豬流感血凝素變異體的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：392332閱讀：291來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：豬流感血凝素變異體的制作方法
            
豬流感血凝素變異體相關申請的交叉引用本申請依據美國法典第35篇第119條(e)款(35 U. S. C. § 119(e))要求以下美國臨時申請的權益2009年6月25日提交的第61/220,426號、2009年7月23日提交的第61/227，986號、2009年8月14日提交的第61/234，021號和2009年11月6日提交的第61/258，890號。這些申請的每一個均明確地通過引用整體并入。
            
背景技術：
            2009年4月豬源性A型流感(HlNl)病毒在人類中的全球性傳播標志著41年來的首次流感大流行。截止2009年6月15日，35，000多人感染了這種新型HlNl病毒。上個世紀，HlNl流感病毒也引起了 1918-1919毀滅性大流行。另外，1976年源自豬的HlNl病毒引
            
起了流產大流行。1918年春，1918流感病毒引起溫和爆發并且于當年秋天引起了全球性致命波動，導致全世界50，000, 000人死亡。雖然在2009年早期，2009豬源性HlNl流感病毒被認為是溫和的，但是這種病毒可能突變并且于2009年秋其毒性變得更強。因此急需研發一種有效的疫苗來防治2009H1N1病毒引起的嚴重大流行。已分離了用于疫苗(活疫苗和致死疫苗)研發的6:2重配流感病毒(具有豬源性A型流感(HlNl)病毒的HA和NA片段和減毒流感病毒的“骨架”片段)，然而至今為止多數分離株表現出在卵中的滴度很低。相同分離物感染MDCK細胞不良并形成CPE較差的微空斑。另外，在病毒過濾之后觀察到病毒效力嚴重喪失。因此，最初分離的HlNl重配流感病毒株是研發疫苗株的較差候選。本發明提供新的和/或新分離的豬流感Hl血凝素變異體，所述變異體能用于生成多種類型的疫苗以及用于研究、診斷等。本發明進一步提供提高Hl流感病毒的復制效率的方法。經查看下文許多其它益處將顯而易見。發明概述如本文所述，適合用于研發HlNl疫苗的6:2重配流感株通過反向遺傳學產生。最初分離的包含野生型HA和NA基因組片段的重配病毒，在卵中生長差，經修飾以致在卵中的生長明顯改善。經修飾重配病毒的序列分析表明位于Hl豬血凝素的位置119、153、154和186上的氨基酸變化導致卵和MDCK細胞的生長優勢。還發現先前所示增強豬1976病毒復制的HA殘基155處氨基酸取代增強卵中重配A/CA/7/09病毒復制。在HA殘基119和186處有氨基酸變化的病毒增強卵生長，而不明顯改變病毒抗原性。本文所述的HlHA變異體使包含PR8或A/Ann Arbor/6/60病毒株的6個內部基因組片段的6:2重配病毒具有生長增強的表現型。而且,雪貂中包含ca A/AnnArbor/6/60骨架的變異病毒和在HA殘基119或186處有氨基酸取代的Hl HA變異體是減毒的并且極具免疫原性。這些數據表明包含位于HA殘基119和/或186處的氨基酸取代的重配流感病毒變異體適于研發人用HlNl豬流感疫苗。發明詳述本發明包括流感血凝素的多肽和多聚核苷酸序列以及包含此序列的載體、病毒、疫苗、組合物等，及它們的使用方法。本文更詳細地描述了本發明另外的特征。
            
在一些方面，本發明提供分離或重組血凝素多肽。在一個實施方案中，本發明的分離或重組HA多肽為Hl HA多肽。在另一實施方案中，本發明的分離或重組HA多肽可為豬流感HA多肽。在一個實施方案中，本發明的分離或重組HA多肽可在與SEQ IDNO :I的氨基酸殘基位置119相對應的位置上或在與SEQ ID NO : I的氨基酸殘基位置186相對應的位置上包含非天然存在的氨基酸。在另一實施方案中，本發明的分離或重組HA多肽可在與SEQ IDNO 1的氨基酸殘基位置119相對應的位置上和在與SEQ ID NO :1的氨基酸殘基位置186相對應的位置上包含非天然存在的氨基酸。在又一實施方案中，本發明的分離或重組HA多肽包含至少一個選自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代。在一個特定實施方案中，本發明的分離或重組HA多肽包含含至少一個選自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO :I的氨基酸序列。在另一特定實施方案中，本發明的分離或重組HA多肽可在與SEQ ID NO :1的位置119的氨基酸殘基相對應的氨
            
基酸殘基處包含谷氨酸(E)和在與SEQ ID NO : I的位置186的氨基酸殘基相對應的氨基酸殘基處包含天冬氨酸(D)。在又一特定實施方案中，本發明的分離或重組HA多肽可在與SEQID NO : I的位置119的氨基酸殘基相對應的氨基酸殘基處包含天冬酰胺(N)和在與SEQ IDNO 1的位置186的氨基酸殘基相對應的氨基酸殘基處包含天冬氨酸(D)。在又一實施方案中，本發明的分離或重組HA多肽可還包含H273Y取代。在又一實施方案中，本發明的分離或重組HA多肽可還包含D222G和/或Q223R取代。在一個特定實施方案，本發明的HA多肽包含SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列。在另一實施方案中，本發明的HA多肽包含與SEQ IDNO :6或8的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。在又一實施方案中，本發明的HA多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列。在一個特定實施方案，本發明的HA多肽包含SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列。在另一實施方案中，本發明的HA多肽包含與SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。在又一實施方案中，本發明的HA多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列。本發明還涵蓋編碼本發明多肽的核酸和包含本發明的此類多肽和/或核酸的重配或重組流感病毒。在一個特定實施方案，本發明的核酸包含SEQ ID NO :7的核苷酸序列。在另一實施方案中，本發明的核酸包含與SEQ ID NO :7的核苷酸序列有至少95%、至少98%、至少
            
98.5%,至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一'I"生的核苷酸序列。在又一實施方案中，本發明的核酸包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO 7的核苷酸序列。
            
在一個特定實施方案，本發明的核酸包含SEQ ID NO :7的殘基84至1064的核苷酸序列。在另一實施方案中，本發明的核酸包含與SEQ ID NO: 7的殘基84至1064的核苷酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%,至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的核苷酸序列。在又一實施方案中，本發明的核酸包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO 7的殘基84至1064的核苷酸序列。在一個實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含來自A/Ann Arbor/6/60的6個內部基因組片段、編碼包含SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列的HA多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。在一個特定實施方案中，所述第一基因組片段可編碼包含與SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述第一基因組片段可編碼包含含少
            
于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述第二基因組片段包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列。在一個特定實施方案中，所述神經氨酸酶多肽包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約81og1(lPFU/ml、至少約8. 51og1(lPFU/ml、至少約 91og1(lPFU/ml、至少約 9. 51og1(lPFU/ml、至少約 101og1(lPFU/ml、至少約 10. 51og10PFU/ml或至少約lllog1(lPFU/ml的滴度。在一個特定實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在組織培養物中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約81og1(lPFU/ml、至少約8. 51og1(lPFU/ml、至少約91og1(lPFU/ml、至少約 9. 51og1(lPFU/ml、至少約 101og1(lPFU/ml、至少約 10. 51og10PFU/ml 或至少約lllog1(lPFU/ml的滴度。在另一實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含來自A/Ann Arbor/6/60的6個內部基因組片段、編碼包含SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的HA多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。在一個特定實施方案中，所述第一基因組片段可編碼包含與SEQ ID NO 6的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少
            
99.9%序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述第一基因組片段可編碼包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述第二基因組片段包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列。在一個特定實施方案中，所述神經氨酸酶多肽包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約81og1(lPFU/ml、至少約 8. 51og1(lPFU/ml、至少約 91og1(lPFU/ml、至少約 9. 51og1(lPFU/ml、至少約 IOlogltlPFU/ml、至少約10. 51og10PFU/ml或至少約lllog1(lPFU/ml的滴度。在一個特定實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在組織培養物中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約81og1(lPFU/ml、至少約 8. 51og1(lPFU/ml、至少約 91og1(lPFU/ml、至少約 9. 51og1(lPFU/ml、至少約 101og1(lPFU/ml、至少約 10. 51og10PFU/ml 或至少約 lllog1(lPFU/ml 的滴度。在一個實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含來自A/Puerto Rico/8/34的6個內部基因組片段、編碼包含SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列的HA多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。在一個特定實施方案中，所述第一基因組片段可編碼包含與SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述第一基因組片段可編碼包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述第二基因組片段包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列。在一個特定實施方案中，所述神經氨酸酶多肽包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約81og1(lPFU/ml、至少約8. 51og1(lPFU/ml、至少約 91og1(lPFU/ml、至少約 9. 51og1(lPFU/ml、至少約 101og1(lPFU/ml、至少約 10. 51og10PFU/ml或至少約lllog1(lPFU/ml的滴度。在一個特定實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在組織培養物中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約81og1(lPFU/ml、至少約8. 51og1(lPFU/ml、至少約
            
91og1(lPFU/ml、至少約 9. 51og1(lPFU/ml、至少約 101og1(lPFU/ml、至少約 10. 51og10PFU/ml 或至少約lllog1(lPFU/ml的滴度。在另一實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含來自A/Puerto Rico/8/34的6個內部基因組片段、編碼包含SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的HA多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。在一個特定實施方案中，所述第一基因組片段可編碼包含與SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述第一基因組片段可編碼包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述第二基因組片段包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列。在一個特定實施方案中，所述神經氨酸酶多肽包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約81og1(lPFU/ml、至少約 8. 51og1(lPFU/ml、至少約 91og1(lPFU/ml、至少約 9. 51og1(lPFU/ml、至少約 IOlogltlPFU/ml、至少約10. 51og10PFU/ml或至少約lllog1(lPFU/ml的滴度。在一個特定實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在組織培養物中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約81og1(lPFU/ml、至少約 8. 51og1(lPFU/ml、至少約 91og1(lPFU/ml、至少約 9. 51og1(lPFU/ml、至少約 101og1(lPFU/ml、至少約 10. 51og10PFU/ml 或至少約 lllog1(lPFU/ml 的滴度。在一個實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含來自A/Ann Arbor/6/60的6個內部基因組片段、包含SEQ ID NO :7的核苷酸序列的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。在另一實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含來自A/AnnArbor/6/60的6個內部基因組片段、包含SEQ ID NO 7的殘基84-1064的核苷酸序列的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。在又一實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含來自A/Puerto Rico/8/34的6個內部基因組片段、包含SEQID NO :7的核苷酸序列的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。在另一實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含來自A/Puerto Rico/8/34的6個內部基因組片段、包含SEQ ID NO 7的殘基84-1064的核苷酸序列的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。在一個特定實施方案中，所述第二基因組片段包含SEQID NO :5的核苷酸序列。在一個特定實施方案中，所述神經氨酸酶多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約 81og1(lPFU/ml、至少約 8. 51og1(lPFU/ml、至少約 91og1(lPFU/ml、至少約 9. 51og1(lPFU/ml、至少約 101og1(lPFU/ml、至少約 10. 51og10PFU/ml 或至少約 Illog10PFU/ml的滴度。在一個特定實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在組織培養物中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約 81og1(lPFU/ml、至少約 8. 51og1(lPFU/ml、至少約 91og1(lPFU/ml、至少約
            
9.51og1(lPFU/ml、至少約 101og1(lPFU/ml、至少約 10. 51og10PFU/ml 或至少約 lllog1(lPFU/ml 的滴度。在其它方面，本發明包括具有一種或多種上文所列多肽或其片段的無菌組合物。
            
本發明還涵蓋包含免疫有效量的一種或多種上述多肽的免疫原性組合物，以及用于刺激個體的免疫系統以對流感病毒產生保護性免疫應答的方法，所述方法包括向所述個體施用免疫有效量的一種或多種上述多肽。在一個特定實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列的多肽。在另一實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含與SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的多肽。在又一實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO 6或8的氨基酸序列的多肽。在一個特定實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含SEQID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的多肽。在另一實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含與SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少
            
