用于細胞治療的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用于細胞治療的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于提供細胞治療的方法、及其治療應用。
背景技術：
高等脊椎動物中的免疫系統代表了抵抗能夠進入脊椎動物身體的各種抗原、包括作為各種疾病的病原體的微生物例如細菌、真菌和病毒在內的第一道防線。此外，免疫系統還參與各種其他疾病或障礙，包括自身免疫或免疫病理疾病、免疫缺陷綜合征、動脈粥樣硬化和各種腫瘤疾病。盡管存在可用于治療這些疾病的方法，但許多現有療法不能提供足夠的結果。在新出現的治療策略中，基于細胞治療的策略似乎構成了用于治療大量疾病的潛在有用的工具。因此，為了實現所述目的，研究人員目前正在進行大量努力，自身免疫疾病當為身體抵御細菌、病毒和任何其他外來產物的身體的免疫系統機能障礙并產生針對健康組織、細胞和器官的病理性應答時，引起自身免疫疾病。抗體、T細胞和巨噬細胞提供有益保護作用，但是也能產生有害或致死的免疫應答。自身免疫疾病可以是器官特異性或系統性的，并由不同的致病機制引起。器官特異性自身免疫的特征為主要組織相容性復合物(MHC)抗原的異常表達、抗原模擬和MHC基因中的等位基因變異。系統性自身免疫疾病涉及多克隆B細胞的活化和免疫調節T細胞、T 細胞受體和MHC基因的異常。器官特異性自身免疫疾病的實例是糖尿病、甲狀腺機能亢進、 自身免疫性腎上腺功能不全、純紅細胞性貧血、多發性硬化癥和風濕性心臟炎。代表性的系統性自身免疫疾病是系統性紅斑狼瘡、慢性炎癥、舍格倫綜合征、多肌炎、皮肌炎和硬皮病。目前的自身免疫疾病治療包括給藥免疫抑制劑例如可的松、阿司匹林衍生物、羥氯喹、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤和環磷酰胺或其組合。然而，當給藥免疫抑制劑時所面對的困境是，自身免疫疾病的治療越有效，患者剩余的對感染攻擊的抵御力越低，并且對發生腫瘤的易感性也更高。因此，對用于治療自身免疫疾病的新療法存在著極大需求。炎性障礙炎癥是身體的白細胞和分泌的因子保護我們的身體以對抗外來物質例如細菌和病毒的感染的過程。分泌的被稱為細胞因子和前列腺素的因子控制這一過程，并以有序和自限的級聯方式釋放到血液或受影響組織中。炎性腸病(IBD)IBD是一類慢性、特發性、復發性和組織破壞性疾病，其特征為黏膜T細胞機能障礙、細胞因子生產改變和細胞炎性，最終引起遠端小腸和結腸黏膜的損傷。IBD在臨床上細分成兩種表型克隆病(CD)和潰瘍性結腸炎。CD是發病率為0. 05%、目前不可治愈的自身免疫疾病，其導致慢性炎癥，引起各種胃腸和腸外癥狀，包括腹痛、直腸出血、腹瀉、體重減輕、皮膚和眼的障礙以及兒童生長和性成熟延遲。這些癥狀可以極大影響患者的健康、生活質量和功能能力。因為CD是慢性病，并且典型在30歲以前發作，因此患者一般需要終生治療。盡管它的病因仍然未知，但存在間接證據將CD與黏膜免疫系統不能減弱針對內源抗原的免疫應答相聯系。目前用于⑶的治療藥劑包括氨基水楊酸鹽、皮質類固醇、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、 抗生素和氨甲蝶呤，不是完全有效的，是非特異性的并具有多種不利副作用。在大多數病例中，外科切除是最終可選方案。因此，目前的治療策略是發現特異性調節疾病的兩種要素、 即炎性和T-細胞驅動的應答的藥物或藥劑。最近，藥物英利昔單抗已被批準用于對標準療法無響應的中度到重度克隆病的治療以及開放引流瘺管的治療。英利昔單抗，第一種獲批的特異性用于克隆病的治療，是一種抗腫瘤壞死因子(TNF)抗體。TNF是由免疫系統產生的、可以引起與克隆病相關的炎癥的蛋白。抗TNF抗體在TNF達到腸之前將其從血流中移除，從而阻止炎癥。然而，因為它具有系統性效應，并且TNF是非常多效的因子，因此嚴重副作用相對常見，并且其長期安全性仍有待確定。此外，因為在患者中發生的許多炎性過程不依賴于TNF信號傳導，因此效能也是有限的。類風濕性關節炎(RA)類風濕性關節炎和青少年類風濕性關節炎是炎性關節炎類型。關節炎是描述關節中的炎癥的通用術語。一些、但不是所有關節炎類型是炎性誤導的結果。類風濕性關節炎影響世界人口的約1%。并且實質上是致殘的。類風濕性關節炎是一種自身免疫障礙，其中身體的免疫系統將關節中分泌潤滑液的滑膜不合適地識別為外來物。炎癥發生，并且關節內和附近的軟骨和組織受到損傷或破壞。身體用瘢痕組織替換受損組織，導致關節內的正常空間變窄，骨骼融合在一起。在類風濕性關節炎中，存在著持久性抗原呈遞、T-細胞刺激、細胞因子分泌、滑膜細胞活化和關節破壞的自身免疫循環。目前的關節炎療法集中于使用抗炎或免疫抑制藥物減輕關節的炎癥。任何關節炎的第一線治療通常是消炎藥，例如阿司匹林、布洛芬和Cox-2抑制劑例如塞來昔布和羅非昔布。抗TNF人源化單克隆抗體例如英利昔單抗也可以使用，但是它具有許多次級效應或副作用，并且其效能相當低。“第二線藥物”包括金、氨甲蝶呤和留族化合物。盡管這些是沿用已久的關節炎療法，但極少有患者在單獨進行這些治療后復原，對于患有類風濕性關節炎的患者來說，仍然存在著治療困難的問題。總的來說，目前用于慢性炎性障礙的治療方法具有非常有限的效率，并且它們中的許多具有副反應的高發生率或不能完全阻止疾病進展。到目前為止，沒有一種療法是理想的，并且這些類型的疾病無法治愈。因此，對用于治療炎性障礙的新療法存在極大需求。發明概述本發明提供了用于對需要的患者進行細胞治療的改進方法。本發明的其他方面提供了在淋巴內遞送的細胞治療中使用的試劑盒和組合物。一方面，描述了在具有受損組織和/或具有與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀的對象中，用于治療或修復受損組織、和/或用于治療、減輕、預防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀的方法，所述方法包含向所述對象的淋巴系統給藥預防或治療有效量的包含干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞的組合物。在一個實施方案中，本發明提供了在個體中預防、治療或改善免疫和/或炎性疾病的方法，所述方法包含將細胞治療直接遞送到淋巴器官。在本發明的一個實施方案中，細胞治療與抗原組合遞送。另一方面，描述了干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞，其使用在下述方法中i.治療或修復受損組織；和/或 治療、減輕、改善和/或預防與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀；其中細胞被給予到淋巴系統。另一方面，描述了試劑盒，所述試劑盒包含i)包含干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞群體的藥物，以及ii)用于所描述的在需要治療的對象中治療或修復受損組織和/或用于治療、減輕、預防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀的方法的使用說明書，所述方法包含向所述對象的淋巴系統給藥預防或治療有效量的包含干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞的組合物。另一方面，描述了干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞在制造藥物中的應用， 所述藥物用于治療或修復受損組織和/或用于治療、減輕、預防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀，所述應用包含將干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞給予到淋巴系統中。