或熱處理的一種菌株(通過其NCC號或名稱標識)。圖7表示活的和熱處理(85°C，20分鐘)的菌株的IL-12p40/IL_10比例。總的來說，相比本發明的“短時高溫”處理，85°C熱處理20分鐘引起IL-12p40/IL-10比例的增加 (圖 1、2、3、4 和 5)。
圖8表示用熱處理細菌刺激的人PBMCs的體外細胞因子分泌的增加。
圖9表示在用鹽水攻擊(challenged)的OVA-致敏小鼠(陰性對照)、用OVA攻擊的OVA-致敏小鼠(陽性對照)和用OVA攻擊且用熱處理或活的短雙歧桿菌NCC2950處理的OVA-致敏小鼠中觀察到的腹瀉強度的百分數。結果以腹瀉強度百分數顯示(由4個獨立試驗計算出的平均值土SEM)，100%的腹瀉強度對應于陽性對照組(變應原致敏和攻擊) 發生的癥狀。實施例
實施例1:
方法學
細菌制劑
活的益生菌對宿主免疫系統的健康益處通常被認為是菌株特異性的。體外誘導高水平IL-10和/或誘導低水平促炎細胞因子的益生菌(PBMC分析法)已經顯示是有效的體內抗炎菌株(Foligne, B.等人，2007，World J. Gastroenterol. 13:236-243)。
使用數種益生菌株來研究熱處理的益生菌的抗炎特性。這些菌株是長雙歧桿菌 NCC 3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、副干酪乳桿菌NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007、干酪乳桿菌NCC 4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌ACA-DC 6002 (NCC 1825)和大腸桿菌Nissle。還測試了數種起子培養菌株，包括一些商業用于生產Nestl6Lcl發酵產品的菌株嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、保加利亞乳桿菌NCC 15和乳酸乳球菌NCC 2287。
細菌細胞是在5-15L生物反應器中在針對每種菌株優化的條件下培養的。所有的一般細菌生長培養基均是可用的。這類培養基是本領域技術人員已知的。當pH調至5. 5 時，連續加入30%堿溶液(NaOH或Ca (OH) 2)。當足夠時，通過用CO2氣體處理頂部空間來維持缺氧條件。大腸桿菌是在標準的需氧條件下培養的。
通過離心(5，000Xg，4°C )收集細菌細胞,并且重懸于足夠體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，以便達到終濃度約109-101Qcfu/mL。部分制劑用15%甘油凍存于_80°C。另一部分細胞通過以下進行熱處理
-超高溫140°C，15秒；通過間接蒸汽注射。
-高溫短時(HTST):74°C、90°C和120°C，15秒，通過間接蒸汽注射。
-水浴中的長時低溫(85°C,20分鐘)。
熱處理后，將樣品凍存于_80°C，直至使用。
細菌制劑的體外免疫譜分`析
評估活的和熱處理的細菌制劑的免疫譜(即體外誘導人血細胞分泌特定細胞因子的能力)。從血液過濾器分離人外周血單核細胞(PBMCs)。通過細胞密度梯度分離后， 收集單核細胞并且用Hank平衡鹽溶液洗滌兩次。然后將細胞重懸于補充有10%胎牛血清 (Bioconcept,巴黎，法國)、1%L_谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/鏈霉素(Sigma)和0. 1%慶大霉素(Sigma)的 Iscove 改良的 Dulbecco 培養基(IMDM, Sigma)中。然后將PBMCs (7X IO5個細胞/孔)與活的和熱處理的細菌(相當于7X IO6Cfu/孔)在48孔板中孵育36小時。活的和熱處理的細菌的作用是在來自8位單獨供體的PBMCs上測試的，分為兩個獨立試驗。孵育36小時后，將培養板冷凍并且保持在-20°C，直至細胞因子測量。