98.5%,至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的多肽。在又一實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的多肽。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物為包含單個重配流感病毒的單價免疫原性組合物。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物為包含3個重配流感病毒的三價免疫原性組合物。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物為包含2個重配A型流感病毒和I個重配B型流感病毒的三價免疫原性組合物。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物為包含I個Hl型重配A型流感病毒、I個H3型重配A型流感病毒和I個重配B型流感病毒的三價免疫原性組合物。在另一實施方案中，本發明的免疫原性組合物為包含4個重配流感病毒的四價免疫原性組合物。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物為包含2個重配A型流感病毒和2個重配B型流感病毒的四價免疫原性組合物。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物為包含I個Hl型重配A型流感病毒、I個H3型重配A型流感病毒、I個Victoria譜系重配B型流感病毒和I個Yamagata譜系重配B型流感病毒的四價免疫原性組合物。在一個特定實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含編碼HA多肽的基因組片段的重配或重組流感病毒，所述HA多肽包含SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列。在另一實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含編碼HA多肽的基因組片段的重配或重組流感病毒，所述HA多肽包含與SEQ IDNO :6或8的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。在又一實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含編碼HA多肽的基因組片段的重配或重組流感病毒，所述HA多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQID NO :6或8的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含編碼HA多肽的基因組片段的重配或重組流感病毒，所述HA多肽包含SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列。在另一實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含編碼HA多肽的基因組片段的重配或重組流感病毒，所述HA多肽包含與SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。在又一實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含編碼HA多肽的基因組片段的重配或重組流感病毒，所述HA多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列。另外，本發明涵蓋包含編碼一種或多種上述多肽的基因組片段的重配流感病毒。此外，本發明涵蓋包含免疫有效量的此種重配流感病毒的免疫原性組合物。用于刺激個體的免疫系統以對流感病毒產生保護性免疫應答的方法也是本發明的一部分，所述方法包括施用免疫有效量的在生理學上可接受的載體中的此種重配流感病毒。在一個實施方案中，本發明的重配流感病毒為6 2重配病毒，包含來自一種或多種供體病毒(例如A/AA/6/60或A/Puerto Rico/8/34，更常稱為PR8)的6個內部基因組并且還包含2個基因組片段(通常并且優選編碼HA和NA或其片段)。包含此重配(重組)病毒的免疫原性組合物也是本發明的特征。在一個實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含A/AnnArbor/6/60的6個內部基因組片段和編碼HA多肽的基因組片段。所述HA多肽可包含具有至少一個取代、缺失或插入的SEQ ID NO : I的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有H273Y取代的SEQ ID NO I的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有D222G和/或Q223R取代的SEQ ID NO :1的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有至少一個選自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO :1的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60的6個內部基因組片段和編碼包含具有D222G、K119E和A186D取代的SEQ ID NO :1的氨基酸序列的HA多肽的基因組片段。在一個特定實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60的6個內部基因組片段和編碼包含具有Q223R和A186D取代的SEQ ID NO : I的氨基酸序列的HA多肽的基因組片段。在一個特定實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60的6個內部基因組片段和編碼包含具有Q223R、H273Y和A186D取代的SEQ ID NO : I的氨基酸序列的HA多肽的基因組片段。在一個特定實施方案中,本發明的重配或重組流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60的6個內部基因組片段和編碼包含SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列的HA多肽的HA基因組片段。在一個特定實施方案中，所述HA基因組片段可編碼包含與SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述HA基因組片段可編碼包含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述HA基因組片段可編碼包含SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述HA基因組片段可編碼包含與SEQ IDNO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述HA基因組片段可編碼包含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在一個實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含A/PuertoRico/8/34 (PR8)的6個內部基因組片段和編碼HA多肽的基因組片段。所述HA多肽可包含具有至少一個取代、缺失或插入的SEQ ID N0:1的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有D222G和/或Q223R取代的SEQ ID NO 1的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有至少一個選自K119E、K119N
            
和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO 1的氨基酸序列。所述HA多肽可包含具有H273Y取代的SEQ ID NO :1的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含A/Puerto Rico/8/34(PR8)的6個內部基因組片段和編碼包含具有D222G、K119E和A186D取代的SEQ ID NO :1的氨基酸序列的HA多肽的基因組片段。在一個特定實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含A/Puerto Rico/8/34 (PR8)的6個內部基因組片段和編碼包含具有Q223R和A186D取代的SEQ ID NO 1的氨基酸序列的HA多肽的基因組片段。在一個特定實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含A/Puerto Rico/8/34(PR8)的6個內部基因組片段和編碼包含具有Q223R、H273Y和A186D取代的SEQ ID NO 1的氨基酸序列的HA多肽的基因組片段。在一個特定實施方案中，本發明的重配或重組流感病毒包含A/Puerto Rico/8/34 (PR8)的6個內部基因組片段和編碼包含SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列的HA多肽的HA基因組片段。在一個特定實施方案中，所述HA基因組片段可編碼包含與SEQ IDNO :6或8的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述HA基因組片段可編碼包含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO :6或8的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述HA基因組片段可編碼包含SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述HA基因組片段可編碼包含與SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的HA多肽。在一個特定實施方案中，所述HA基因組片段可編碼包含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的HA多肽。包含編碼本發明的多肽的多聚核苷酸的重配流感病毒也在本發明內。在一個實施方案中，此重配病毒為6:2重配病毒，其包含來自一種或多種供體病毒(例如A/AA/6/60或A/Puerto Rico/8/34)的6個內部基因組片段、編碼本發明的血凝素多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。包含免疫有效量的此種重配/重組流感病毒的免疫原性組合物也在本發明的范圍之內。本發明的重配或重組病毒在組織培養物或含胚卵中顯示出高復制率。在一個實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約81og10PFU/ml> 至少約 8. 51og10PFU/ml> 至少約 91og10PFU/ml> 至少約 9. 51og10PFU/ml> 至少約 101og1(lPFU/ml、至少約 10. 51og1(lPFU/ml 或至少約 lllog1(lPFU/ml 的滴度。在另一實施方案中，重配或重組流感病毒生長到在組織培養物中至少約7. 51og1(lPFU/ml、至少約81og1(lPFU/ml、至少約 8. 51og1(lPFU/ml、至少約 91og1(lPFU/ml、至少約 9. 51og1(lPFU/ml、至少約101og1(lPFU/ml、至少約 10. 51og10PFU/ml 或至少約 lllog1(lPFU/ml 的滴度。還包括了通過培養本發明的錨定多聚核苷酸的宿主細胞來生成重配/重組流感病毒的方法。在本文的其它實施方案中，本發明包括具有免疫有效量的一種或多種本發明上述
            
重配流感病毒的免疫原性組合物。在一個實施方案中中，本發明的免疫原性組合物包含本發明的活病毒。其它實施方案包括用于刺激個體的免疫系統以對流感病毒產生保護性免疫應答的方法，所述方法包括向所述個體施用免疫有效量的一種或多種上述重配流感病毒(任選在生理學上有效的載體中)。本發明還涵蓋包含本發明的重組或重配流感病毒的疫苗。在一個實施方案中，本發明的疫苗為裂解疫苗或滅活疫苗。在另一實施方案中，本發明的疫苗為減毒流感病毒活疫苗。在又一實施方案中，本發明的疫苗可為單價、二價、三價或四價疫苗。本發明還包括生產流感病毒疫苗的方法。在一個實施方案中，本發明的疫苗可為單價、二價、三價或四價疫苗。本發明還涉及用于提高例如在雞含胚卵和/或細胞培養物中流感病毒的復制能力的方法和組合物。本發明部分基于與復制能力提聞相關的特定Hl蛋白質氣基酸的鑒定。通過使用編碼包含一種或多種這些特定氨基酸的Hl HA蛋白質的Hl HA基因，可實現流感病毒產量的提高。在一個實施方案中，提供了一種用于提高重配或重組流感病毒的復制能力的方法，所述方法包括改變在與SEQ ID NO : I的氨基酸殘基位置119或186相對應的位置上的血凝素多肽的氨基酸殘基，從而提高所述重配或重組流感病毒的復制能力。還提供了通過所述方法生成的重組流感病毒。本發明還涉及用于提高例如在雞含胚卵和/或細胞培養物中HlNl重配流感病毒的復制能力的方法和組合物。在一個實施方案中，提供了用于提高HlNl重配或重組流感病毒的復制能力的方法，包括改變在與SEQ ID NO :1的氨基酸殘基位置119或186相對應的位置上的血凝素多肽的氨基酸殘基，從而提高所述重配或重組流感病毒的復制能力。還提供了通過所述方法生成的一種重組流感病毒。在一個實施方案中，相對于在相同位置上不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，包含具有非天然存在的氨基酸的本發明血凝素多肽的本發明重配或重組流感病毒的復制能力提高至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少50倍或至少100倍。在另一實施方案中，相對于在相同位置上不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，包含具有非天然存在的氨基酸的本發明血凝素多肽的本發明重配或重組流感病毒的復制能力提高2至10倍、2至20倍、2至40倍、2至100倍、5至10倍、5至20倍、5至40倍或5至100倍。
            
在一個實施方案中，相對于在相同位置上不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，包含具有非天然存在的氨基酸的本發明血凝素多肽的本發明重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少50倍或至少100倍。在另一實施方案中，相對于在相同位置上不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，包含具有非天然存在的氨基酸的本發明血凝素多肽的本發明重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至10倍、2至20倍、2至40倍、2至100倍、5至10倍、5至20倍、5至40倍或5至100倍。在一個特定實施方案中，提供了一種重組流感病毒，其包含HlNl病毒的HA多肽，所述多肽包含選自K119E、K119N和A186D的氨基酸。在一個特定實施方案中，提供了一種重組流感病毒，其包含HlNl病毒的HA多肽，所述多肽包含選自K119X和A186X的氨基酸，其中X為所述HlNl病毒中的任一非天然存在的氨基酸。在一個特定實施方案中，本發明的重組流感病毒為6:2重配病毒，其包含減毒病毒的至少5個或6個片段(或源自所述減毒病毒的至少5個或6個片段)。在一個特定實施方案中，本發明的重組流感病毒為6:2重
            
配病毒，其包含選自 Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17的減毒病毒的至少5個或6個片段(或源自所述減毒病毒的至少5個或6個片段)。在一個特定實施方案中，本發明的重配流感病毒包含含SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列的HA多肽。在另一實施方案中，本發明的重組流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含與SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。在又一實施方案中，本發明的重組流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，本發明的重組流感病毒包含含SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列的HA多肽。在另一實施方案中，本發明的重組流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含與SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%,至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。在又一實施方案中，本發明的重組流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，本發明的重組流感病毒為包含本發明的HA多肽的6:2或7:1重配病毒。在一個特定實施方案中，本發明的重組流感病毒為6:2或7:1重配病毒，其包含本發明的HA多妝和選自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57和A/Leningrad/17的減毒病毒的至少5個或6個片段(或源自所述減毒病毒的至少5個或6個片段)。在一個實施方案中，本發明的重組流感病毒包含具有I、2或3個取代(例如在位置119、186上)的A/CA/04/09或A/CA/07/09的HA多肽(或源自所述A/CA/04/09或A/CA/07/09的HA多肽)。在一個實施方案中，本發明的重組流感病毒包含在氨基酸位置119處具有谷氨酸或天冬酰胺且在位置186具有天冬氨酸的A/CA/04/09或A/CA/07/09的HA多肽(或源自所述A/CA/04/09或A/CA/07/09的HA多肽)。在一個實施方案中，本發明的重組流感病毒包含在氨基酸位置119和位置186處有氨基酸取代的A/CA/04/09 或 A/CA/07/09 的 HA 多肽(或源自所述 A/CA/04/09 或 A/CA/07/09 的 HA 多肽)。在一個實施方案中，本發明的重組流感病毒包含在氨基酸位置119和位置186處有氨基酸取代的HlNl豬流感病毒的HA多肽(或源自所述HlNl豬流感病毒的HA多肽)。在一個特定實施方案中，本發明的重組流感病毒包含含SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列的HA多肽。在另一實施方案中，本發明的重組流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含與SEQ ID N0:6或8的氨基酸序列有至少95 %、至少98 %、至少98. 5 %、至少99 %、至少99. 2 %、至少99. 4 %、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。在又一實施方案中，本發明的重組流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，本發明的重組流感病毒包含含SEQ IDNO :6或8的殘基
            
1-327的氨基酸序列的HA多肽。在另一實施方案中，本發明的重組流感病毒包含HA多肽，所述HA多肽包含與SEQID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。在又一實施方案中，本發明的重組流感病毒包含HA多肽，所述
            