另一方面涉及用于給予到淋巴系統的干細胞、調節性T-細胞或成纖維細胞。另一方面涉及所述細胞在治療中的應用。另一方面涉及用于給予到淋巴系統的組合物，其包含干細胞、調節性T-細胞和/ 或成纖維細胞以及抗原。從公開內容和權利要求書，其他方面、特點和優點將更充分地顯現。定義為了便于理解本說明書，下面將解釋一些術語和表述在本發明的情形中的意義。 如果需要，其他定義將包含在整個說明書中。根據本發明，術語“適用于淋巴內注射”或“適用于淋巴結內注射”或“適用于直接注射到腋窩淋巴節和/或腹股溝淋巴節中”，是指適用于淋巴內或淋巴結內注射的細胞治療，優選包含免疫調節細胞、更優選包含干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞以及包含它們的藥物和藥物組合物，具有對于將其作為醫學治療注射到個體、特別是人類、更優選為人類患者的淋巴組織中，在需要所述治療的對象中用于治療或修復受損組織(優選為間充質組織)和/或用于治療、減輕、預防和/或改善炎性和/或免疫障礙的一種或多種癥狀來說必需或有益的物理、化學、生物或其他特征。此外，根據本發明，“適用于淋巴內注射”或 “適用于淋巴結內注射”的免疫調節細胞以及包含它們的藥物和藥物組合物，其包含的組合物所有組成成分的濃度允許在適合的體積中將適量的所有組成成分施加到淋巴組織中，所述體積優選為最多0. OlmL、優選最多0. 05mL、優選最多0. lmL、優選最多0. 2mL、優選最多 0. 3mL、優選最多0. 4mL、優選最多0. 6mL、優選最多0. 8mL、優選最多1. OmL、優選最多2mL的體積。此外，“適用于淋巴內或淋巴結內注射”的組合物應該不含或僅含有限量的如果以過大的量使用將可能損傷淋巴組織的潛在有害物質，例如溶劑和佐劑。淋巴組織的損傷是指由于對細胞的毒性效應、由于細胞的化學破壞引起的直接損傷，以及例如通過誘導炎性反應、壞死等而引起的對細胞的間接損傷。此外，根據本發明，理想情況下“適用于淋巴內或淋巴結內注射”的組合物具有某些類型的安全機制，以防在注射錯過淋巴組織的情況下意外地、系統性地施用免疫調節細胞以及包含它們的藥物和藥物組合物，以及在最糟情況下導致將免疫調節細胞以及包含它們的藥物和藥物組合物直接注射到血液循環中。這樣的安全機制包括生物活性物質的短的細胞外半衰期。當在本文中使用時，術語“注射”以其在本技術領域中的通常意義使用，是指通過刺穿身體的部分、通常為皮膚而將藥劑遞送至身體。該術語包括使用中空注射器和高壓噴射注射裝置。當在本文中使用時，術語“同種異體的”將取其來自于同一物種的不同個體的意義。當在一個或多個基因座處的基因不一致時，兩個或更多個個體被稱為彼此是同種異體的。當在本文中使用時，術語“自體的”將取其來自于同一個體的意義。術語“免疫疾病”是指對象中以由對象的免疫反應所引起的細胞、組織和/或器官損傷為特征的病癥。術語“自身免疫疾病”是指對象中和以由對象對自身細胞、組織和/或器官的免疫反應所引起的細胞、組織和/或器官損傷為特征的病癥。可以使用本發明的免疫調節細胞治療的自身免疫疾病的說明性的非限制性實例包括斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森病、腎上腺的自身免疫疾病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、自身免疫性血小板減少癥、貝切特病、大皰性類天皰瘡、心肌病、乳糜瀉-皮炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(CFlDS)、慢性炎性脫髓鞘性多發性神經病、丘-斯綜合征、瘢痕性類天皰瘡、CREST綜合征、冷血凝素病、盤狀紅斑狼瘡、原發性混合型冷球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、腎小球腎炎、突眼性甲狀腺腫、吉-巴綜合征、橋本病、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA神經病、幼年型關節炎、 扁平苔癬、美尼爾氏病、混合型結締組織病、多發性硬化癥、I型或免疫介導的糖尿病、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多內分泌腺綜合征、風濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血癥、原發性膽汁性肝硬變、銀屑病、銀屑病關節炎、雷諾現象、賴特綜合征、肉樣瘤病、硬皮病、進行性系統性硬化癥、舍格倫綜合征、肺出血-腎炎綜合征、僵人綜合征、系統性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、多發性大動脈炎、顳動脈炎/ 巨細胞動脈炎、潰瘍性結腸炎、眼色素層炎、血管炎例如皰疹樣皮炎、脈管炎、白癜風、韋格納肉芽腫、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂綜合征、神經系統的自身免疫疾病、家族性地中海熱、朗伯-伊頓肌無力綜合征、交感性眼炎、多內分泌腺疾病、銀屑病等。術語“免疫介導的炎性疾病”是指以慢性或急性炎癥為特征，由正常免疫應答的調節異常引起、與其相關或由其觸發的任何疾病，例如克羅恩病、1型糖尿病、類風濕性關節炎、炎性腸病、銀屑病、銀屑病關節炎、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、橋本病、移植物抗宿主疾病、舍格倫綜合征、惡性貧血、阿狄森病、硬皮病、肺出血-腎炎綜合征、潰瘍性結腸炎、 自身免疫性溶血性貧血、不育癥、重癥肌無力、多發性硬化癥、突眼性甲狀腺腫、血小板減少性紫癜、吉-巴綜合征、過敏癥、哮喘、特應性疾病、動脈硬化、心肌炎、心肌病、腎小球性腎炎、再生不良性貧血和器官移植后的排斥。“乳糜瀉”也稱為腹腔疾病、口炎性腹瀉、非熱帶脂肪瀉，地方性口炎性腹瀉、谷蛋白腸病或谷蛋白敏感性腸病和谷蛋白不耐受。出于本文描述的發明的目的，“免疫障礙”包括自身免疫疾病和免疫介導的疾病。
術語“炎性疾病”是指對象中的以炎癥例如慢性炎癥為特征的病癥。炎性障礙的說明性的非限制性實例包括但不限于乳糜瀉、類風濕性關節炎(RA)、炎性腸病(IBD)、哮喘、 腦炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、炎性骨質溶解、過敏性障礙、膿毒性休克、肺纖維變性(例如特發性肺纖維變性)、炎性血管炎(例如結節性多動脈炎、韋格納肉芽腫、多發性大動脈炎、 顳動脈炎和淋巴瘤樣肉芽腫)、創傷后血管成形術(例如血管成形術后再狹窄)、未分化脊柱關節病、未分化關節病、關節炎、炎性骨質溶解、慢性肝炎以及由慢性病毒或細菌感染引起的慢性炎癥。術語“分離的”在用于細胞群體時是指從人類或動物身體分離的細胞群體，其基本上不含在體內或體外與所述細胞群體相伴的一種或多種細胞群體。術語“MHC”(主要組織相容性復合物)是指編碼細胞表面抗原呈遞蛋白的基因亞類。在人類中，這些基因被稱為人類白細胞抗原(HLA)基因。在本文中，縮寫MHC或HLA可互換使用。術語“對象”是指動物，優選為哺乳動物包括非靈長動物(例如奶牛、豬、馬、貓、狗、大鼠或小鼠)和靈長動物 (例如猴或人)。在優選實施方案中，對象是人。術語“免疫調節”是指抑制或降低免疫系統的一種或多種生物活性，其包括但不限于免疫應答和炎性狀態的下調一級細胞因子分布情況、細胞毒性活性和抗體生產的變化。 術語“抗原特異性免疫調節”是指抑制或降低免疫系統的與特定抗原、包括同種異體抗原和自體抗原兩者相關的一種或多種生物活性。術語“免疫調節”將包含“抗原特異性免疫調節”。