細胞因子譜分析是在活的細菌和它們的熱處理的對應物中平行進行的(即在相同批次的PBMCs上在相同試驗中)。按照供應商的說明，通過ELISA (R&D DuoSet Human IL-10, BDOptEIA HumanIL12p40, BD OptEIA Human TNF α , BD OptEIA HumanIFN-γ )測定 36 小時孵育后細胞培養物上清液中細胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-α和IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40和TNF-α是促炎細胞因子，而IL-1O是有力的抗炎介質。結果是以4位單獨供體的平均值(pg/mL)+/-SEM表示的，并且是各用4位供體進行的兩個單獨試驗的代表。計算每個菌株的IL-12p40/IL-10的比值，作為體內抗炎作用的預測值(Folign6，B.等人，2007，WorldJ. Gastroenterol. 13:236-243)。將通過ELISA(參見上面)測定的每個菌株的細胞因子數值(pg/mL)轉移至BioNumerics v5. 10 軟件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium)中。對該組數據進行了主成分分析(PCA,維技術(dimensioning technique))。該分析包括減去特征值的平均值和除以特征值的方差(Subtraction of the averages over the characters anddivision by the variances over the characters were included in this analysis)。結果超高溫(UHT) /高溫短時(HTST)-樣處理產生的抗炎譜將在研的益生菌株進行一系列的熱處理(超高溫(UHT)、高溫短時(HTST)、和850C 20分鐘)，并且在體外將它們的免疫譜與活細胞的免疫譜進行比較。當與人PBMC(圖1、2、3、4和5)溫育時，活的微生物(益生菌和/或乳品起子培養物)誘導不同水平的細胞因子產生。這些微生物的 熱處理以溫度依賴方式改變了 PBMC產生的細胞因子的水平。“短時高溫”處理(120°C或140°C，15秒)產生具有抗炎免疫譜的非復制細菌(圖1、2、3和4)。事實上，UHT-樣處理的菌株(140°C，15秒)誘導了更少的促炎細胞因子(TNF-α、IFN-Y、IL-12p40)，而維持或誘導額外的IL-10產生(相比活的對應物)。相比活細胞，任何UHT-樣處理的菌株產生的IL-12p40/IL-10比例都更低(圖1、2、3和4)。對于以HTST-樣處理法處理的細菌，該觀察也是對的，所述的HTST-樣處理即120°C進行15秒(圖1、2、3和4)，或74°C和90°C進行15秒(圖5)。熱處理(UHT-樣或HTST-樣處理)對益生菌株(圖1、2、3和5)和乳品起子培養物(圖4)的體外免疫譜具有相似的影響。對活的和熱處理(140°C，15秒)的益生菌和乳品起子菌株產生的PBMC數據的主成分分析表明，活菌株均沿著X軸分布，說明菌株在體外展示出非常不同的免疫譜，促炎細胞因子的從低(左側)到高(右側)的誘導者。熱處理的菌株聚集在圖的左側，這表明熱處理的菌株誘導了少得多的促炎細胞因子(圖6)。通過比較，85°C熱處理20分鐘的細菌比活細胞誘導更多的促炎細胞因子和更少的IL-10，從而導致更高的IL-12p40/IL-10比例(圖7)。UHT-樣和HTST-樣處理增強或產生抗炎譜。UHT和HTST處理的菌株表現出抗炎譜，不管它們各自最初的免疫譜(活細胞)如何。已知具有體內抗炎并且體外表現出抗炎譜的益生菌株(長雙歧桿菌NCC 3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818)在“短時高溫”處理后表現出增強的體外抗炎譜。