HA多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO :6或8的殘基1-327的氨基酸序列。本領域的技術人員將認識到氨基酸的精確位置可根據本發明的所述載體、方法和病毒中使用的特定流感株而改變。例如，特定流感株的HA蛋白在編碼所述HA蛋白的HA基因中可包含插入或缺失，使得例如在所述特定流感株的HA蛋白的殘基93或97處發現與SEQID NO 1的位置119相對應的位置。尤其，如表3所示，A/CA/07/09HA多肽(SEQ ID NO I)的位置119和186分別與A/South Dakota/6/07HlHA多肽的位置118和185相對應。本領域的技術人員使用本領域的常規技術可容易地認識到特定氨基酸位置是否與改變時與復制能力提高有關的位置相對應。此種常規技術之一為使用本領域可用的算法比對SEQ IDNO 1和特定流感株HA多肽的氨基酸序列。結合附圖
            
和權利要求閱讀以下詳述時本發明的這些及其它目標和特征將更加顯而易見。附圖簡述圖I選自MDCK細胞的變異體和含引入的氨基酸變化的指示變異體的空斑形態(A)。對在33°C下孵育4天的MDCK細胞進行空斑測定，并且用抗A型流感病毒的多克隆抗血清進行免疫染色。圖B中比較雙重突變體V5-119E/186D的空斑形態與單個119E和186D突變體。圖2A/California/7/09> A/Swine/Iowa/1/1976 (核苷酸序列登記代石馬CY022069)、A/Swine/1931 (核苷酸序列登記代碼 CY009628)和 A/South Dakota/6/07 的 HAl蛋白質序列比較。在位置119、153、154、155、186和278上的氨基酸突出顯示。圖3從含胚卵純化的病毒制劑的蛋白質組成。圖4從含胚卵純化的病毒制劑的蛋白質組成。圖5在(A)48h和(B)60h從含胚卵收獲的純化病毒制劑的蛋白質組成。圖6由在含胚卵中由兩種重配HlNl病毒生成的HAl蛋白質的定量比較。定義
            
除非另外定義，本文所使用的所有技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同意思。以下定義補充本領域的定義并且針對本申請，并且不必歸于任一相關或不相關的案例，例如任一共有專利或申請。雖然與本文所述方法和材料相似或等效的任何方法和材料可用于實踐中用于測試本發明，但本文描述了優選材料和方法。因此，本文所使用的術語僅僅是為了描述特定實施方案，并非旨在限制。全文定義并描述了另外的術語。在兩種核酸或多肽(例如，編碼HA或NA分子的DNA，或HA或NA分子的氨基酸序列)的情況下，短語“大致相同”指如使用序列比較算法或通過肉眼檢查測定，比較和比對最大一致性時,兩個或或更多個序列或子序列具有至少約90%、優選91%、最優選92%、93%,94%,95%,96%,97%,98%,98. 5%,99%,99. 1%,99. 2%,99. 3%,99. 4%,99. 5%,
            
99.6%,99. 7%,99. 8%,99. 9%或更高的核苷酸或氨基酸殘基同一性。關于多肽的術語“變異體”指相對于參考序列改變了一個或多個氨基酸的氨基酸
            
序列。所述變異體可具有“保守”變化，其中經取代氨基酸具有相似結構或化學性質，例如異亮氨酸代替亮氨酸。可選地，變異體可具有“非保守”變化，例如色氨酸代替甘氨酸。相似較小變化也可包括氨基酸缺失或插入或二者。使用本領域熟知的計算機程序，例如DNASTAR軟件可找到確定哪些氨基酸殘基可被取代、插入或缺失而不喪失生物或免疫活性的指導。本文還描述了保守取代的實例。本發明的“神經氨酸酶”多肽表現出與來自流感病毒的一種或多種已知神經氨酸酶分子的免疫交叉反應性。文獻中充滿此類已知神經氨酸酶的實例(例如,在GenBank、來自CDC的出版物等中)。相似地，本發明的“血凝素”多肽可表現出與來自流感病毒的一種或多種已知血凝素分子的免疫交叉反應性。并且，文獻中充滿此類已知血凝素分子的實例。基因還包括非表達核酸片段，例如形成其它蛋白質的識別序列的非表達核酸片段。非表達調節序列包括“啟動子”和“增強子”，調節蛋白(例如轉錄因子)結合“啟動子”和“增強子”，引起相鄰或鄰近序列的轉錄。“組織特異性”啟動子或增強子是調節特異性組織類型或細胞類型的轉錄的啟動子或增強子。“基因表達”或“核酸表達”通常指DNA轉錄為RNA (任選地包括RNA修飾，例如剪接)或RNA轉錄為mRNA、RNA翻譯為多肽(可能包括多肽的后續修飾，例如翻譯后修飾)或如上下文所示的轉錄和翻譯。“開放閱讀框”或“0RF”為DNA或RNA(例如基因)的可能翻譯閱讀框，所述閱讀框能夠被翻譯為多肽。即，所述閱讀框未被終止密碼子中斷。然而，應注意術語ORF未必指實際上翻譯為多肽的多聚核苷酸。術語“載體”指可通過其在生物體、細胞或細胞組分之間傳播和/或轉移核酸的工具。載體包括自主復制或可整合至宿主細胞的染色體中的質粒、病毒、噬菌體、前病毒、噬菌粒、轉座子、人工染色體等。載體還可為非自主復制的裸露RNA多聚核苷酸、裸露DNA多聚核苷酸、由相同鏈中DNA和RNA組成的多聚核苷酸、多聚賴氨酸結合的DNA或RNA、肽結合的DNA或RNA、脂質體結合的DNA等。在多數(但非全部)常見實施方案中，本發明的所述載體為質粒。“表達載體”為能夠促進并入其中的核酸的表達以及復制的載體，例如質粒。通常，待表達的核酸“可操作地連接”啟動子和/或增強子，并且受所述啟動子和/或增強子的轉錄調節控制。“雙向表達載體”的特征是相對于位于兩啟動子之間的核酸兩個選擇性啟動子相反方向定向，以致可朝兩個方向開始表達，引起例如正(+)鏈或有義鏈和負(_)鏈或反義鏈RNA轉錄。在本發明的上下文中，術語“分離的”是指大體上不含其天然存在的環境中通常伴隨或與之相互作用的組分的生物材料(例如病毒、核酸或蛋白質)。所述分離的生物材料任選地包含在其天然環境(例如，細胞或野生型病毒)中所述生物材料未發現具有的另外的材料。例如，如果所述材料處于其天然環境(例如細胞)中，所述材料可能已經置于對在那種環境中發現的這種材料來說非天然的細胞中的一個部位(例如基因組或基因成分)。例如，如果通過非天然存在的方式將天然存在的核酸(例如，編碼序列、啟動子、增強子等)引入至對該核酸來說非天然的基因組(例如，載體(例如質粒或病毒載體)或擴增子)的基因座，那么所述天然存在的核酸被分離。此類核酸也被稱為“異源”核酸。分離的病毒處于不同于野生型病毒的天然環境(例如，感染個體的鼻咽部)的環境中(例如細胞培養系統
            
或從細胞培養物中純化)。在提及病毒時，術語“嵌合”或“嵌合體”指病毒包括源自一種以上的親本病毒株或來源的基因和/或多肽組分。相似地，提及病毒蛋白時，術語“嵌合”或“嵌合體”指蛋白質包括源自一種以上的親本病毒株或來源的多肽組分(即，氨基酸子序列)。如本文中顯而易見，此類嵌合病毒通常為重配/重組病毒。因此，在一些實施方案中，嵌合體可任選地包括(例如)來自置于由B流感病毒(例如，B/AA/1/66等)組成或構建或源自B流感病毒的骨架中的A流感病毒的(例如HA和/或NA)序列或置于A流感病毒骨架(即，供體病毒)(例如，A/AA/6/60等)中的B流感病毒序列。術語“重組體”指已通過人為干預而人工或合成(非天然)改變的材料(例如，核酸或蛋白質)。可對處于或從天然環境或狀態移除的材料進行改變。特別地，例如，通過重組核酸表達生成流感病毒時，該流感病毒為重組體。例如，“重組核酸”為(例如)在克隆、DNA改組或其它步驟期間通過重組核酸或通過化學或其它誘變制備的核酸；“重組多肽”或“重組蛋白質”為通過重組核酸表達生成的多肽或蛋白質；和通過重組核酸表達生成“重組病毒”，例如重組流感病毒。提及病毒(本文中通常為流感病毒)時，術語“重配體”指包括源自一種以上的親本病毒株或來源的基因和/或多肽組分。例如，7:1重配體包括源自第一親本病毒的7個病毒基因組片段(或基因片段)和例如編碼本文所述血凝素或神經氨酸酶的單個互補病毒基因組片段。6:2重配體包括6個基因組片段(最常見的是來自第一親本病毒的6個內部基因組片段)和2個互補片段(例如，來自一個或多個不同親本病毒的血凝素和神經氨酸酶基因組片段)。根據本文的上下文，重配病毒也可稱為“嵌合”和/或“重組體”。提及異源或分離的核酸時，術語“引入”指將核酸并入真核或原核細胞，其中可將核酸并入所述細胞的基因組(例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中。所述術語包括如“感染”、“轉染”、“轉化”和“轉導”等方法。在本發明的上下文中，可采用各種方法將核酸引入細胞，所述方法包括電穿孔、磷酸鈣沉淀、脂質介導的轉染(脂質轉染)等。術語“宿主細胞”指含異源核酸(例如載體或病毒)并支持所述核酸復制和/或表達的細胞。宿主細胞可為原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細胞(例如酵母、昆蟲、兩棲動物、鳥類或包括人細胞的哺乳動物細胞)。示例性宿主細胞可包括例如Vero (非洲綠猴腎)細胞、BHK(幼倉鼠腎)細胞、雞原腎(PCK)細胞、馬-達氏犬腎(MDCK)細胞、馬-達氏牛腎(MDBK)細胞、293細胞(例如，293T細胞)和COS細胞(例如，C0S1、C0S7細胞)等。在其它實施方案中，宿主細胞可任選地包括卵(例如雞蛋、雞含胚卵等)。流感病毒的“免疫有效量”是足以增強個體(例如，人)對隨后暴露于流感病毒的自身免疫應答的量。例如，可通過(例如)空斑中和、補體結合、酶聯免疫吸附或微量中和檢測測量中和分泌和/或血清抗體的量來監控誘導的免疫水平。對流感病毒的“保護性免疫應答”指個體隨后暴露于野生型流感病毒或感染野生型流感病毒時個體(例如，人)表現出的預防疾病的免疫應答。在一些情況下，所述野生型(例如，自然循環)流感病毒仍可引起感染，但不會引起嚴重或威脅生命的感染。通常，保護性免疫應答產生可檢水平的宿主產生的血清和分泌抗體，能夠中和體外和體內相同菌株和
            