當在本文中使用時，術語“陰性”或“_”當用于細胞表面標記物時，是指在細胞群體中，少于20 %、10 %、優選少于9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的細胞或沒有細胞表達所述標志物。細胞表面標志物的表達可以例如使用常規方法和裝置(例如 BeckmanCoulter Epics XL FACS系統，并使用可商購抗體和本技術領域已知的標準流程)， 通過用于特定細胞表面標志物的流式細胞術來確定。當在本文中使用時，術語“淋巴系統”具有其在本技術領域中通常的意義，是指通過淋巴管和淋巴毛細管的輸導系統相連的淋巴組織。術語“淋巴器官”是指淋巴節，更優選為腋窩淋巴節或腹股溝淋巴節，或者對于缺少淋巴結或淋巴結具有缺陷的個體來說，是指淋巴組織或免疫細胞。當在本文中使用時，術語“間充質干細胞”(在本文中也稱為“MSC”)是指最初源于間充質的能夠產生多種不同細胞類型的細胞。該術語是指能夠分化成成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞或肌細胞中的至少一種的細胞。MSC可以從任何類型的組織分離。一般來說， MSC將從骨髓、脂肪組織、臍帶或外周血分離。在某些實施方案中，在本發明中使用的MSC可以從骨髓(BM-MSC)或脂肪組織(ASC)分離。在本發明的優選情況下，MSC從脂肪吸取物分離，所述脂肪吸取物本身從脂肪組織獲得。當在本文中使用時，表述“顯著表達”或其等價術語“陽性”和“ + ”當用于細胞表面標志物時，是指在細胞群體中，超過20%、優選超過30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%,95%,98%,99%或甚至所有的細胞表達所述標志物。細胞表面標志物的表達可以例如使用常規方法和裝置(例如Beckman Coulter Epics XL FACS系統，并使用可商購抗體和本技術領域已知的標準流程)，通過用于特定細胞表面標志物的流式細胞術來確定，例如使用常規方法和裝置(例如Beckman CoulterEpics XL FACS系統，并使用可商購抗體和本技術領域已知的標準流程)，在流式細胞術中檢測對于特定細胞表面受體來說顯示出高于背景信號的信號。背景信號被定義為在常規FACS分析中將同一同種型的非特異性抗體作為用來檢測每種表面標志物的特異性抗體時給出的信號強度。對于被認為是陽性的標志物來說，在使用常規方法和裝置(例如 BeckmanCoulter Epics XL FACS系統，并使用可商購抗體和本技術領域已知的標準流程) 時觀察到的特異性信號比背景信號強度強20 %以上、優選強30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80 %、90 %、500 %、1000 %、5000 %、10000 % 或更高。此外，可以使用可商購的和已知的針對所述細胞表面受體(例如細胞受體和跨膜蛋白)的單克隆抗體來鑒定相關細胞。術語“結締組織”是指源于間充質的組織，并包括幾種組織，其特征在于它們的細胞包含在細胞外基質中。結締組織的實例包括但不限于脂肪和軟骨組織。當在本文中使用時，術語“成纖維細胞”將包括成纖維細胞樣滑膜細胞。術語“T-細胞”是指作為免疫系統的表達T細胞受體(TCR)的淋巴細胞亞類的細胞。術語“調節性T-細胞”(在本文中也稱為T-reg細胞)是指積極抑制免疫系統的活化并阻止病理性自體反應性即自身免疫疾病的T細胞亞類。術語“調節性T-細胞”或“T-reg 細胞”將包括天然存在的T-細胞(FoXP3+T-reg細胞)和不表達R)xP3分子的適應性T-細胞(也稱為Trl細胞或Th3細胞)兩者。術語“谷蛋白”是指在組分中包含麥醇溶蛋白和谷蛋白的蛋白質。當在本文中使用時，術語“治療”當直接用于指稱患者或對象時，是指與障礙相關的一種或多種癥狀的改善，所述障礙包括但不限于炎性障礙、自身免疫疾病或免疫介導的疾病包括被移植器官和組織的排斥，其中所述改善由向需要所述治療的對象給藥本發明的免疫調節細胞或包含它們的藥物組合物來獲得。當在本文中使用時，術語“修復”當直接用于指稱受損組織時，是指通過直接機制例如受損組織的再生以及通過間接機制例如降低炎癥從而使組織形成這兩種機制改善所述損傷。術語“組合治療”是指以本發明的方式將本發明的免疫調節細胞或包含它們的藥物組合物與其他活性藥劑或治療方式一起使用，用于改善與障礙相關的一種或多種癥狀， 所述障礙包括但不限于炎性障礙、自身免疫疾病或免疫介導的疾病包括被移植器官和組織的排斥。這些其他藥劑或治療可以包括用于治療所述障礙的已知藥物和療法，例如但不限于皮質類固醇和非留體抗炎化合物。本發明的免疫調節細胞或包含它們的藥物組合物，也可以與可用于治療炎癥的其他治療方案例如皮質類固醇、非留體抗炎化合物或其他藥劑相組合。本發明的藥劑與這些其他療法或治療方案的組合使用可以是同時的，或相繼提供，也就是說，這兩種治療可以分開，使得所述免疫調節細胞或包含它們的藥物組合物可以在其他療法或治療方案之前或之后給藥。主治醫師可以決定與其他藥劑、療法或治療方案相組合的免疫調節細胞或包含它們的藥物組合物給藥的適合順序。


圖1說明了在膠原蛋白誘導的關節炎小鼠模型中給藥擴增的脂肪源干細胞降低了關節炎得分，并且淋巴內給藥在治療上比靜脈內途徑更有效。A組未治療的對照；C組 在連續5日中IV給藥一百萬個ASC ；D組在第1日給藥三百萬個ASC并在第3和5日給藥一百萬個ASC ；E組在第1和7日淋巴內給藥320，000個ASC ；F組在第1和7日淋巴內給藥介質。發明詳述一方面，本發明提供了用于在需要治療的對象中治療或修復受損組織(優選為間充質組織)和/或治療、減輕、預防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀的方法，所述方法包含向所述對象的淋巴系統給藥預防或治療有效量的包含細胞治療的組合物。因此，另一方面，本發明提供了優選包含免疫調節細胞、最優選包含干細胞、調節性 T-細胞和/或成纖維細胞的細胞治療，其用于治療或修復受損組織(優選為間充質組織) 和/或用于治療、減輕、預防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀，其中細胞治療被給予到淋巴系統。淋巴內給藥優選通過淋巴內注射來執行。細胞治療適用于淋巴內給藥、優選為淋巴內注射。將干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞直接給予到淋巴系統中，與現有技術、 即所述干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞的常規皮下注射相比具有幾個優點，例如較少量的免疫調節細胞就已足夠，所述治療對于患者來說不比常規皮下注射更痛苦，以及存在較少的不利副作用。此外，通過直接施用到淋巴組織，例如通過淋巴結內注射，免疫調節細胞被遞送至與受損組織的治療或修復位點更近的地方。本發明的免疫調節細胞以及包含它們的藥物和藥物組合物可以在淋巴內給藥的同時，通過常規途徑例如皮下給藥或舌下給藥、經口、透皮(表面疫苗接種)、真皮內、髓內、 鞘內、心室內、鼻內、結膜、支氣管內、透過真皮、直腸內、腹膜內、肌肉內、肺內、陰道、直腸或眼內給藥。優選情況下，本發明的細胞治療包含干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞。特別優選情況下，所述干細胞是間充質干細胞(在后文中也稱為MSC)，最優選為脂肪源間充質干細胞(在后文中也稱為ASC)，其是源于脂肪組織、一般為人類脂肪組織的MSC(hASC)。在本發明中使用的成纖維細胞是間充質來源的結締組織，其與細胞外基質的合成和維持相關，并將包括成纖維細胞樣滑膜細胞。