如圖1所示，UHT-樣處理的雙歧桿菌屬菌株的IL-12P40/IL-10比例低于活對應細菌的比例，從而表明UHT-樣處理的樣品的改善的抗炎特性。更引人注目地，在非抗炎性活菌株中也證實了通過UHT-樣和HTST-樣處理可以產生抗炎特性。活的鼠李糖乳桿菌NCC 4007和副干酪乳桿菌NCC 2461體外表現出高的IL-12p40/IL_10比例(圖2和5)。兩種活菌株顯示出不能防止小鼠中TNBS-誘導的結腸炎。在“短時高溫”處理(UHT或HTST)后鼠李糖乳桿菌NCC 4007和副干酪乳桿菌NCC 2461誘導的IL-12p40/IL_10比例急劇下降，達到與雙歧桿菌屬菌株獲得的同樣低的水平。這些低的IL-12p40/IL-10比例的原因是低水平的IL-12p40產生并且組合無變化(鼠李糖乳桿菌NCC 4007)或急劇誘導的IL-10分泌(副干酪乳桿菌NCC 2461)(圖2)。結果-UHT-樣和HTST-樣熱處理可以增強活微生物的抗炎譜/特性(例如長雙歧桿菌NCC 2705、長雙歧桿菌NCC 3001、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818)-UHT-樣和HTST-樣熱處理可以使非抗炎的活微生物產生抗炎譜/特性(例如，鼠李糖乳桿菌NCC 4007、副干酪乳桿菌NCC 2461、乳品起子嗜熱鏈球菌NCC 2019)-從可商購獲得的產品中分離的菌株(包括益生的大腸桿菌菌株)也證實了抗炎譜/特性(圖3A&B)。UHT/HTST-樣處理的影響對于所 有測試的益生菌和乳品起子是類似的，例如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和鏈球菌屬。UHT/HTST-樣處理已經應用于數種表現出不同體外免疫譜的乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌。UHT/HTST-樣處理后的所有菌株比它們的活對應菌株都誘導了更少的促炎細胞因子(圖1、2、3、4、5和6)，這證實了 UHT/HTST-樣處理對這些所得非復制細菌的免疫特性的影響可以概括至所有益生菌，特別是乳桿菌和雙歧桿菌以及特定的大腸桿菌菌株，和所有乳品起子培養物，特別是鏈球菌、乳球菌和乳桿菌。實施例2:方法學細菌制劑五種益生菌株用于研究非復制益生菌的免疫增強特性3種雙歧桿菌(長雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950)和2種乳桿菌(副干酪乳桿菌NCC2461,鼠李糖乳桿菌NCC4007)。細菌細胞生長在MRS上，于37°C分批發酵16-18小時，無pH控制。將細菌細胞旋轉沉降(5，000Xg，4°C )，并且重懸于磷酸鹽緩沖液中，之后在鹽水中稀釋以達到終濃度約10E10cfu/mLo將長雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、副干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007在85°C水浴中熱處理20分鐘。將短雙歧桿菌NCC2950在90°C水浴中熱處理30分鐘。將熱處理的細菌懸浮液等分并且凍存于_80°C直至使用。活細菌在PBS-甘油15%中存于-80°C直至使用。細菌制劑的體外免疫譜分析評估活的和熱處理的細菌制劑的免疫譜/特性(即，體外誘導人血細胞分泌特定細胞因子的能力)。從血液過濾器分離人外周血單核細胞(PBMCs)。通過細胞密度梯度分離后，收集單核細胞并且用Hank平衡鹽溶液洗漆兩次。然后將細胞重懸于補充有10%胎牛血清(Bioconcept,巴黎，法國)、1%L_谷氨酰胺(Sigma)、1%青霉素/鏈霉素(Sigma) 和O. 1%慶大霉素(Sigma)的Iscove改良的Dulbecco培養基(IMDM, Sigma)中。然后將 PBMCs (7 X IO5個細胞/孔)與活的和熱處理的細菌(相當于7 X IO6Cfu/孔)在48孔板中培養36小時。活的和熱處理的細菌的作用是在來自8位單獨供體的PBMCs上測試的，分為兩個獨立試驗。培養36小時后，將培養板冷凍并且保持在-20°C，直至細胞因子測量。細胞因子譜分析是在活的細菌和它們的熱處理對應細菌中平行進行的(即在相同批次PBMCs上在相同試驗中)。