/或亞群的病毒(也可能為不同非疫苗株和/或亞群的病毒)。如本文所使用的“抗體”為包含大體上或部分由免疫球蛋白基因或其片段編碼的一個或多個多肽的蛋白質。所識別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區基因以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為K或λ。重鏈分為Y、μ、α、δ或ε，其依次分別定義免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE類。典型免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚物。每個四聚物由兩對相同多肽鏈組成，每對多肽鏈具有一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。每條鏈的N端界定約100至110或更多個主要負責抗原識別的氨基酸的可變區。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。抗體以完整免疫球蛋白或通過用各種多肽酶消化而產生的大量良好表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化鉸鏈區中二硫鍵下的抗體而生成F(ab)，2,Fab的二聚體其本身為通過二硫鍵與VH-CHl連接的輕鏈。可在溫和條件下還原F(ab) ' 2以斷開鉸鏈區中的二硫鍵，從而將(FaV )2 二聚體轉化為FaY單體。FaV單體基本上為具有部分鉸鏈區的Fab (其它抗體片段的更多詳細描述參見Fundamental Immunology, ff. E. Paul編，RavenPress,N. Y. (1999))。雖然根據完整抗體的消化定義各種抗體片段，但技術人員應了解可經化學或利用重組DNA方法重新合成此類Fab'片段。因此，如本文所使用的術語抗體包括通過修飾全抗體生成的或使用重組DNA方法重新合成的抗體或片段。抗體包括(例如)多克隆抗體、單克隆抗體、多鏈或單鏈抗體和人源化抗體或嵌合抗體，所述多鏈或單鏈抗體包括其中可變重鏈和可變輕鏈(直接或通過多肽連接子)連在一起形成連續多肽的單鏈Fv(sFv或scFv)抗體。流感病毒本發明的多肽和多聚核苷酸為流感HA和/或NA序列的變異體。參見，例如，下圖I和2中的序列表。通常，流感病毒由含分段單鏈RNA基因組的內部核糖核蛋白核心和襯有基質蛋白的外部脂蛋白包膜組成。流感病毒的基因組由編碼免疫原性血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)蛋白質的直㈠鏈核糖核酸(RNA)的8個片段，和6個內部核心多肽核殼體核蛋白(NP)、基質蛋白(M)、非結構蛋白(NS)和3個RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)蛋白。復制期間，將基因組病毒RNA轉錄到在宿主細胞核中的(+)鏈信使RNA和(-)鏈基因組cRNA。所述8個基因組片段的每一個均被裝配到除了包含RNA以外還包含NP和聚合酶復合體(PB1、PB2和PA)的核糖核蛋白復合體中。血凝素分子由表面糖蛋白組成并且起結合宿主細胞表面受體上的也稱為唾液酸的N-乙酰神經氨酸(NeuNAc)的作用。在本文的一些實施方案中，本發明的多肽(和由本發明的多聚核苷酸編碼的多肽)可起結合體外或體內NeuNAc的作用。在一些實施方案中，保持血凝素活性的血凝素片段也可起這種作用。血凝素由兩個亞基HAl和HA2組成，并且整個結構的長度為約550個氨基酸和約為220kD。神經氨酸酶分子從流感病毒的細胞表面受體裂解末端唾液酸殘基，從而從感染細胞釋放病毒粒子。神經氨酸酶還從新造血凝素和神經氨酸酶分子中去除唾液酸。在本文的一些實施方案中，本發明的所述多肽(和由本發明的多聚核苷酸編碼的多肽)可起裂解體外或體內唾液酸殘基的作用。在一些實施方案中，保持神經氨酸酶活性的神經氨酸酶片段也可起這種作用。本發明的所述神經氨酸酶多肽表現出與來自流感病毒的一種或多種已知神經氨酸酶的免疫交叉反應。文獻中充滿此類已知神經氨酸酶的實例(例如，在GenBank、來自CDC的出版物等中)。相似地，本發明的所述血凝素多肽表現出與來自流感病毒的一種或多種已知血凝素分子的免疫交叉反應性。再次，文獻中充滿此類已知血凝素分子的實例。流感通常分為A類流感和B類流感以及通常次要的C類流感。A型流感和B型流
            
感病毒各自含具有負極性的8個單鏈RNA片段。A型流感基因組編碼11種多肽。片段1-3編碼組成RNA依賴型RNA聚合酶的3個多肽。片段I編碼聚合酶復合蛋白PB2。其余聚合酶蛋白PBl和PA分別由片段2和片段3編碼。另外，一些流感株的片段I編碼由PBl編碼區內的選擇性閱讀框生成的小分子蛋白PB1-F2。片段4編碼涉及感染期間細胞附著和進入的血凝素(HA)表面糖蛋白。片段5編碼核殼體核蛋白(NP)多肽，與病毒RNA相關的主要結構組分。片段6編碼神經氨酸酶(NA)包膜糖蛋白。片段7編碼由差別剪接mRNA翻譯的兩種基質蛋白(標為Ml和M2)。片段8編碼由選擇性剪接mRNA變異體翻譯的兩種非結構蛋白NSl和NS2。所述B型流感的8個基因組片段編碼11種蛋白。最大的3個基因編碼RNA聚合酶的組分PBl、PB2和PA。片段4編碼HA蛋白。片段5編碼NP。片段6編碼NA蛋白和NB蛋白。NA和NB兩種蛋白均由雙順反子mRNA的重疊閱讀框翻譯。病毒B的片段7也編碼兩種蛋白M1和BM2。最小片段編碼兩種產物由全長RNA翻譯成NSl，而由剪接mRNA變異體翻譯成NS2。A型和B型流感通常與人類種群中的流感爆發有關。然而，A型流感也感染其它物種，例如鳥類、豬和其它動物。根據其血凝素和神經氨酸酶表面糖蛋白抗原中的差別將A型病毒分為亞型。A型病毒中的血凝素有16個已知亞型并且神經氨酸酶有9個已知亞型。在人類中，目前僅已知約4種不同血凝素和2種不同神經氨酸酶亞型，例如H1、H2、H3、H5、N1和N2。尤其，A型流感的兩種主要亞型即HlNl和H3N2已在人中起作用。然而，最近H1N2受到關注。根據其血凝素和神經氨酸酶蛋白未將B型流感病毒分為亞型。根據例如流感凝集血紅細胞(RBC或紅血球)的能力可對不同流感株分類。對特定流感株有特異性的抗體可結合所述病毒并且從而防止這種凝集。根據這種抑制確定菌株類型的檢測通常稱為血凝素抑制檢測(HI檢測或HAI檢測)并且是本領域表征流感株的標準已知方法。當然，本領域的技術人員將熟悉其它檢測，例如ELISA、間接熒光抗體檢測、免疫組織化學法、蛋白免疫印跡檢測等，通過這些檢測標準流感株，不必將本文對HI檢測的討論看作限制。簡言之，在典型HI檢測中，將雪貂中常生成的用于分型或分類的血清加入各種稀釋度(例如，2倍等)的紅血球樣品中。然后不管紅血球凝結在一起(即，凝集)還是懸浮(即，非凝集)均進行光學測定。如果細胞未凝結，由于血清中對所述流感有特異性的抗體的抑制，不會發生凝集。因此，所述類型的流感定義為存在于相同菌株中。在一些情況下，將一種菌株描述為與其它菌株相似，例如，菌株X為“y樣”菌株等。例如，通過HI檢測測定，兩種樣品的滴度互成4倍，則可將這兩種樣品描述為屬于相同菌株(例如，均屬于“NewCaledonia”株或均屬于“Moscow樣”株等)。換言之，菌株通常根據其免疫或抗原方面分類。通常將HAI滴度定義為完全抑制血凝集的最高血清稀釋度。參見，例如Schild等，Bull.Wld Hlth Org.，1973，48 :269-278等。并且，本領域的技術人員十分熟悉將流感分類和分級為菌株以及分類和分級的方法。由上文應了解本發明不僅包括本文所列特異性序列，還包括各種載體(例如，用于質粒重配和救援的載體，參見下文)內的這種序列以及在與本文所列序列相同的菌株內的血凝素和神經氨酸酶序列。同樣，還包括各種載體(例如，通常用于質粒重配和救援的載體，例如 A/Ann Arbor/6/60 或 B/Ann Arbor/1/66、A/Puerto Rico/8/34、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55
            
或B/England/2608/76等)內的這種相同菌株。如本文所使用的術語“相似株”應用于指與第二流感病毒相同或相關株的第一流感病毒。在典型實施方案中，通常通過使用HAI檢測確定這種相關性。因此，HAI檢測中滴度互成4倍的流感病毒為“相似株”。然而，本領域的技術人員將熟悉其它檢測(例如)FRID、中和檢測等以確定相似株。本發明還包括本文各種質粒、載體、病毒、方法等中的這種相似株(即，與本文序列表中存在的菌株相似的菌株)。因此，除非上下文清楚指出，本文中特定序列(例如，所述序列表中的序列)或其片段的描述也應被視為包括來自與那些相似的菌株(即，與具有本文那些質粒、載體、病毒等中的序列的那些菌株相似的菌株)的序列。同樣，因此應了解“相似株”之間比較時，這種相似株內的NA和HA多肽為“相似多肽”。流感病毒疫苗本文的序列、組合物和方法主要但并非僅涉及生產用于疫苗的流感病毒。在歷史上，主要使用所選病毒株或根據相關菌株的經驗性預測在雞含胚卵中生產流感病毒疫苗。最近，在經核準的減毒、溫度敏感主菌株的情況下，已生產并入所選的血凝素和/或神經氨酸酶抗原的重配病毒。通過在雞蛋中多次傳代培養病毒之后，回收流感病毒并任選(例如)使用甲醛和/或β-丙內酯滅活(或可選地用于減毒活疫苗)。因此，應了解HA和NA序列(如本發明中的HA和NA序列)在構建流感疫苗中十分有用。在細胞培養物中生成重組和重配疫苗的嘗試受一些經核準用于疫苗生產的菌株在標準細胞培養條件下不能有效生長的阻礙。然而，發明人及其同事先前的工作提供了在培養時生成重組和重配病毒的載體系統和方法，從而使得可能快速生成疫苗，所述疫苗相應于病毒的一種或多種所選抗原株，例如包含本文HA和NA序列的A或B株、各種亞型或次代株等。參見，2002年10月23日提交的美國申請第60/420，708號、2003年4月25日提交的美國申請第10/423，828號和2004年5月24日提交的美國申請第60/574，117號，全部所述申請的標題均為“Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus (用于生產流感病毒的多質粒系統)”。通常，在使用溫度調節器(例如恒溫器)以確保溫度不超過35°C的恒溫下在受控制的濕度和CO2的條件下，將培養物保存在系統例如細胞培養恒溫箱中。通過引入相應于主流感病毒的基因組片段的載體的亞組與源自目標株(例如，本文的HA和NA抗原變異體)的互補片段的組合，可易于獲得重配流感病毒。通常，根據與疫苗施用有關的所需性質選擇主菌株。例如，對于疫苗生產，例如對于減毒活疫苗生產，可選擇減毒表現型、冷適應和/或溫度敏感的主供體病毒株。如本文別處所說明和例如在美國專利申請第10/423,828號等中，本發明的各種實施方案中利用A/AnnArbor (AA)/6/60或 B/Ann Arbor/1/66 或 A/Puerto Rico/8/34 或 B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69,B/Leningrad/179/86,B/Leningrad/14/55 或 B/England/2608/76 流感株作為“骨架”，在所述流感株上添加HA和/或NA基因(例如，本文所列的那些序列等)以生成所需重配病毒。因此，例如在6:2重配體中，2個基因(即，NA和HA)來自需要對其產生免疫原性反應的流感株，而其它6個基因來自Ann Arbor株或其它骨架病毒株等。Ann Arbor病毒對于其冷適應、減毒、溫度敏感屬性有用。當然，應了解本文的HA和NA序列能夠與許多其它病毒基因或病毒類型(例如，含重配體中存在的其它流感基因(即，非HA和非NA基因)的許多不同“骨架”(例如A/Puerto Rico/8/34等))重配。最近美國批準了抗人流感病毒的減毒A型流感病毒活疫苗。參見上文。這種疫苗為重配HlNl和H1N2病毒，其中A/AnnArbor (AA) / 6/60 (H2N2)冷適應(ca)病毒的內部蛋白基因使重配病毒(即，具有來自非Ann
            