成纖維細胞可以從任何適合的動物、最優選為人類獲得。在本發明中使用的調節性T-細胞(有時被稱為抑制性T-細胞)可以源于任何適合來源，例如血液或脾臟。調節性T-細胞可以是天然存在的CD4+FOXP3+細胞，或者它們可以是離體分離和/或擴增的調節性T-細胞。用于調節性T-細胞的離體擴增的方法在本技術領域中是已知的，包括從全血分離(例如作為PBMC級份的一部分)然后使用例如間充質干細胞或雷帕霉素進行擴增。在本發明的方法中使用的MSC優選源于結締組織。在優選實施方案中，所述MSC 源于脂肪組織，在另一個優選實施方案中，源于脂肪組織的基質部分。在可選實施方案中， 所述MSC從透明軟骨的軟骨細胞獲得。在另一個實施方案中，所述MSC從皮膚獲得。在另一個實施方案中，所述MSC從骨髓獲得。MSC可以從來自任何適合動物、最優選為人類的任何適合的結締組織來源獲得。優選情況下，所述細胞從無病原體哺乳動物來源、優選為出生后(例如嚙齒動物或靈長動物)來源獲得。在優選實施方案中，MSC從結締組織來源獲得，例如但不限于脂肪組織的基質部分、透明軟骨、骨髓或皮膚。最優選情況下，本發明方法的MSC從無病原體出生后人類基質脂肪組織獲得。相對于按照本發明的方法給藥的免疫調節細胞的目標受體來說，在如上描述的所述方法中使用的MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞可以是同種異體(供體)或自體(對象)來源的。在方法的一個實施方案中，所述MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞是同種異體來源的。在方法的一個實施方案中，所述MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞是自體來源的。優選情況下，在本發明的方法中使用的MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞的特征為(i)它們不表達特異性針對抗原呈遞細胞的標志物，(ii)它們不組成性表達IDO(吲哚胺2，3-雙加氧酶)，(^1)它們在用IFN-Y刺激后表達ID0，并且在MSC的情況下，(iv) 它們表現出分化成至少兩種細胞譜系的能力。本發明的干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞優選在適合于注射的生理可接受載體中遞送。一般來說，已知可用的任何生理可接受載體都可用于本發明的實踐。這些載體的選擇包括但不限于林格(Ringer)溶液、水、標準鹽水溶液、葡萄糖溶液和白蛋白水， 并且無疑是在本領域的技術范圍之內。任選地，在注射操作過程中可以使淋巴系統或其一部分例如淋巴管或淋巴器官的局部區域、優選為淋巴節可視化。可以使用超聲波、放射學或其他可視化手段例如計算機軸向斷層攝影術(CAT掃描)來可視化淋巴節并監測針頭的位置和淋巴結中的變化，例如膨脹。由于易于進行超聲波指導的定位和注射，注射到腋窩淋巴節和腹股溝淋巴節中是優選的。用于注射的技術在本領域的技術范圍之內。一種方法是使用含有細胞液體制劑的
單室注射器。另一方面，本發明提供了在需要治療的對象中治療或修復受損組織(優選為間充質組織)和/或治療、減輕、預防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀的方法，所述方法包含向所述對象的淋巴系統給藥預防或治療有效量的包含細胞治療(最優選包含MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞)的組合物，并且還包含將抗原直接給予到所述對象的淋巴系統。所述抗原可以在給藥細胞治療之前、同時或之后給藥。抗原可以在給藥細胞治療之前或之后至少1、2、3、5或10個小時給藥。所述方法中使用的抗原可以是所選抗原、抗原組或表達和/或呈遞所述抗原的細胞類型。在一個實施方案中，抗原選自源于經受自身免疫的患者的自體抗原混合物、肽抗原、核酸、改變的肽配體、重組蛋白或其片段。在一個實施方案中，所述抗原與關節炎相關 (例如但不限于膠原蛋白抗原)。在可選實施方案中，所述抗原與乳糜瀉相關。與乳糜瀉相關的抗原是谷蛋白家族的成員，包括某些形式的醇溶谷蛋白(例如但不限于麥醇溶蛋白、 大麥醇溶蛋白和/或裸麥醇溶蛋白的抗原)。在另一個實施方案中，所述抗原與多發性硬化癥相關(例如但不限于髓磷脂抗原)。用于分離、純化和制備這些抗原的方法，對于本技術領域的專業人員來說是已知的。在特別優選情況下，本發明的所有方面的細胞治療直接給予到淋巴器官，最優選為外周淋巴器官，包括但不限于淋巴節，最優選為腋窩淋巴節或腹股溝淋巴節。在缺少淋巴結或淋巴結具有缺陷的個體中，細胞治療可以遞送至淋巴組織或免疫細胞。淋巴內給藥的方法在本技術領域中是已知的，并通常利用注射裝置(例如注射器)來執行。可以利用成像裝置例如但不限于放射學、超聲波和計算機軸向斷層攝影術 (CAT掃描)來輔助和觀察給藥。這允許細胞治療的精確給藥并監測淋巴器官的不利事件。在方法的一個方面，對象用多劑淋巴內給藥的細胞治療進行治療。優選情況下以一定時間間隔給藥至少2、3、4、5、10或15劑。在方法的另一方面，每劑所述藥劑包含10，000 至5，000，000個細胞。在優選實施方案中，每劑所述藥劑包含10，000至100，000個細胞、 100，000 至 500，000 個細胞、500，000 至 1，000, 000 個細胞或 1，000, 000 至 5，000, 000 個細胞。另一方面，本發明提供了用于給藥至淋巴系統的干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞。在本發明的另一方面，提供了干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞作為藥物的應用，通過將干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞給予到淋巴系統中，用于治療或修復受損組織(優選為間充質組織)和/或治療、減輕、預防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀。本發明的可選方面提供了干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞在藥物制造中的應用，所述藥物通過將干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞給予到淋巴系統中，用于治療或修復受損組織(優選為間充質組織)和/或治療、減輕、預防和/或改善與炎性和/ 或免疫障礙相關的一種或多種癥狀。另一方面，本發明提供了用于給藥至淋巴系統的藥物組合物，其包含干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞。所述藥物組合物用于治療、修復、預防和/或改善受損組織或與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀，例如但不限于自身免疫疾病、炎性障礙和免疫介導的疾病，包括被抑制器官和組織的排斥。在本發明的一個實施方案中，藥物組合物還可以包含抗原、抗原組或表達和/或呈遞所述抗原的細胞類型。在一個實施方案中，抗原選自源于經受自身免疫的患者的自體抗原混合物、肽抗原、核酸、改變的肽配體、重組蛋白或其片段。在一個實施方案中，所述抗原與關節炎相關，例如但不限于膠原蛋白抗原。在可選實施方案中，所述抗原與乳糜瀉相關。與乳糜瀉相關的抗原是谷蛋白家族的成員，包括某些形式的醇溶谷蛋白(例如但不限于麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白和/或裸麥醇溶蛋白的抗原)。