按照供應商的說明，通過ELISA (R&D DuoSet Human IL-10, BDOptEIA Human IL12p40, BD OptEIA Human TNF, BD OptEIA HumanIFN-γ )測定培養 36 小時后細胞培養上清液中細胞因子(IFN-γ、IL-12p40、TNF-α 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40 和 TNF-α是促炎細胞因子，而IL-1O是有力的抗炎介質。結果是以4位單獨供體的平均值 (pg/mL) +/-SEM表示的，并且是各用4位供體進行的兩個單獨試驗的代表。
活的和熱處理的短雙歧桿菌NCC2950在防止變應性腹瀉中的體內作用
變應性腹瀉的小鼠模型用于測試短雙歧桿菌NCC2950的Thl促進作用(Brandt E. B等人.JCI 2003; 112 (II) :1666-1667)。致敏(以14天的間隔，于第O和14天，2次腹膜內注射卵白蛋白(OVA)和硫酸鋁鉀)后，將雄性Balb/c小鼠用OVA 口服攻擊6次(第27、 29、32、34、36、39天)，導致短暫的臨床癥狀(腹瀉)和免疫參數變化(總IgE、OVA特異性 IgE、小鼠肥大細胞蛋白酶I即MMCP-1的血漿濃度)。在OVA致敏前(第_3、-2、_1、0天和第11、12、13和14天)和攻擊期內(第23至39天)將活的或90°C熱處理30分鐘的短雙歧桿菌NCC2950通過管飼法施用4天。使用每日細菌劑量約IO9菌落形成單位(cfu)或等價的cfu/小鼠。
結果
熱處理后對“促炎”細胞因子分泌的誘導
體外評估了熱處理的細菌菌株刺激人外周血單核細胞(PBMCs)分泌細胞因子的能力。將熱處理的細菌刺激PBMCs后基于四種細胞因子的免疫譜與在相同的體外分析試驗中由活細菌細胞誘導的免疫譜進行比較。
將熱處理的制劑鋪板并且評估不存在任何存活的細菌計數。熱處理的細菌制劑鋪板后不產生菌落。
當與人PBMCs溫育時，活的益生菌誘導了不同且菌株依賴性水平的細胞因子產生(圖8)。益生菌的熱處理，與它們的活對應細菌比較，改變了 PBMCs產生的細胞因子的水平。熱處理的細菌比它們的活對應細菌誘導了更多的促炎細胞因子(TNF-α、IFN-Y、 IL-12p40)。通過比較，熱處理的細菌比活細胞誘導了相似或更低量的IL-10。這些數據表明熱處理的細菌比它們的活對應細菌更能刺激免疫系統，并且因此更能加強減弱的免疫防御。換言之，體外數據說明了熱處理后細菌菌株的增強的免疫加強作用。
為了說明熱處理的短雙歧桿菌NCC2950對免疫系統的增強作用(相比活細胞)，在變應性腹瀉的動物模型中測試了活的和熱處理的短雙歧桿菌NC`C2950 (菌株A)。
相比陽性對照組，用熱處理的短雙歧桿菌NCC2950處理后腹瀉強度顯著且一致地下降(41. 1%±4. 8)，而用活的短雙歧桿菌NCC2950處理后腹瀉強度僅降低20±28. 3%。這些結果證實，熱處理的短雙歧桿菌NCC2950比其活的對應細菌表現出對變應性腹瀉的增強的保護作用。結果顯示，熱處理后提高了益生菌增強免疫防御的能力。實施例3-6:可以制備下列組合物水、糖、麥芽糖糊精、酪蛋白鈉(奶)、高油酸向日葵油、大豆油、中鏈甘油三酯、乳清蛋白濃縮物、酪蛋白鈣(A)水、麥芽糖糊精、大豆油、酪蛋白鈉(來自奶)、糖、高油酸向日葵油、乳清蛋白濃縮物、部分水解的瓜爾膠、中鏈甘油三酯、酪蛋白鈣(C)
權利要求
1.施用于兒童的口服營養增補劑，其具有在0.9-1.6kcal/ml范圍中的卡路里密度、在 380-420m0sm/kg水范圍中的重量摩爾滲透壓濃度，且包含占組合物約10-13%卡路里的蛋白質來源、占組合物約43-55%卡路里的碳水化合物來源、占組合物約33-46%卡路里的脂質來源和益生微生物。