Arbor株的血凝素和神經氨酸酶基因的重配病毒)具有AA ca病毒的冷適應、減毒和溫度敏感表現型。在本文的一些實施方案中，重配體也可包括7:1重配體。換言之，僅HA或NA不是來自骨架或MDV病毒株。據報道,先前的工作報道有任選在本發明各種實施方案中的適合的骨架供體病毒株。參見，例如，2002年10月23日提交的美國申請第60/420，708號、2003年4月25日提交的美國申請第10/423,828號和2004年5月25日提交的美國申請第60/574，117號,全部所述申請的標題均為“Multi-Plasmid System for the Productionof Influenza Virus (用于生產流感病毒的多質粒系統)” ;Maassab等，J. of Inf. Dis.,1982，146 :780-790 ；Cox 等，Virology, 1988，167 :554-567 ；ffareing 等，Vaccine, 2001，19 3320-3330 ；Clements 等，JInfect Dis.，1990，161 (5) :869-77 等。在一些實施方案中，本文所述的序列可任選地使特定區域去除(在核酸序列或氨基酸序列二者中或在任一核酸序列或氨基酸序列中)。例如，對于具有多堿價裂解位點的那些分子而言，可任選去除這些位點。在本文的一些實施方案中，與野生型序列相比這些裂解部位的序列(例如)被修飾或改變(例如，以使得不能裂解或減少其裂解等)，其中裂解序列源自野生型序列。在不同菌株或序列中，由于起始序列中裂解位點的各個序列，這些修飾/改變可不同。例如，在一些HA序列中通常將4個多堿殘基(RRKK)去除(與wt相比)。在各種實施方案中，可通過多種方式(其全部包括在本發明中)修飾這些多堿價裂解位點。例如，多堿價裂解位點可一次去除一個氨基酸(例如，去除I個R、去除2個R、去除RRK或去除RRKK)。另外，也可去除或改變裂解位點直接上游的氨基酸殘基(例如，從R改為T等)；同樣，也可修飾編碼裂解位點直接下游的氨基酸殘基的核苷酸。本領域的技術人員將熟悉去除這些特異性區域的各種方法。所生成的截短序列也包含在本發明中。參見，例如，Li等，J. of Infectious Diseases, 179 :1132-8,1999。本領域熟知適用于任選地涵蓋本序列的病毒(通常用作疫苗或用于疫苗生產)的術語“溫度敏感”、“冷適應”和“減毒”。例如，術語“溫度敏感”(ts)指(例如)對A型流感株而言相對于33 □下，病毒在39 □下表現出滴度降低100倍或更多，或對B型流感株而言相對于33 □下，病毒在37 □下表現出滴度降低100倍或更多。術語“冷適應”(ca)指病毒表現出在25 □下的生長是在33 □下生長的100倍以內，而術語“減毒”(att)指病毒在雪貂的上呼吸道復制，但在肺部組織中不可檢測，并且不會引起動物流感樣疾病。應了解，具有中間表現型的病毒，即表現出在39 口(對于A株病毒而言)或37 口(對于B株病毒而言)下的滴度降低100倍以下或在25 □下的生長比在33 □下的生長快100倍(例如，在200倍、500倍、1000倍以內、10，000倍以下)和/或表現出與在雪貂上呼吸道內的生長相比在肺部中的生長減慢(即，部分減毒)和/或減少動物流感樣疾病的病毒也是有用的病毒并且可與本文的HA和NA序列聯合使用。因此，本發明可利用例如在適當培養條件下與在培養細胞中體內生成疫苗有關的所需性質(例如，減毒病原性或表現型、冷適應、溫度敏感等)的病毒株(A和B株流感病毒)的生長。可通過將并入克隆病毒基因組片段的多種載體引入宿主細胞，并且在不超過35°C的溫度下培養細胞來生產流感病毒。當轉染包括流感病毒基因組的載體時，通過標準純化方法可回收適于用作疫苗的重組病毒。使用本發明的載體系統和方法，可在組織培養物中
            
快速且有效地生產并入選擇具有對疫苗生產而言所需性質的病毒株的6個內部基因片段和來自所選(例如)病原株的免疫原性HA和NA片段(例如本文序列表中的那些片段)的重配病毒。因此,在重組和重配A型和B型流感病毒的細胞培養物中，本文所述系統和方法可用于快速生產，所述重配A型和B型流感病毒包括適于用作疫苗的病毒，所述疫苗包括減毒活疫苗，例如適于鼻內施用的疫苗。在這些實施方案中，通常選擇單個主供體病毒(MDV)株的每個A和B亞型。在減毒活疫苗的情況下，通常選擇主供體病毒株與疫苗生產有關的有利性質，例如溫度敏感、冷適應和/或減毒。例如，示例性主供體株分別包括A/Ann Arbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66的溫度敏感、減毒和冷適應株以及全文提到的其它菌株。例如，由組成病毒基因組的多種克隆病毒cDNA生成所選主供體A型病毒(MDV-A)或主供體B型病毒(MDV-B)。實施方案包括由8個克隆病毒cDNA生成的重組病毒。任選地將表示PB2、PBl、PA、NP、HA、NA、M和NS的所選MDV-A或MDV-B序列的8個病毒cDNA克隆至雙向表達載體，例如質粒(例如，PAD3000)中，使得可由來自一條鏈的RNA聚合酶I (polI)啟動子轉錄病毒基因組RNA，并且可由來自另一條鏈的RNA聚合酶II (pol II)啟動子合成病毒mRNA。任選地，任何基因片段均可被修飾，所述基因片段包括HA片段(例如，用于去除多堿基裂解位點(也稱為多堿價裂解位點))。將攜帶8個病毒cDNA的質粒轉染至適當宿主細胞(例如，VeiO細胞、共培養MDCK/293T或MDCK/C0S7細胞)之后可回收感染的重組MDV-A或MDV-B病毒。使用本文所述的質粒和方法，例如2002年10月23日提交的美國申請第60/420，708號、2003年4月25日提交的美國申請第10/423,828號和2004年5月24日提交的美國申請第60/574，117號，全部所述申請的標題均為“Multi-Plasmid System for the Production of InfluenzaVirus (用于生產流感病毒的多質粒系統)”;Hoffmann，E.，2000，PNAS，97 (11) :6108-6113 ；Hoffmann，美國公開專利申請第20020164770號；和Palese等，2003年4月8日發表的USPN6, 544，785，本發明對(例如)通過將所選病毒(例如，MDV-A, MDV-B)的6個內部基因(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)和源自不同相應類型(A或B)流感病毒(例如，如本文序列表所示)的HA和NA —起共轉染生成6:2重配流感疫苗是有用的。例如，如常規地進行疫苗生產，從病原相關H1、H3或B菌株有利地選出了 HA片段。相似地，HA片段可選自作為病原株的具有新出現的關聯性的菌株，例如本文序列表中所列片段。也可生產并入MDV的7個基因組片段和所選菌株的HA或NA基因的重配體(7:1重配體)。應了解，如全文所詳述，本發明的分子可任選地組合為任一所需組合物。例如，可將本文的HA和/或NA序列置于(例如)6:2重配體或7:1重配體等中的重配體骨架中，例如A/AA/6/60、B/AA/1/66、A/Puerto Rico/8/34 ( BP, PR8)等。因此，如以下更全面的解釋，存在來自供體病毒(再次例如A/AA/6/60等)的6個內部基因組片段和來自第二株(例如，野生型菌株，非供體病毒)的2個基因組片段。這2個基因組片段優選為HA和NA基因。7:1重配體中出現相似情況，然而其中存在來自供體病毒的7個基因組片段和來自不同病毒(通常為野生型或需要對其有免疫應答的類型)的I個基因組片段(HA或NA)。同樣，應了解在本文的不同實施方案中本文的序列(例如，圖I序列表中的那些序列等)可按不同方式組合。因此，在本文的任一序列可很少存在于7:1重配體中(即，本發明序列與7個供體病毒基因組片段一起存在)和/或可與6:2重配體中的本發明另一序列一起存在。在這種6:2重配體中，本發明的任一序列可任選地與本發明的任一其它序列一起存在。然而，典型的和優選的實施方案包括來自相同來源的野生型菌株(或經修飾野生型菌株，例如那些具有經修飾多堿價裂解位點的野生型菌株)的HA和NA。例如，典型的實施方案可包括具有來自供體病毒(例如
            
A/AA/6/60)的6個內部基因組片段和本文所述HA和NA基因組片段的6:2重配體。當然，同樣應了解本發明還包括這種重配病毒，其中HA和NA基因組片段來自相似病毒株。出于所有目的，例如尤其為了有關質粒、病毒(流感病毒)的質粒救援、用于病毒救援/生產的多質粒系統等的教導，特別將以上參考以其整體并入本文。再次，本發明的HA和NA序列任選地用于這種質粒重配疫苗(和/或其它ts、cs、ca和/或att病毒和疫苗)中。然而，應注意到本發明的HA和NA序列等不限于特異性疫苗組合物或生產方法，并且因此大體上可用于任何疫苗類型或疫苗生產方法中，所述方法利用菌株特異性HA和NA抗原(例如，本發明的序列)。
            
FLUMIST 如上所述，存在許多流感病毒的實例和類型。示例性流感疫苗為FluMist (Medlmmune Vaccines Inc. , Mt. View, CA),這是預防兒童和成人遭受流感疾病的減毒活疫苗(Belshe 等(1998)The efficacy of live attenuated, cold-adapted,trivalent， intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338 1405-12 ;Nichol 等(1999)Effectiveness of live, attenuated intranasal influenzavirus vaccine in healthy, working adults a randomized controlled trial JAMA282 :137-44)。在典型的和優選實施方案中，本發明的方法和組合物優選適于/用于生產FluMist疫苗。然而，本領域的技術人員應了解本文的序列、方法、組合物等也適于生產相似或甚至不同的病毒疫苗。FluMist疫苗株包含例如源自野生型菌株的HA和NA基因片段和來自常見主供體病毒(MDV)的6個基因片段？81、？82、 么、冊1和吧，其中疫苗導向野生型菌株(或在一些情況下，導向相關菌株)。因此，本文的HA和NA序列任選地為各種FluMist制劑的一部分。在接連降低的溫度下，通過在雞腎組織原代培養中系列傳代野生型A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60)菌株而生成 FluMist 流感 A 菌株的 MDV (MDV-A) (Maassab (1967) Adaptation andgrowth characteristics of influenza virus at 25 degrees CNature 213 :612-4)。MDV-A在25°C下有效復制(ca，冷適應)，但在38°C和39°C下其生長受到限制。另外，在受感染雪貂的肺部中該病毒不復制(att，減毒)。人們認為ts表現型通過在除呼吸道最冷區域外的全部區域限制疫苗的復制而有助于疫苗的減毒。在動物模型和臨床研究中已證明了這種性質的穩定性。與通過化學誘變生成的流感菌株的ts表現型相反，在感染的倉鼠或在來自兒童的排出分離物中傳代之后MDV-A的ts性質不會恢復(對于近期評論，參見Murphy &Coelingh(2002)Principles underlying the development and use of live attenuatedcold-adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol 15 :295-323)。對超過20，000成人和兒童進行涉及12種分離6:2重配株的臨床研究已顯示這些疫苗是減毒、安全、有效的(Belshe 等(1998)The efficacy of live attenuated,cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N EnglJ Med 338 :1405-12 ;Boyce 等(2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted andunadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasalIy to healthyadults Vaccine 19 :217-26 ;Edwards等(1994)A randomized controlled trial of cold
            
adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A diseaseJ Infect Dis 169 :68-76 ;Nichol 等(1999)Effectiveness of live, attenuatedintranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults a randomizedcontrolled trial JAMA 282:137-44)。攜帶MDV-A的6個內部基因和野生型病毒的兩個HA和NA基因片段的重配體(即，6:2重配體)始終保持ca、ts和att表現型(Maassab等(1982)Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferretsJ. Infect. Dis. 146 :780-900)。使用B型流感株生產這種重配病毒更加困難，然而最近研究(參見，例如，2002年10月23日提交的美國申請第60/420,708號、2003年4月25日提交的美國申請第10/423，828號和2004年5月24日提交的美國申請第60/574，117號，全部所述申請的標題均為 “Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus (用于生產流感病毒的多質粒系統)”)示出了用于完全來自克隆cDNA的B型流感病毒生成的8個質粒系統。還示出了用于適于疫苗制劑(例如用于鼻內施用的活病毒疫苗制劑)的A型和B型減毒流感活疫苗的生產方法。先前描述的系統和方法對在重組和重配A型和B型流感病毒的細胞培養物中進行快速生成是有用的，所述流感病毒包括適于用作疫苗的病毒，所述疫苗包括減毒活疫苗，例如適于鼻內施用的疫苗。本發明的序列、方法等任選地連同或組合涉及(例如)用于疫苗生產的重配流感病毒的先前研究一起使用以生產用于疫苗的病毒。預防性施用疫苗的方法和組合物如上所述，可選地或除了用于生產FluMist 疫苗以外，本發明還可用于其它疫苗制劑。通常，可預防性地施用免疫有效量的且在適當載體或賦形劑中的本發明重組和重配病毒以刺激由HA和/或NA序列確定的對一種或多種流感病毒株有特異性的免疫應答。通常，所述載體或賦形劑為藥學上可接受的載體或賦形劑，例如無菌水、含水鹽溶液、含水鹽緩沖液、含水葡萄糖溶液、含水甘油溶液、乙醇、來自未感染雞蛋的尿囊液(即，正常尿囊液或NAF)或其組合。根據本領域確定的方法實現這些溶液的制備，確保無菌、pH、等滲性和穩定性。通常，選擇載體或賦形劑以將過敏和其它非期望的作用降到最低并適應特定施用途徑，例如皮下、肌內、鼻內等。本發明的相關方面提供用于刺激個體的免疫系統以對流感病毒產生保護性免疫應答的方法。在所述方法中，向個體施用在生理上可接受的載體中的免疫有效量的重組流感病毒(例如，本發明的HA和/或NA分子)、免疫有效量的本發明多肽和/或免疫有效量的本發明核酸。通常，以足以刺激對一種或多種流感病毒株(即，對本發明的HA和/或NA菌株)有特異性的免疫應答的量施用本發明流感病毒。優選地，施用流感病毒引起對這些菌株的保護性免疫應答。本領域的技術人員已知引起對一種或多種流感株起保護性免疫應答的劑量和方法。參見，例如，USPN 5，922，326 ;Wright 等，Infect. Immun. 37 :397-400(1982) ；Kim等，Pediatrics 52:56-63(1973);和 Wright 等，J. Pediatr. 88 :931-936 (1976)。例如，提供約I-IOOOHID5ci (人感染劑量)范圍的流感病毒，即每劑量施用約105_108pfu (空斑形成單位)。通常，根據(例如)年齡、身體狀況、體重、性別、飲食、施用時間和其它臨床因素在此
            