谷蛋白及其組分麥谷蛋白和麥醇溶蛋白，是與乳糜瀉相關的優選抗原。在另一個實施方案中，所述抗原與多發性硬化癥相關，例如但不限于髓磷脂抗原和髓磷脂組分抗原例如髓磷脂堿性蛋白(MBP)、髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂質蛋白(PLP)和髓磷脂糖脂例如半乳糖腦苷脂。用于分離、純化和制備這些抗原的方法，對于本技術領域的專業人員來說是已知的。本發明的藥物組合物包含預防或治療有效量的干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞、任選的抗原和藥用載體。每種這些細胞類型的劑量和劑量方式的實例在上文中給出。適合的藥用載體在本技術領域中是已知的，并且優選是由美國聯邦或州政府的管理機構批準或列于美國藥典(U S Pharmacopeia)或歐洲藥典(European Pharmacopeia) 或其他公認藥典中可用于動物、更具體為人類中的藥用載體。術語“載體”是指與治療藥劑一起給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑或介質。如果需要，組合物也可以包含少量PH緩沖齊U。適合的藥用載體的實例描述在E W Martin的《Remington藥物學》(Remington' s PharmaceuticalSciences)中。這樣的組合物將含有預防或治療有效量的優選采取純化形式的預防或治療藥劑以及適量的載體，以提供用于適當給予到對象的形式。制劑應該適合于給藥方式。在優選實施方案中，藥物組合物是無菌的，并采取適合給藥于對象、優選為動物對象、更優選為哺乳動物對象、最優選為人類對象的形式。本發明的藥物組合物可以采取各種形式。它們包括例如半固體和液體劑型，例如冷凍干燥制備物、液體溶液或懸液、可注射和可輸注溶液等。正如上面指出的，藥物組合物優選為可注射的。優選情況下，本發明的方法、藥物、組合物和細胞用于治療或修復受損組織(優選為間充質組織)和/或治療、減輕、預防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀。因此，本發明的方法和細胞可用于治療以任一或所有所述癥狀為特征的任何障礙。 這樣的障礙的代表性而非窮舉的名單提供在定義部分中。特別優選的是將本發明的方法、 藥物、組合物和細胞應用于免疫介導的炎性疾病的治療。此外，優選將本發明的方法、藥物、 組合物和細胞應用于糖尿病、類風濕性關節炎(RA)、炎性腸病(IBD，包括克羅恩病和/或潰瘍性結腸炎)和多發性硬化癥(MQ的治療。更特別優選情況下，將本發明的方法、藥物、組合物和細胞應用于類風濕性關節炎的治療。在本發明的方法或組合物包含一種或多種抗原的情形中，優選將方法或組合物用于與所述抗原相關或由其誘導的障礙的治療中，例如在抗原是膠原蛋白的情形中，方法或組合物可用于治療關節炎，在抗原是谷蛋白組分的情形中，方法或組合物可用于治療乳糜瀉，在抗原是髓磷脂組分的情形中，方法或組合物可用于治療多發性硬化癥。因此，優選的組合物包含MSC、優選為ASC，以及膠原蛋白，用于治療關節炎；MSC、優選為ASC，以及谷蛋白和/或谷蛋白組分，用于治療乳糜瀉；MSC、優選為ASC，以及髓磷脂和/或髓磷脂組分，用于治療多發性硬化癥。另一方面，本發明提供了試劑盒，其包含i)包含干細胞，調節性T-細胞和/或成纖維細胞群體的藥物，以及ii)根據本發明的方法使用它們的說明書。在另一個實施方案中，所述試劑盒還可以包含iii) 一種或多種抗原。MSC表型標志物在本發明的優選方法中使用的MSC優選對與APC(抗原呈遞細胞)表型相關的標志物為陰性。因此，優選情況下，所述MSC對至少一種、兩種、三種或四種或優選所有下述標志物陰性CD lib ；CD Ilc ；CD 14 ;CD45 ;HLAI1。此外，MSC優選對至少一種、兩種或優選所有下述細胞表面標志物陰性⑶31 ；⑶34 ；⑶133。在具體實施方案中，優選情況下，本發明方法中使用的MSC的特征為它們表達至少一種、兩種、三種、四種或優選所有下述細胞表面標志物(即對它們陽性)CD9、CD44、 ⑶Μ、⑶90和⑶105。優選情況下，MSC的特征為它們具有至少一種、兩種、三種、四種和優選所有所述細胞表面標志物⑶9、⑶44、⑶Μ、⑶90和⑶105的顯著表達水平。任選地，MSC也可以對細胞表面標志物⑶106 (VCAM-I)陰性。適用于本發明方法的MSC的實例在本技術領域中已有描述，例如在W02007039150中，在此以其全文引為參考。分化適用于本發明方法的MSC優選為多能干細胞，并可以表現出增殖和分化成至少兩種、更優選三、四、五、六、七或更多種細胞譜系的能力。所述MSC可以分化成的細胞譜系的說明性而非限制性實例包括骨細胞、脂肪組織細胞、軟骨細胞、肌腱細胞、肌細胞、心肌細胞、造血支持性基質細胞、內皮細胞、神經元、星形膠質細胞和肝細胞。MSC通過常規方法能夠增殖并分化成其他譜系的細胞。鑒定以及隨后將分化的細胞與其未分化對應物分離開的方法，也可以通過本技術領域公知的方法來執行。MSC 分離用于分離MSC的方法在本技術領域中是公知的，并且可以使用任何適合的方法。 在一個實施方案中，ASC的分離可以包含下列步驟(i)從脂肪樣品制備細胞懸液；(ii)從所述細胞懸液回收細胞；(iii)將所述細胞在固體表面上，在適合的細胞培養基中，在允許細胞附著于固體表面并增殖的條件下進行溫育；(iv)在溫育后清洗所述固體表面以除去非黏附細胞；(ν)選擇在這樣的培養基中傳代至少兩次后附著于所述固體表面的細胞；以及(vi)證實所選細胞群體表現出目標表型。當在本文中使用時，術語“固體表面”是指ASC能夠附著在其上的任何材料。在具體實施方案中，所述材料是經過處理以促進哺乳動物細胞與其表面的黏附的塑料材料，例如任選包被有聚D-賴氨酸或其他試劑的可商購聚苯乙烯板。步驟(i)-(vi)可以通過本技術領域的專業人員已知的常規技術來執行。簡單來說，ASC可以通過常規手段，從如上所討論的任何適合動物的任何適合的結締組織來源獲得。典型情況下，人類脂肪細胞使用公認的流程例如手術或脂肪抽吸術從活供體獲得。事實上，由于脂肪抽吸法如此常見，因此脂肪抽吸流出物是可以從其產生ASC的特別優選的來源。因此，在具體實施方案中，ASC來自于通過脂肪抽吸術獲得的人類脂肪組織的基質部分。優選情況下，在將組織進行處理以將ASC與其余材料分離之前，對組織進行清洗。 在一種常用方案中，將組織樣品用生理相容的鹽水溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))進行清洗，然后劇烈攪拌并靜置沉降，該步驟從組織中移除松散物質(例如受損組織、血液、紅細胞等)。因此，清洗和沉降步驟一般重復至上清液相對不含碎片。剩余的細胞一般以各種大小的團塊存在，并使用檢定過的降解總體結構同時最小化對細胞自身的損傷的步驟繼續流程。實現這一目標的一種方法是用減弱或破壞細胞之間的連接的酶(例如膠原蛋白酶、 分散酶、胰蛋白酶等)處理洗過的細胞團塊。這種酶處理的量和持續時間隨著所使用的條件而變，但是這類酶的使用在本技術領域中是公知的。可選地，或與這樣的酶處理相結合， 可以使用其他處理例如機械攪拌、聲能、熱能等來降解細胞團塊。如果通過酶方法實現降解，理想情況下在適當時間段后中和酶，以最小化對細胞的有害效應。降解步驟典型地產生聚集細胞的漿液或懸液和通常不含基質細胞(例如紅細胞、 平滑肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞和干細胞)的流體級份。分離過程中的下一個階段是從 ASC分離聚集的細胞。這可以通過離心來實現，所述離心迫使細胞成為被上清液覆蓋的沉淀。然后可以將上清液丟棄，將沉淀懸浮在生理相容流體中。此外，懸浮的細胞典型地包括紅細胞，并且在大多數方案中希望裂解它們。