2.依照權利要求1的口服營養增補劑，其包含具有6 I至8 I的n6 n3脂肪酸比率、和/或12 88至8 92的MCT LCT比率的脂質來源。
3.依照前述權利要求中任一項的口服營養增補劑，其包含約70-73%游離水。
4.依照前述權利要求中任一項的口服營養增補劑，其中所述蛋白質來源選自來自奶的酪蛋白鈉和鈣、乳清蛋白濃縮物或其組合，且具有190 I至200 I的NPC N比率。
5.依照前述權利要求中任一項的口服營養增補劑，其中所述益生微生物包含非復制益生微生物。
6.依照前述權利要求中任一項的口服營養增補劑，其包含對應于約IO6-1O12Cfu的量的益生微生物。
7.依照前述權利要求5-6中任一項的口服營養增補劑，其中所述非復制益生微生物是通過熱處理，優選通過在至少71. 5°C高溫處理至少I秒，而已經成為非復制的。
8.依照權利要求7的口服營養增補劑，其中所述熱處理是在約71.5-150°C高溫處理約 1-120秒，并且優選是高溫/短時間(HTST)處理或超高溫(UHT)處理。
9.依照權利要求8的口服營養增補劑用于在炎性病癥的預防或治療中使用。
10.依照權利要求7的口服營養增補劑，其中所述熱處理在約70-150°C的溫度范圍中執行約3分鐘-2小時，優選在約80-140°C的范圍中約5分鐘-40分鐘。
11.依照權利要求10的口服營養增補劑用于在預防或治療與受損的免疫防御有關的病癥中使用。
12.依照前述權利要求中任一項的口服營養增補劑，其中至少90%、優選至少95%、更優選至少98%、最優選至少99%、理想地至少99. 9%、最理想地所有的益生菌是非復制的。
13.依照前述權利要求中任一項的口服營養增補劑，其中所述益生微生物選自雙歧桿菌、乳桿菌、丙酸桿菌或其組合，例如長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、短雙歧桿菌、 嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、唾液乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、約氏乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、 乳酸乳球菌、雙乙酰乳球菌、乳脂乳球菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、德氏乳桿菌、大腸桿菌、和/或其混合物。
14.依照前述權利要求中任一項的口服營養增補劑，其中所述益生微生物選自長雙歧桿菌NCC 3001、長雙歧桿菌NCC 2705、短雙歧桿菌NCC 2950、乳雙歧桿菌NCC 2818、約氏乳桿菌LaU副干酪乳桿菌NCC 2461、鼠李糖乳桿菌NCC 4007、羅伊氏乳桿菌DSM17983、 羅伊氏乳桿菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC 2019、嗜熱鏈球菌NCC 2059、干酪乳桿菌NCC 4006、嗜酸乳桿菌NCC 3009、干酪乳桿菌ACA-DC6002(NCC 1825)、大腸桿菌Nissle、保加利亞乳桿菌NCC 15、乳酸乳球菌NCC 2287、或其組合。
15.依照前述權利要求中任一項的口服營養增補劑，其含有約0，005mg-1000mg非復制微生物/日劑量。
全文摘要
本發明涉及兒童營養領域。具體地，本發明涉及口服增補劑領域。本發明的一個實施方案涉及口服增補劑領域，所述口服增補劑包含益生菌和/或生物學活性非復制益生菌，例如熱處理的益生菌。
文檔編號A23L1/29GK103052395SQ201080031167
公開日2013年4月17日 申請日期2010年5月11日 優先權日2009年5月11日
發明者A·梅賽尼爾, S·努特恩, G·普里烏特 申請人:雀巢產品技術援助有限公司