范圍內調整劑量。例如通過使用針和注射器或無針注射裝置皮下或肌內注射全身性施用預防性疫苗制劑。可選地，以滴劑、大粒度氣霧劑(大于約IOym)或噴霧劑經鼻內將疫苗制劑施用至上呼吸道內。雖然以上任何遞送途徑均引起系統保護性免疫應答，但鼻內施用使得在流感病毒的進入部位引起粘膜免疫力的益處增加。對于鼻內施用，通常優選減毒病毒活疫苗，例如減毒、冷適應和/或溫度敏感的重組或重配流感病毒。參見上文。雖然優選用單次劑量刺激保護性免疫應答，可通過相同或不同途徑施用另外的劑量，以達到預期保護效果。通常，如用于疫苗中的本發明的減毒重組流感充分減毒，使得在經減毒流感病毒免疫(或以其它方式感染)的多數個體中不會出現感染癥狀或至少不會出現嚴重的感染癥狀。在一些情況下，減毒流感病毒仍然能夠產生輕微疾病(例如，輕微上呼吸道疾病)的癥狀和/或傳播給未接種疫苗的個體。然而，其毒性被充分消除，使得在接種疫苗的宿主或偶見宿主中不會出現嚴重的下呼吸道感染。可選地，可通過在離體或體內用包含本文所述序列的流感病毒靶向樹突細胞來刺激免疫應答。例如，將增殖樹突細胞暴露于足夠量的病毒中并且足夠長時間以使樹突細胞捕獲流感抗原。然后通過靜脈內移植法將細胞轉移到待接種疫苗的受治療者體內。雖然優選用單次劑量刺激保護性免疫應答，但還可通過相同或不同途徑施用另外的劑量，以達到預期保護效果。在新生兒和嬰兒中，例如，可能需要多次施用以引起足夠的免疫力水平。整個兒童時期可不時繼續施用，因為必須保持對野生型流感感染的足夠預防水平。相似地，尤其易受反復或嚴重流感感染的成人，例如衛生保健工作者、日托工作者、幼兒的家庭成員、老人和心肺功能受損的個體可能需要多次免疫以建立和/或維持保護性免疫應答。例如，可通過測定中和分泌抗體和血清抗體的量以及引起和維持預期預防水平所必須的調節劑量或重復接種來監控誘導的免疫力水平。任選地，作流感病毒預防性施用的制劑還含有一種或多種用于增強對流感抗原免疫應答的佐劑。適合佐劑包括完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂角苷、礦物膠(例如氫氧化鋁)、表面活性物質(例如溶血卵磷脂)、復合多元醇、聚陰離子、肽類、油或烴乳液、卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)和合成佐劑QS-21和MF59。
            
若需要，流感病毒的預防性疫苗施用可與一種或多種免疫刺激分子的施用一起進行。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增強和促炎活性的各種細胞因子、淋巴因子和趨化因子(例如白細胞間素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13))、生長因子(例如，粒細胞巨噬細胞(GM)-菌落刺激因子(CSF))和其它免疫刺激分子，例如巨噬細胞炎性因子、Flt3配體、B7. 1、B7.2等。免疫刺激分子可在與流感病毒相同的制劑中施用，或者可單獨施用。可施用蛋白質(例如，本發明的HA和/或NA多肽)或編碼所述蛋白質的表達載體以產生免疫刺激效果。上述方法通過將包含編碼治療或預防有效的HA和/或NA多肽(或肽)的異源多聚核苷酸或HA和/或NARNA (例如，反義RNA或核糖酶)的本發明載體引入在體外、離體或體內的靶細胞群中用于治療性和/或預防性治療疾病或病癥(通常為流感)。通常，編碼多肽(或肽)的多聚核苷酸或目標RNA可操作地連接適當的調節序列，例如本文所述調節序列。任選地，將一個以上異源編碼序列并入單個載體或病毒中。例如，除了編碼治療或預防活性的HA和/或NA多肽的多聚核苷酸或RNA以外，載體還包括另外的治療或預防性多肽(例如，抗原、協同刺激分子、細胞因子、抗體等)和/或標記物等。盡管為個體接種特定亞群的特定菌株的減毒流感病毒可誘導對不同菌株和/或亞群的流感病毒的交叉保護，但是，若需要，可通過為個體接種來自至少2種、至少3種或至少4種流感病毒株或次代株的減毒流感病毒來增強交叉保護，例如至少其中2種流感病毒株代表不同亞群。例如，為個體接種至少4種減毒流感病毒株或次代株可包括為個體接種至少2種A型流感病毒株或次代株和至少2種B型流感病毒株或次代株。為個體接種至少4種減毒流感病毒株或次代株可包括為個體接種至少3種A型流感病毒株或次代株和至少I種B型流感病毒株或次代株。為個體接種至少4種減毒流感病毒株或次代株可能需要施用單個四價疫苗，所述四價疫苗包含全部所述至少4種減毒流感病毒株或次代株。接種疫苗可能選擇性需要施用多種疫苗，每種疫苗包含I種、2種或3種減毒流感病毒株或次代株。另外，疫苗組合可任選地包括大流行疫苗和非大流行菌株的混合物。疫苗混合物(或多次接種疫苗)可包含來自人菌株和/或非人流感株(例如，鳥類和人等)的組分。相似地，本發明的減毒流感疫苗可任選地與誘導對其它感染物起保護性免疫應答的疫苗組合。在一個實施方案中，本發明的疫苗為包含3個重配流感病毒的三價疫苗。在一個實施方案中，本發明的疫苗為包含2個重配A型流感病毒和I個重配B型流感病毒的三價疫苗。在一個實施方案中，本發明的疫苗為包含I個Hl型重配A型流感病毒、I個H3型重配A型流感病毒和I個重配B型流感病毒的三價疫苗。在另一實施方案中，本發明的疫苗為包含4個重配流感病毒的四價疫苗。在一個實施方案中，本發明的疫苗為包含2個重配A型流感病毒和2個重配B型流感病毒的四價疫苗。在一個實施方案中，本發明的疫苗為包含I個Hl型重配A型流感病毒、I個H3型重配A型流感病毒、I個Victoria譜系重配B型流感病毒和I個Yamagata譜系重配B型流感病毒的四價疫苗。重組病毒的生產使用重組反向遺傳方法可基因工程化和回收負鏈RNA病毒(USPN 5，166，057，Palese等)。最初將這種方法應用于工程流感病毒基因組(Luytjes等(1989)Cell 59:1107-1113 ；Enami 等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :11563-11567)，并且已成功應用于各種分段和非分段負鏈RNA病毒，例如狂犬病(Schnell等(1994)EMB0 J. 13 4195-4203)、VSV (Lawson 等(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4477-4481)、麻疹病毒(Radecke 等(1995) EMBO J. 14 :5773-5784)、牛瘟病毒(Baron & Barrett (1997)J. Virol. 71 :1265-1271)、人副流感病毒(Hoffman & Banerjee(1997)J. Virol. 71 3272-3277 ;Dubin 等(1997) Virology 235 :323-332)、SV5 (He 等(1997) Virology 237 249-260)、犬瘟熱病毒(Gassen 等(2000) J. Virol. 74 :10737-44)和仙臺病毒(Park 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :5537-5541 ;Kato 等(1996)Genes to Cells I 569-579)。本領域的技術人員熟悉這些和相似技術，以生產包含本發明的HA和NA序列的流感病毒。正如包含一種或多種本發明的核酸和/或多肽的重組流感病毒，根據這些方法生產的重組流感病毒也是本發明的特征。當然，正如本領域的技術人員所了解，通常流感病毒(和本發明的流感病毒)為負鏈RNA病毒。因此，當本發明描述轉錄包含例如圖I的序列等的流感病毒時，應理解為通常指所述序列的相應負鏈RNA形式。圖I中的核苷酸序列包含基因的DNA形式(例如，編碼正義)(連同核苷酸序列中的一些未翻譯區域)。本領域的技術人員可容易地進行RNA和DNA序列之間的轉變(例如，將U變為T等)和互補核苷酸
            
序列(RNA或DNA)之間的轉變等。因此，例如，本領域的技術人員可容易地從核苷酸序列轉變為相應氨基酸序列或相應互補序列(DNA或RNA)等。同樣，明顯的是，當這種HA和/或NA序列描述為在DNA載體內(例如質粒等)內時，則通常可理解所述序列的相應DNA形式。并且,本發明的核酸包括本文序列表中的顯式序列以及該序列的互補序列(RNA和DNA)、序列表中的序列的雙鏈形式、序列表中的序列的相應RNA形式(如序列表中與顯式序列互補的RNA或序列表中的序列的RNA形式，例如有相同意義，但由RNA組成，用U代替T等)。細胞培養和表達宿主本發明還涉及引入(轉導、轉化或轉染)本發明的載體的宿主細胞和通過重組技術生產本發明的多肽。用載體，例如本發明的表達載體基因工程化(即，轉導、轉化或轉染)宿主細胞。如上所述，載體可呈質粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。適當表達宿主的實例包括細菌細胞(例如大腸桿菌、鏈霉菌屬(Streptomyces)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium))、真菌細胞(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichia pastoris)和粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa))或昆蟲細胞(例如果蜆(Drosophila)和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))。最常見的是，將哺乳動物細胞用于培養本發明的HA和NA分子。適于流感病毒復制的宿主細胞(例如，具有本文的HA和/或NA序列)包括(例如)Veix)細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞和COS細胞(包括293T細胞、C0S7細胞等)。一般地，按例如I : I的比例采用包括以上兩種細胞系(例如MDCK細胞和293T或COS細胞)的共同培養物以提高復制效率。通常，在適于維持中性緩沖pH(例如，pH為7. 0至7. 2)的受控濕度和CO2濃度下，在標準商用培養基(例如補充血清(例如，10%胎牛血清)的達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco，s modified Eagle’s medium))或無血清的培養基中培養細胞。任選地，培養基含有防止細菌生長的抗生素(例如，青霉素、鏈霉素等)和/或另外的營養素(例如L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸)、促進有利生長特征的另外的添加物(例如，胰島素、￠-巰基乙醇)等。可在(例如)通過病毒的產生而改良為適于活化啟動子、選擇轉化體或擴增所插入的多聚核苷酸序列的常規營養培養基中培養工程化宿主細胞。培養條件，例如溫度、PH等通常為先前用于選擇進行表達的特定宿主細胞的培養條件，并且對于本領域的技術人員而言顯而易見并且本文引用的參考包括(例如)Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第 3 版，Wiley-Liss，New York 以及其中引用的參考。其它有用參考包括(例如)Paul (1975)Cell and Tissue Culture，第 5 版，Livingston,Edinburgh ;Adams (1980)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Cell Culture for Biochemists，Work 和 Burdon (編)Elsevier，Amsterdam。有關體外生產流感病毒過程中特別感興趣的組織培養方法的另外的詳情包括(例如)Cohen和 Shafferman(編)Novel Strategies in Design and Production of Vaccines 中的 Merten 等(1996)Production of influenza virus in cell cultures for vaccinepr印aration.，出于各種目的將其整體并入本文。另外，易于通過常規實驗確定該方法中適于本發明的變化并且為本領域的技術人員所熟悉。可在含血清或無血清的培養基中培養用于生產流感病毒的細胞(例如，具有本文
            