用于選擇性裂解紅細胞的方法在本技術領域中是已知的，并且可以使用任何適合的方案(例如在高滲或低滲介質中溫育，使用氯化銨裂解等)。當然，如果紅細胞被裂解，然后將通過例如過濾、沉降或密度分級將細胞與裂解液分離開。不論是否裂解紅細胞，可以將懸浮的細胞連續清洗、重新離心并重懸浮一次或多次，以獲得更高的純度。可選地，可以在細胞表面標志物情況的基礎上或在細胞尺寸和粒度的基礎上分離細胞。在最后的分離和重新懸浮之后，可以將細胞培養，并且如果需要測定數量和生活力以評估收率。優選情況下，使用適合的固體細胞培養基，在適合的細胞密度和培養條件下，將細胞不分化地培養在固體表面上。因此，在具體實施方案中，將細胞在適合的細胞培養基[例如DMEM，典型地增補有5-15% (例如10% )的適當血清例如胎牛血清或人血清] 存在下，在通常由塑料材料制成的固體表面例如皮氏培養皿或細胞培養瓶上不分化地進行培養，并在允許細胞附著于固體表面并增殖的條件下進行溫育。在溫育后，對細胞進行清洗以便移除非黏附細胞和細胞片段。將細胞維持在相同培養基中和相同條件下，直到它們達到足夠合生，其中在需要時更換細胞培養基。在達到所需的細胞合生后，可以使用拆解劑例如胰蛋白酶并以適合的細胞密度(通常為2，000-10，000個細胞/cm2)接種到新的細胞培養表面上，利用連續傳代來擴增細胞。因此，然后將細胞在這樣的培養基中不分化地、同時仍保留其發育表型地傳代至少兩次，更優選情況下，細胞可以傳代至少10次(例如至少15 次或甚至至少20次)而不失去發育表型。典型情況下，將細胞以所需密度例如約100個細胞/cm2至約100，000細胞/cm2之間(例如約500個細胞/cm2至約50，000個細胞/cm2之間，或更特別情況下約1，000個細胞/cm2至約20，000個細胞/cm2之間)鋪板。如果以更低密度(例如約300細胞個/cm2)鋪板，細胞可以更容易地克隆分離。例如，在幾天后，以這樣的密度鋪板的細胞將增殖成均勻群體。在具體實施方案中，細胞密度在2，000-10，000 個細胞/cm2之間。正如下面所提到的，選擇在這種包含至少兩次傳代的處理后保持附著于固體表面的細胞，并通過常規方法分析目標表型，以便證實ASC的身份。在第一次傳代后保持附著于固體表面的細胞來自于非均質來源；因此，必須對所述細胞進行至少另一次傳代。作為上述方法的結果，獲得了具有目標表型的均質細胞群體。在至少兩次傳代后細胞附著于固體表面，構成了本發明用于選擇人ASC的優選實施方案。目標表型的證實可以使用常規手段來進行。優選情況下，通過將所述群體至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、 至少10次、至少15次或至少20次復制兩倍或三倍，來進行所述擴增。在另一個實施方案中，所述擴增繼續進行至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次、至少 15次或至少20次傳代。細胞表面標志物可以通過任何適合的通常基于陽性/陰性篩選的常規技術來鑒定；例如，可以使用針對需要證實其在細胞中的存在/不存在的細胞表面標志物的單克隆抗體，盡管也可以使用其他技術。因此，在特定實施方案中，使用針對⑶lib、⑶11c、⑶14、 ⑶45、HLAII、⑶31、⑶；34和⑶133中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或優選所有標志物的單克隆抗體，以便證實在所選細胞中不存在所述標志物；并使用針對CD9、CD44、 ⑶M、⑶90和⑶105中的一個、兩個、三個、四個或優選所有標志物的單克隆抗體，以便證實至少一個和優選所有所述標志物的存在或其可檢測的表達水平。所述單克隆抗體是已知的、可商購的或可以由本技術領域的專業人員通過常規方法獲得。所選細胞中IFN-γ可誘導的IDO活性可以通過任何適合的常規測定法來測定。例如，所選細胞可以用IFN-Y刺激并測定IDO的表達；然后可以執行常規的Western印跡來分析IDO蛋白的表達，并可以通過色氨酸向犬尿氨酸的轉化，例如通過用上清液中犬尿氨酸濃度的高效液相色譜(HPLC)分析和光度測定作為讀出值，來測量所選細胞在IFN-Y刺激后的IDO酶活性。因為ASC在某些條件下表達ID0，因此允許檢測IFN- γ刺激后的IDO 酶活性的任何適合的技術都可用于選擇ASC。產生的IDO的量取決于每平方厘米的細胞數量，其優選處于5000個細胞/cm2或以上的水平，但不限于該濃度，還取決于IFN-γ的濃度， 其理想情況下為3ng/ml或以上，但不限于該濃度。在所描述的條件下產生的IDO活性，將在M小時或更長時間后引起μM范圍內的可檢測的犬尿氨酸生產。所選細胞分化成至少兩種細胞譜系的能力，可以通過本技術領域中已知的常規方法來測定。如果需要，可以使用用于克隆細胞群體的適合方法對ASC進行克隆擴增。例如，可以將增殖的細胞群體物理挑出并接種到分開的表面(或多孔板的孔)中。可選地，可以將細胞在多孔板上以統計比率進行亞克隆，所述統計比率便于將單個細胞置于每個孔中(例如約0. 1至約1個細胞/孔或甚至約0. 25至約0. 5個細胞/孔，例如0. 5個細胞/孔)。 當然，可以通過將細胞以低密度鋪板(例如在皮氏培養皿或其他適合基質上)并使用裝置例如克隆環將它們與其他細胞分離開，來克隆細胞。克隆群體的生產可以在任何適合的培養基中擴增。在任何情況下，可以將分離的細胞培養至適合的時間點，此時可以評估它們的發育表型。已經顯示，通過例如使用適合血清(例如胎牛血清或人血清)的特殊篩選的批次， 可以在長時期內實現不誘導分化的ASC離體擴增。用于測量生活力和產率的方法在本技術領域中是已知的(例如臺盼藍拒染試驗)。如果需要，用于分離本發明細胞群體的細胞的任何步驟和程序，都可以手動進行。 可選地，分離這樣的細胞的方法可以通過一種或多種適合的裝置來促進和/或自動化，所述裝置的實例在本技術領域中是已知的。MSC細胞培養所述MSC也能夠離體擴增。也就是說，在分離后，所述MSC可以在細胞培養基中維持并允許其離體增殖。這樣的培養基包含例如Dulbecco改良的fegle培養基(DMEM)，含抗生素(例如100單位/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素)或不含抗生素，含有2mM谷氨酰胺并增補有2-20%胎牛血清(FBS)。根據所使用的細胞的需要修改或調整培養基和/或培養基增補劑的濃度，在本技術領域的專業人員的技術范圍之內。血清通常含有細胞和非細胞因子，以及生活力和擴增所必需的組分。血清的實例包括胎牛血清(FBS)、牛血清(BS)、 小牛血清(CS)、胎小牛血清(FCS)、出生后小牛血清(NCQ、山羊血清(GS)、馬血清(HS)、豬血清、綿羊血清、兔血清、大鼠血清(RS)等。在本發明的范圍內還包括下述情況，即如果所述MSC是人類來源的，細胞培養基增補有人血清、優選為自體來源的。應該理解，如果認為需要失活補體級聯的組分，可以將血清在55-65°C熱失活。血清濃度的調節和/或從培養基中撤出血清，也可用于促進一種或多種所需細胞類型的存活。優選情況下，所述MSC將得益于約2%至約25%的FBS濃度。在另一個實施方案中，MSC可以在確定組成的細胞培養基中擴增，在所述培養基中血清被血清白蛋白、血清轉鐵蛋白、硒以及重組蛋白的組合代替，所述重組蛋白包括但不限于胰島素、血小板衍生生長因子(PDGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，正如本技術領域中已知的。許多細胞培養基已經包含氨基酸，然而某些培養基在培養細胞之前需要增補。這樣的氨基酸包括但不限于L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、 L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺\L-甘氨酸等。