的HA和/或NA序列)。在一些情況下，例如為了制備純化病毒，通常需要宿主細胞在無血清條件下生長。可小規模培養細胞，例如在少于25ml的培養基、培養管或燒瓶中或在攪拌下的大燒瓶中，在燒瓶、瓶子或反應器培養物中的微載體珠上(例如，DEAE-Dextran微載體珠(例如Dormacell、Pfeifer & Langen)、微珠、流動型實驗室、苯乙烯共聚物-三-甲胺珠(例如Hillex、S0l0Hill、Ann Arbor))。微載體珠是為每體積細胞培養物的粘附細胞提供較大表面積的小球(直徑為100-200 u m)。例如，IL培養基可包括20，000，000個以上的微載體珠，提供了超過8000cm2的生長表面。對于病毒的商業生產，例如對于疫苗生產，常常需要在生物反應器或發酵罐中培養細胞。生物反應器在IL以下至100L以上的體積均可用，例如 Cyto3 生物反應器(Osmonics, Minnetonka, MN)、NBS 生物反應器(New BrunswickScientific, Edison, NJ)、來自 B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech,Melsungen, Germany)的實驗室和商業規模的生物反應器。不管培養體積的大小，在本發明的許多預期方面，重要的是使用溫度依賴型多質粒系統(參見，例如，2002年10月23日提交的美國申請第60/420，708號、2003年4月25日提交的美國申請第10/423，828號和2004年5月24日提交的美國申請第60/574,117號，全部所述申請的標題均為“Multi-Plasmid System for the Production of InfluenzaVirus (用于生產流感病毒的多質粒系統)”)，加熱病毒溶液以便過濾等將培養物保持在適當溫度下，以確保有效回收重組和/或重配流感病毒。通常，采用調節器(例如，恒溫器)或用于感知和保持細胞培養系統和/或其它溶液的溫度的其它裝置，以確保在適當時期(例如，病毒復制等)溫度處于恰當水平。在本文的一些實施方案中(例如，其中由載體上的片段生成重配病毒)，根據本領域熟知的用于將異源核酸引入真核細胞的方法將包含流感基因組片段的載體引入(例如，轉染)宿主細胞中，所述方法包括(例如)磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微注射、脂質轉染和采用聚胺轉染試劑轉染。例如，可根據廠商說明使用聚胺轉染試劑TransIT-LTl (Mirus)將載體(例如，質粒)轉染至宿主細胞中，例如COS細胞、293T細胞或COS或293T細胞與MDCK細胞的組合，以生成重配病毒等。因此，在一個實例中，用約2 u I稀釋于160 u I培養基(優選為無血清培養基)中的TransIT-LTl將約I U g每種載體引入宿主細胞群中，總體積為200 u I0在室溫下孵育DNA :轉染試劑混合物45min，然后加入800 U I培養基。將轉染混合物加入宿主細胞，并且通過本領域技術人員熟知的其它方法如上所述培養細胞。因此,為了在細胞培養物中生產重組或重配病毒，將并入所述8個基因組片段(例如，本發明的PB2、PBl、PA、NP、M、NS、HA和NA)的每一個的載體與約20 的TransIT-LTl混合并轉染至宿主細胞中。任選地，在用無血清培養基(例如，Opti-MEM I)轉染之前更換含血清培養基并孵育4-6h。可選地，可采用電穿孔將并入流感基因組片段的載體引入宿主細胞。例如，根據以下方法使用電穿孔利于將并入A型或B型流感病毒的質粒載體引入Veix)細胞。簡言之，約5xl06個Vero細胞，例如在補充10%胎牛血清(FBS)的改良伊格爾培養基(MEM)中生長的Vero細胞重新懸浮于0. 4ml OptiMEM中并置于電穿孔試管中。向試管中的細胞加入20 y g體積達25ii I的DNA,然后輕拍輕輕混合。根據廠商說明(例如,連有Capacitance ExtenderPlus的BioRad Gene Pulser)在300V、950mF及28_33ms的時間常數下進行電穿孔。通過輕拍再次混合細胞，并且電穿孔后約l_2min，將0. 7ml含有10% FBS的MEM直接加入試管。
            
然后將細胞轉染至含2ml MEM、10% FBS的標準6孔組織培養皿的兩個孔中。沖洗試管以回收全部剩余細胞，并且將洗滌懸浮液分為兩孔。最終體積約為3. 5mL。然后在允許病毒生長的條件下孵育細胞，例如對于冷適應株而言在約33下。C孵育。在哺乳動物宿主細胞中，可利用許多表達系統，例如基于病毒的系統。在將腺病毒用作表達載體的情況下，編碼序列任選地連至由晚期啟動子和三聯體前導序列組成的腺病毒轉錄/翻譯復合體中。插入病毒基因組的非必需El或E3區域將產生能夠在感染宿主細胞中表達目標多妝的存活病毒(Logan和 Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci81 :3655-3659)。另外，轉錄增強子，例如勞氏肉瘤病毒(RSV)增強子可用于增強在哺乳動物宿主細胞中的表達。任選地選擇宿主細胞株能夠以所需的方式調節插入序列的表達或加工表達的蛋白。這種蛋白質的修飾包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂質化和酰化。將蛋白質的前體形式裂解為成熟形式的翻譯后加工對于正確插入、折疊和/或功能很重要。另外，宿主細胞內的恰當定位(即，在細胞表面)也很重要。不同的宿主細胞，例如C0S、CH0、BHK、MDCK、293、293T、C0S7等具有特異性細胞結構和這種翻譯后修飾活性的特征機制，并且可選擇以確保正確修飾和處理當前引入的外源蛋白。為了長期高產量生產本發明的多聚核苷酸編碼的重組蛋白或具有本發明的多聚核苷酸編碼的子序列的重組蛋白，可任選地使用穩定的表達系統。例如，使用含有病毒復制起點或內源性表達元件和可選標記基因的表達載體來轉染穩定表達本發明多肽的細胞系。例如，在引入載體后，在細胞轉移到選擇培養基之前使細胞在富集培養基中生長1-2天。可選標記的目的是為了賦予選擇抗性，并且其存在允許成功表達引入序列的細胞的生長和回收。因此，可使用適于所述細胞類型的組織培養技術增殖穩定轉化細胞(例如，源自單一細胞類型)的抗性細胞團。用編碼本發明多肽的核苷酸序列轉化的宿主細胞任選地在適于表達編碼蛋白并從細胞培養物中回收編碼蛋白的條件下培養。可將表達所述蛋白的細胞進行分類、分離和/或純化。依據序列(例如，根據編碼膜滯留信號等的融合蛋白)和/或所用載體，由重組細胞生成的蛋白質或其片段可分泌或與膜結合或細胞內滯留。在非動物細胞，例如植物、酵母、真菌、細菌等中也可生成與本發明的核酸相對應的表達產物。除了 Sambrook、Berger和Ausubel (全部參見下文)以外，還在Payne等(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc.New York, NY ;Gamborg 和 Phillips (編)(1995)Plant Cell, Tissue and Organ Culture ；Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag(Berlin Heidelberg NewYork)與 Atlas 和Parks (編)The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press,Boca Raton, FL中發現關于細胞培養的詳情。在細菌系統中，可根據表達產物的預期的用途選擇多種表達載體。例如，當生產抗體需要大量多肽或其片段時，利于采用指導高水平表達易于純化的融合蛋白的載體。這種載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達載體，例如BLUESCRIPT (Stratagene)，其中目標編碼序列(例如包含本文發現的序列等)可連至用于氨基末端翻譯的序列的框內的載體、PlN 載體(Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem264 :5503-5509)、pET 載體(Novagen,Madison WI)等中，所述氨基末端翻譯啟動生成具催化活性的P _半乳糖苷酶融合蛋白的￠-半乳糖苷酶的甲硫氨酸和隨后7個殘基。相似地，在酵母(釀酒酵母)中，多種
            
含組成型或誘導型啟動子的載體，例如a因子、醇氧化酶和PGH可用于生產所需表達產物。對于綜述，參見下文 Ausubel 和 Grant 等，(1987) ；Methods in Enzymology 153:516-544。目標生物分子的克隆、誘變和表達描述適于本發明的分子生物學技術(例如克隆、突變、細胞培養等)的一般文本包括 Berger 和 Kimmel , Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods inEnzymology volume 152 Academic Press, Inc. , San Diego, CA(Berger) ；Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual (第 3 版)，1-3 卷，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, New York,2000( “Sambrook”)和 Current Protocolsin Molecular Biology, F. M. Ausubel 等編，Current Protocols, a joint venture betweenGreene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.，(補充至Ij 2002 年)(“Ausubel”))。這些文本描述了誘變、載體的用途、啟動子和與(例如)HA和/或NA分子產生等有關的許多其它相關主題。各種類型的誘變任選地用于本發明，(例如)以生成和/或分離(例如)新型或新分離的HA和/或NA分子和/或進一步修飾/突變本發明的多肽(例如，HA和NA分子)。誘變包括但不限于定點誘變、任意點誘變、同源重組(DNA改組)、使用含模板的尿嘧啶誘變、寡聚核苷酸定向的誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用缺口雙螺旋DNA誘變等。另外的適合方法包括點錯配修復、使用修復缺陷型宿主株誘變、限制性選擇和限制性純化、缺失誘變、由全部基因合成誘變、雙鏈斷裂修復等。本發明還包括(例如)涉及嵌合構造的誘變。在一個實施方案中，天然存在的分子或改變或突變的天然分子的已知信息，例如序列、序列比較、物理性質、晶體結構等可指導誘變。以上文本和本文中的實例描述了這些方法以及以下出版物(及其中的參考)Sieber 等，Nature Biotechnology, 19 :456-460(2001) ；Ling 等，Approachesto DNA mutagenesis an overview, Anal Biochem 254(2)  157-178(1997) ；Dale 等，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method,Methods Mol Biol 57 :369-374(1996) ；I. A. Lorimer, I.Pastan, Nucleic Acids Res 23，3067-8 (1995) ；ff. P. C. Stemmer,Nature 370,389-91 (1994) ；Arnold,Protein engineeringfor unusual environments, Current Opinion in Biotechnology4 :450-455(1993)；Bass 等，Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities， Science 242 240-245(1988) ；Fritz 等，Oligonucleotide-directed construction of mutations agapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl AcidsRes 16 :6987-6999(1988) ；Kramer 等，Improved enzymatic in vitro reactions inthe gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction ofmutations，Nucl Acids Res 16:7207(1988) ;Sakamar 和 Khorana，Total synthesis andexpression of a gene for the a—subunit of bovine rod outer segment guaninenucleotide-binding protein (transducin)， Nucl Acids Res 14:6361-6372(1988)；Sayers 等，Y_T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directedmutagenesis，Nucl Acids Res 16 :791-802 (1988) ;Sayers等，Strand specific cleavageof phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleasesin the presence of ethidium bromide， (1988)Nucl Acids Res 16:803-814;Carter， Improved oligonucIeotide-directed mutagenesis using M13 vectors,Methods in Enzymol 154:382-403(1987) ；Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed
            
construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol 154 350-367 (1987) ；KunkeI, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis，in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F.and Lilley, D.M.J.eds.,Springer Verlag，Berlin)) (1987) ；Kunkel 等，Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection,Methods in Enzymol 154，367-382(1987)；Zoller & Smith， Oligonucleotide-directed mutagenesis a simple method usingtwo oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template， Methods inEnzymol 154 :329-350(1987) ；Carter, Site-directed mutagenesis，Biochem J 237 1-7(1986) ；Eghtedarzadeh & Henikoff， Use of oligonucleotides to generate largedeletions， Nucl Acids Res 14:5115(1986) ;Mandecki， Oligonucleotide-directeddouble-strand break repair in plasmids of Escherichia coli a method forsite-specific mutagenesis, Proc Natl Acad Sci USA，83 :7177-7181(1986)；Nakamaye & Eckstein， Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavageby phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directedmutagenesis，Nucl Acids Resl4 :9679-9698 (1986) ；Wells 等，Importance ofhydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin，Phil Trans R Soc Lond A317 :415-423(1986) ；Botstein & Shortle, Strategies andapplications of in vitro mutagenesis，Science 229:1193-1201 (1985) ；Carter 等，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors,Nucl AcidsRes 13 :4431-4443(1985) ;Gmndstr6m等，Oligonucleotide-directed mutagenesis bymicroscale f shot-gun f gene synthesis, Nucl Acids Res 13:3305-3316(1985)；Kunkel， Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection,Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492(1985) ；Smith,In vitro mutagenesis，Ann Rev Genet 19:423-462(1985) ;Taylor 等，The use of phosphorothioate-modifiedDNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl Acids Res 13 8749-8764 (1985) ；Taylor 等，The rapid generation of oligonucleotide-directedmutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl AcidsRes 13 :8765-8787(1985) ;Wells 等，Cassette mutagenesis an efficient method forgeneration of multiple mutations at defined sites, Gene 34 :315-323 (1985)；Kramer 等，The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction, Nucl Acids Res 12:9441-9456(1984) ；Kramer 等，Point MismatchRepair, Cell 38 :879-887 (1984) ；Nambiar 等，Total synthesis and cloning of agene coding for the ribonuclease S protein, Science 223:1299-1301(1984)；Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments clonedinto M13vectors, Methods in Enzymol 100:468-500(1983)；和 Zoller & Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13_derived vectors an efficientand general procedure for the production of point mutations in any DNAfragment, Nucl Acids Res 10:6487-6500(1982)。在 Methods in Enzymol 第 154 卷中有另外關于以上多種方法的詳情，其還描述了用于各種誘變、基因分離、表達和其它方法的故
            