典型情況下，抗微生物劑也可用于細胞培養中，以減輕細菌、支原體和真菌感染。 典型情況下，使用的抗生素或抗真菌化合物是青霉素/鏈霉素的混合物，但是也可以包括但不限于兩性霉素(Fungizone )、氨芐青霉素、慶大霉素、博來霉素、潮霉素、卡那霉素、絲裂霉素等。有利情況下，激素也可用于細胞培養中，并且包括但不限于D-醛甾酮、二乙基己烯雌酚(DES)、地塞米松、β-雌二醇、氫化可的松、胰島素、催乳素、孕酮、生長激素釋放抑制因子/人生長激素(HGH)等。擴增的細胞 在一個實施方案中，MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞在用于本發明的方法之前可能已被擴增。用于細胞擴增的方法在本技術領域中是已知的。遺傳工程改造的細胞在另一個實施方案中，MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞可以是遺傳工程改造的細胞(例如用外源核酸轉導或轉染過)，或源于遺傳工程改造的細胞。例如，所述細胞可以被遺傳工程改造以組成性表達吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)， 這可以通過例如用編碼所述酶和任選的適合的啟動子序列的適合的核酸構建物進行轉染來進行。細胞的遺傳工程在本技術領域中是已知的，并可以由本技術領域的專業人員來執行。輻照過的細胞在另一個實施方案中，MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞在用于本發明的方法之前可能已被輻照。細胞的輻照降低了它們的增殖能力和存活時間。輻照可以使用適合的受控電離輻射源例如Y-輻射體裝置來進行。輻照條件必須由本技術領域的專業人員通過實驗進行調整，以確定提供引起MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞的長期生長停止的輻射劑量所需的暴露時間。在一個實施方案中，所述輻射劑量在選自l-100Gy、5-85Gy、10_70Gy、12_60Gy的范圍內，然而，特別優選情況下，所述輻射劑量在15-45Gy的范圍內。⑶沈拮抗劑處理的細胞在另一個實施方案中，MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞在用于本發明的方法之前，可以用C擬6拮抗劑或抑制劑進行處理。C擬6拮抗劑和抑制劑在本技術領域中是已知的，并包括但不限于氨基甲基吡啶、P32/98、NVP DPP728、PSN9301、異亮氨酸噻唑烷、地那列汀、西他列汀、維達列汀、沙格列汀、阿格列汀、抑二肽素A，并且這樣的處理可以由本技術領域的專業人員來執行。IFN-Y刺激的細胞
在另一個實施方案中，MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞在用于本發明的方法之前，可以用Y-干擾素進行處理。MSC的IFN-γ處理以對其進行刺激在本技術領域中是已知的，并可以由本技術領域的專業人員來執行。抗原刺激的細胞在另一個實施方案中，MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞在用于本發明的方法之前，可以用抗原進行刺激。MSC的抗原處理以對其進行刺激在本技術領域中是已知的，并可以由本技術領域的專業人員來執行。絲裂霉素C處理的MSC在另一個實施方案中，MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞在用于本發明的方法之前，可以用絲裂霉素C進行處理。MSC的絲裂霉素C處理在本技術領域中是已知的，并可以由本技術領域的專業人員來執行。此外，如果需要，MSC、調節性T-細胞和/或成纖維細胞在用于本發明的方法之前， 可以進行選自輻照、IFN- γ刺激和絲裂霉素C處理的兩種或三種處理的組合。所述MSC的維持條件也可以含有允許細胞保持在未分化形式中的細胞因子。對于本技術領域的專業人員來說，顯然在分化之前，必須從培養基中除去抑制細胞分化的增補齊U。此外，顯然不是所有細胞都需要這些因子。事實上，取決于細胞類型，這些因子可能引發不想要的效應。通過下面的非限制性實施例，本發明的特點和優點將得到更充分的說明，其中除非另有指明，否則所有份數和百分比以重量計。實施例1 使用ASC治療膠原蛋白誘導的關節炎(CIA)材料和方法月￠111 白 秀導的關節炎(CIA)^MMm在DBAl/OH》雄性小鼠(6-8周齡)中誘導實驗性關節炎。在開始研究的當天， 使用第一劑雞II型膠原蛋白(CII)(終濃度為lmg/ml)在弗氏完全佐劑(結核分枝桿菌 (Mycobacterium Tuberculosis)終濃度為 lmg/ml) (CFA)中的乳液，以 0. Iml/動物的乳液體積對每只小鼠在尾部(距身體2-3cm)進行皮下注射。在第一次注射膠原蛋白后21天， 向每只動物給藥第二次CII注射(加強針)(0. Iml/動物)，仍然是在尾部皮下給藥，但是在與第一次注射不同的位置處。這次，使用弗氏不完全佐劑(IFA)制備膠原蛋白懸液。當關節炎得分值在2-4左右時，將動物用擴增的脂肪源干細胞或作為對照的介質 (林格溶液)進行治療。通過按照預先建立的得分系統測量上下肢關節的炎癥-發紅-關節強硬，每日(從星期一至星期五)跟蹤CIA的演變。在給藥測試物或介質后，每日測量每只動物的兩只后爪的體積，并計算兩只爪的平均值。此外，將在第1日測量的每只動物的后爪體積(在第一次膠原蛋白注射之前，并取為基線體積)從其后每日測量的爪體積中減去，以獲得每只動物的爪體積的凈增加(或浮腫)。此外，按照下面的關節炎指數得分系統，以相同的頻率和時間對前爪和后爪中關節炎的嚴重性進行記分0 無關節炎跡象1 爪或1個指頭腫脹和/或發紅2 兩組關節發炎(腫脹和/或發紅)CN 102549147 A
3 多于兩組關節發炎(腫脹和/或發紅)4:整個爪的炎癥。嚴重關節炎最后的得分值是四只爪的得分值的總和。最高得分值為16。實驗設計MMA組=無治療靜脈內給藥C組=靜脈內注射，每劑1百萬個細胞，每日1劑連續給藥，總共5劑。D組=靜脈內注射，第一劑3百萬個細胞，第二和第三劑1百萬個細胞，每隔一日給藥1劑，總共3劑。淋巴內給藥E組=淋巴內注射，每劑320，000個細胞(右側腹股溝淋巴結160，000個，左側 160，000個)，總共2劑，第二劑在第一劑后7天給藥。介質對照F組=淋巴內注射林格溶液，總共2劑，第二劑在第一劑后7天給藥。N= 12只小鼠/組。靜脈內給藥使用無菌蝴蝶針05G)，通過尾靜脈對測試物進行靜脈內給藥。動物連續5日或3 個隔日接受藥劑(每日1劑)。動物接受0.2ml測試物，以0.05ml/min的速率通過尾靜脈進行靜脈內輸注。淋巴內給予到腹股溝淋巴節中通過經鼻罩吸入2. 0%至2. 5%異氟烷將DBAl小鼠麻醉，并躺置在37°C的加溫板上。在脫毛(Veet敏感型脫毛膏)并用70%乙醇對腹股溝區域消毒后，在腹股溝區域中制造6mm至8mm切口。定位腹股溝脂肪中的淋巴節，并使用帶有30號針頭的Hamilton注射器向淋巴結內注射8 μ 1介質或帶有ASC的介質(密度為2千萬個細胞/ml)。通過一個或兩個結縫合切口，并在另一側腹股溝淋巴結中重復該程序。使小鼠從麻醉中恢復。7日后， 重復該程序。擴增的脂肪源干細胞的制備在局部麻醉和普通鎮靜下通過吸脂術獲得人類脂肪組織。通過小切口(直徑小于 0. 5cm)將中空鈍頭套管導入到皮下空間中。在輕柔抽吸下，將套管移動通過脂肪組織腹壁區室，用于脂肪組織的機械破裂。將鹽水溶液和血管收縮劑腎上腺素注射到脂肪組織區室中以將失血減至最少。通過這種方式，從每個待治療患者獲取80ml至IOOml原始脂肪吸取物。將原始脂肪吸取物用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS ；Gibco BRL, Paisley, Scotland, UK)大量清洗，以除去血細胞、鹽水和局部麻醉劑。將細胞外基質用平衡鹽溶液(5mg/ml ； Sigma, St. Louis, USA)中的 II 型膠原蛋白酶(0. 075% ；Gibco BRL)在 37°C下消化 30 分鐘，以釋放出細胞級份，然后通過加入等體積細胞培養基(含有10%胎牛血清(FBS ；Gibco BRL)的Dulbecco改良的fegle培養基(DMEM ;GibcoBRL))將膠原蛋白酶失活。將細胞懸液以250x g離心10分鐘。將細胞重懸浮在0. 16M NH4Cl中，并允許其在室溫(RT)下靜置5分鐘以裂解紅細胞。將混合物以250x g離心，并將細胞重懸浮在添加10% FBS和青霉素/鏈霉素混合物(Gibco BRL)的DMEM中，然后將它們通過40 μ m篩網過濾，并以10_30x IO3個細胞/cm2的密度鋪于組織培養瓶中。將細胞在37°C下，在含有5% CO2的空氣氣氛下培養M小時。然后將培養瓶用PBS 清洗以除去非黏附細胞和細胞碎片。將細胞維持在相同培養基和相同條件下的培養中，直至它們達到約80%合生，其間每3至4日更換培養基。然后將細胞以1 3的稀釋率用胰蛋白酶-EDTA (Gibco BRL)進行傳代，所述稀釋率對應于約5_6 χ IO3個細胞/cm2的細胞密度。對于實驗來說，將復制加倍12-16次的細胞用胰蛋白酶處理，并以所需細胞密度懸浮在介質(林格溶液)中。然后轉移至注射器并注射到小鼠中。統計分析結果的統計學顯著性使用統計學程序GraphPad Instat 3來評估。結果被表示成平均值士平均值的標準誤差，其中(η)是動物數量。圖1的注解說明了 A組與E組的比較的ρ-值。顯著差異被表示成*Ρ < 0. 05， **Ρ < 0. 01，*#Ρ <0. OOl0組之間的差異通過用于不成對數據的Kruskal-Wallis檢驗和 Dunn形式多重比較的事后檢驗來評估。P值< 0. 05被當作是顯著的。MM通過注射雞膠原蛋白II在DBAl小鼠中誘導了關節炎。當小鼠顯示出2_4的關節炎得分值時，使用擴增的ASC通過靜脈內或淋巴內途徑對它們進行治療。作為淋巴內給藥的對照，將小鼠用介質進行處理。每日監測關節炎得分值(參見表1)。盡管未治療小鼠或用介質處理的小鼠顯示出以時間依賴性方式增加的爪的高度炎癥，但用淋巴結內遞送的擴增的ASC治療的小鼠顯示出明顯減輕的炎癥。此外，淋巴內給藥的療效高于靜脈內給藥(參見圖1)。Mrk本研究顯示，人類ASC向DBAl小鼠的淋巴內給藥引起關節炎嚴重性的統計學顯著的降低(正如通過關節炎指數得分值所表明的)。此外，淋巴內給藥總共640，000個ASC (在兩劑藥劑中)的療效顯著高于靜脈內給藥總共5百萬個細胞。這些結果表明淋巴內給藥途徑更加有效，因為使用較低數量的細胞達到了較高療效。因此，盡管在本文中已經參考本發明的具體方面、特點和說明性實施方案對本發明進行了描述，但應該認識到，本發明的用途不限于此，而是擴展到并涵蓋大量其他方面、 特點和實施方案。因此，權利要求書打算相應廣義地解釋為包括其精神和范圍之內的所有這樣的方面、特點和實施方案。
權利要求
1.在具有受損組織和/或具有與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀的對象中用于治療或修復受損組織和/或用于治療、減輕、預防和/或改善炎性和/或免疫障礙的方法，所述方法包含向所述對象的淋巴系統給藥預防或治療有效量的、包含干細胞、調節性 T-細胞和/或成纖維細胞的組合物。
2.權利要求1的方法，其中所述干細胞是間充質干細胞。
3.權利要求1或2任一項的方法，其還包含向所述對象的淋巴系統給藥抗原。
4.權利要求3的方法，其中所述抗原在干細胞、調節性T-細胞或成纖維細胞給藥之前、 同時或之后給藥。
5.權利要求3的方法，其中所述抗原在干細胞、調節性T-細胞或成纖維細胞給藥之前或之后至少1、2、3、5或10小時給藥。
6.前述權利要求任一項的方法，其中所述治療被給予到淋巴器官。
7.前述權利要求任一項的方法，其中所述治療被給予到外周淋巴器官。
8.權利要求7的方法，其中所述外周淋巴器官是淋巴節。
9.權利要求8的方法，其中所述淋巴節是腋窩淋巴節或腹股溝淋巴節。
10.前述權利要求任一項的方法，其中所述給予利用注射器執行。
11.權利要求10的方法，其還包含使用放射學、超聲或成像裝置來監測注射針頭的位置的步驟。
12.干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞，其應用于下述方法中i.治療或修復受損組織；和/或 治療、減輕、改善和/或預防與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀；其中細胞被給予到淋巴系統。
13.權利要求12的用于所述權利要求的應用的細胞，其中所述干細胞是間充質干細胞。
14.權利要求12至13任一項的用于所述權利要求的應用的細胞，其中所述方法還包含向所述對象的淋巴系統給藥抗原。
15.權利要求14的用于所述權利要求的應用的細胞，其中所述抗原在干細胞、調節性 T-細胞或成纖維細胞給藥之前、同時或之后給藥。
16.權利要求14的用于所述權利要求的應用的細胞，其中所述抗原在干細胞、調節性 T-細胞或成纖維細胞給藥之前或之后至少1、2、3、5或10小時給藥。
17.權利要求12至16任一項的用于所述權利要求的應用的細胞，其中干細胞、調節性 T-細胞和/或成纖維細胞被給予到淋巴器官。
18.權利要求12至16任一項的用于所述權利要求的應用的細胞，其中干細胞、調節性 T-細胞和/或成纖維細胞被給予到外周淋巴器官。
19.權利要求18的用于權利要求19的應用的細胞，其中所述外周淋巴器官是淋巴節。
20.權利要求19的用于權利要求19的應用的細胞，其中所述淋巴節是腋窩淋巴節或腹股溝淋巴節。
21.權利要求12至20任一項的用于所述權利要求的應用的細胞，其中所述給予利用注射器執行。
22.權利要求21的用于所述權利要求的應用的細胞，其還包含使用放射學、超聲或成像裝置來監測注射針頭的位置的步驟。
23.試劑盒，其包含i)包含干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞群體的藥物，以及 )用于權利要求1的方法的使用說明書。
24.干細胞和/或成纖維細胞在制造藥物中的應用，所述藥物通過將干細胞、調節性 T-細胞和/或成纖維細胞給予到淋巴系統中用于治療或修復受損組織和/或用于治療、減輕、預防和/或改善與炎性和/或免疫障礙相關的一種或多種癥狀。
25.權利要求1至11任一項的方法，其中所述障礙選自乳糜瀉、類風濕性關節炎、炎性腸病和多發性硬化癥。
26.權利要求12至22任一項的用于所述權利要求的應用的細胞，其中所述障礙選自乳糜瀉、類風濕性關節炎、炎性腸病和多發性硬化癥。
27.權利要求M的應用，其中所述障礙選自乳糜瀉、類風濕性關節炎、炎性腸病和多發性硬化癥。
28.干細胞、調節性T-細胞或成纖維細胞，其用于給予到淋巴系統。
29.權利要求觀的干細胞、調節性T-細胞或成纖維細胞，其用于治療中。
30.用于給予到淋巴系統的藥物組合物，其包含干細胞、調節性T-細胞和/或成纖維細胞、以及抗原。
31.權利要求30的藥物組合物，其中所述抗原是膠原蛋白、谷蛋白、谷蛋白組分、髓磷脂或髓磷脂組分。
全文摘要
本發明提供了細胞治療的淋巴內給藥方法。本發明還提供了與這類方法相關的組合物、試劑盒及其應用。
文檔編號C12N5/0783GK102549147SQ201080030890
公開日2012年7月4日 申請日期2010年7月9日 優先權日2009年7月9日
發明者埃萊烏特里奧·羅姆巴杜, 迪爾克·巴斯切爾 申請人:塞拉瑞克斯公司