障分析問題的有用控件。通常根據Beaucage 和 Caruthers, Tetrahedron Letts22 (20) :1859-1862, (1981)描述的固相亞磷酰胺三酯法，例如使用如Needham-VanDevanter等，Nucleic Acids Res,12 :6159-6168(1984)描述的自動化合成器化學合成例如用于本發明誘變(例如使本發明的HA和/或NA分子的文庫突變，或使本發明的HA和/或NA分子的文庫改變)的寡聚核苷酸。另外，基本上任何核酸必需從任何商業來源定制或標準定購。相似地，肽和抗體可從任一多種來源定制。本發明還涉及包含HA和/或NA分子或本發明的其它多肽和/或核酸或各種載體(例如6:2重配流感病毒、質粒救援系統中的質粒等)中的這種HA和/或NA或其它序列的宿主細胞和生物體。用本發明的載體基因工程化(例如，轉化、轉導或轉染)宿主細胞，所述載體可為(例如)克隆載體或表達載體。例如，載體可呈質粒、細菌、病毒、裸露多聚核苷酸或結合多聚核苷酸形式。通過標準方法將載體引入細胞和/或微生物中，所述標準方法包括電穿孔(參見，From等,Proc Natl Acad Sci USA 82, 5824(1985)、病毒載體感染、用在小珠或小顆粒基質內或在表面上有核酸的小顆粒進行高速彈道穿透(Klein等，Nature327,70-73(1987))。Berger、Sambrook和Ausubel提供了各種適當的轉化方法。參見上文。若干將靶核酸引入細菌細胞的熟知方法是可用的，其中任何方法均可用于本發明。這些方法包括使受體細胞和含有DNA的細菌原生質體融合、電穿孔、粒子轟擊和感染病毒載體等。細菌細胞可用于擴增許多含本發明的DNA構造的質粒。使細菌生長至對數期，并且可通過本領域已知的各種方法分離細菌內的質粒(例如，參見Sambrook)。另夕卜，用于從細菌中純化質粒的大量試劑盒可商購(參見，例如，來自Pharmacia Biotech的EasyPrep 、FlexiPrep  ;來自 Stratagene 的 StrataClean  ;和來自 Qiagen 的 QIAprep )。然后進一步利用分離并純化的質粒以生成其它質粒，用于轉染細胞或并入相關載體中以感染生物體。典型載體含有用于調節特定靶核酸表達的轉錄和翻譯終止子、轉錄和翻譯起始序列和啟動子。載體任選地包含基因表達盒，所述基因表達盒含有至少一個獨立終止子序列、允許所述盒在真核生物或原核生物或其二者中復制的序列(例如，穿梭載體)和原核和真核系統的選擇標記。載體適于在原核生物、原核生物中或優選在其二者中復制和整合。參見，Giliman & Smith,Gene 8:81(1979) ;Roberts 等，Nature,328 :731 (1987) ；Schneider,B.等，Protein Expr Purif6435 :10 (1995) ;Ausubel, Sambrook,Berger (全部見上文)。例如，由ATCC提供了用于克隆的細菌和噬菌體目錄，例如由ATCC出版的The ATCC Catalogueof Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna 等(編)。Watson 等(1992) RecombinantDNA Second Edition Scientific American Books, NY 中也發現序列測定、克隆和分子生物學其它方面的另外的基本方法和基礎理論研究。參見上文。多肽生產和回收在一些實施方案中，在轉導適合宿主細胞系或細胞株并使宿主細胞生長至適當細胞密度之后，通過適當方式(例如，溫度變化或化學誘導)誘導所選啟動子并且另外培養細胞一段時間。在一些實施方案中，然后從培養基回收分泌的多肽產物，例如如同呈分泌的融合蛋白形式的HA和/或NA多肽。在其它實施方案中，由細胞生產含有本發明的一種或多
            
種HA和/或NA多肽的病毒顆粒。可選地，可通過離心收獲細胞，通過物理或化學方式破壞細胞，并且保留所得到的粗提物進行進一步純化。可通過任何簡便方法破壞蛋白質表達中采用的真核或微生物細胞，所述方法包括凍融循環、聲波處理、機械破壞或使用細胞溶解劑或本領域技術人員熟知的其它方法。另外，可利用表達本發明的HA和/或NA多肽產物的細胞，而無需從細胞分離多肽。在這種情況下，任選地在細胞表面表達本發明的多肽，并且因此在細胞表面結合抗體等的上面檢驗到所述多肽(例如，通過具有HA和/或NA分子或其片段，例如包含融合蛋白等)。這種細胞也是本發明的特征。可通過本領域熟知的許多方法的任一種從重組細胞培養物中回收并純化表達的多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水作用色譜法、親合色譜法(例如，使用本領域技術人員已知的任何標記系統)、羥磷灰石色譜法和凝集素色譜法。如需要，在完成成熟蛋白質構型中可使用蛋白質再折疊步驟。同樣，在最后純化步驟可采用高效液相色譜法(HPLC)。除了本文提到的參考以外，本領域還熟知各種純化方法，包括例如Sandana(1997)Bioseparationof Proteins, Academic Press, Inc.；和 Bollag 等(1996)Protein Methods,第 2 版ffiley-Liss, NY ；ffalker (1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ,Harris and Angal(1990)Protein Purification Applications A Practical ApproachIRL Press at Oxford, Oxford, England ；Harris and Angal Protein PurificationMethods A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England ；Scopes (1993)Protein Purification Principles and Practice,第 3 版 Springer Verlag, NY ；Jansonand Ryden(1998)Protein Purification !Principles, High Resolution Methods andApplications,第 2 版 Wiley-VCH, NY ；和 Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROMHumana Press, NJ中闡述的方法。當病毒內生成本發明的表達多肽時，通常從生長有感染(轉染)細胞的培養基中回收病毒。通常，在濃縮流感病毒之前澄清粗培養基。常見方法包括超濾法、硫酸鋇吸附并洗脫和離心法。例如，首先可通過以足以去除細胞碎片和其它大顆粒物質的時間(例如10至30min)離心(例如在1000-200()xg下)來澄清來自感染培養物的粗培養基。任選地，然后將澄清的培養基上清液離心(例如在15，OOOxg下)約3-5h以粒化流感病毒。在pH為7. 4下將病毒顆粒再懸浮于適當緩沖液中之后，例如STE (0. OlM Tris-HCUO. 15M NaCl,0. 0001M EDTA)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，通過濃度梯度離心用蔗糖(60% -12% )或酒石酸鉀(50% -10% )濃縮病毒。連續梯度或步長梯度是適合的，例如蔗糖梯度在12%至60%之間，分為4個12%步長。按足以將病毒濃縮至供回收的可見帶的速度和時間離心所述梯度。可選地，并且對于大規模商業應用而言，使用在連續模式下運轉的區帶離心轉子從密度梯度凈化病毒。例如，在 Furminger. Vaccine Production, Nicholson 等(編)的 Textbookof Influenza pp. 324-332 ;Merten 等(1996)Production of influenza virus in cellcultures for vaccine preparation, Cohen &Shafferman(編)Novel Strategies inDesign and Production of Vaccines 第 141-151 頁和美國專利第 5, 690, 937 號中提供了足以指導技術人員由組織培養物制備流感病毒的另外的詳情。若需要，可在存在蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸鹽(SPG)的情況下將回收的病毒貯存于_80°C。修飾氨基酸本發明的表達多肽可含有一種或多種修飾氨基酸。修飾氨基酸的存在可利于(例如)(a)延長多肽血清半衰期；(b)降低/增強多肽抗原性；(C)增強多肽貯存穩定性等。例如，在重組體生產期間共翻譯或后翻譯地修飾氨基酸(例如，在哺乳動物細胞內表達期間在N-X-S/T基序處進行N連接糖基化)或通過合成方式(例如，通過聚乙二醇化)修飾
            
氨基酸。修飾氨基酸的非限制性實例包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、異戊二烯基化(例如，法呢基化、香葉基香葉基化)氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酰基化氨基酸等)以及通過與例如脂質部分或其它有機衍生化試劑結合而修飾的氨基酸。整篇文獻中充滿適于指導技術人員修飾氨基酸的參考。Walker (1998)Protein Protocols on CD-ROM Human Press,Towata,NJ 中有不例性方案。融合蛋白本發明還提供了融合蛋白，所述融合蛋白包含本發明的序列(例如，編碼HA和/或NA多肽的序列)或其片段與例如免疫球蛋白(或其部分)、編碼(例如)GFP (綠色熒光蛋白)或其它相似標記的序列等的融合。編碼這種融合蛋白的核苷酸序列為本發明的另一方面。本發明的融合蛋白任選地用于(例如)與本發明的非融合蛋白相似的應用(包括，例如，本文所述的治療、預防、診斷、實驗等應用)。除了與免疫球蛋白序列和標記序列融合以外，本發明的蛋白質還任選地與(例如)為融合蛋白分類和/或將融合蛋白靶向特異性細胞類型、區域等的序列融合。抗體本發明的多肽可用于生成對本文給定的多肽和/或由本發明的多聚核苷酸編碼的多肽有特異性的抗體，例如本文所示抗體，及其保守變異體。對以上提及的多肽有特異性的抗體用于(例如)診斷和治療用途，例如與靶多肽的活性、分布和表達有關的用途。例如，可任選地利用這種抗體來定義與本文HA/NA序列相同的菌株內的其它病毒。可通過本領域熟知的方法生成對本發明的多肽有特異性的抗體。這種抗體可包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、人源化、單鏈、Fab片段和由Fab表達文庫生成的片段。多肽不需要用于抗體生產的生物活性(例如，不需要全長功能性血凝素或神經氨酸酶)。然而，多肽或寡肽必須具抗原性。用于誘導特異性抗體的肽通常具有至少約4個氨基酸和通常至少5個或10個氨基酸的氨基酸序列。短距多肽可與另一蛋白質(例如鑰孔血藍素、生成的抗嵌合分子抗體)融合。本領域技術人員已知多種生產多克隆和單克隆抗體的方法，并且可適于生產對本發明的多肽有特異性的抗體和/或由本發明的多聚核苷酸序列編碼的抗體等。參見，例如，Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene，NY ;Paul (編)(1998)Fundamental Immunology, Fourth Edition, Lippincott-Raven, LippincottWilliams &ffilkins ；Harlow and Lane(1989)Antibodies A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Press, NY ;Stites 等(編)Basic and Clinical Immunology (4th ed.)Lange Medical Publications, Los Altos, CA 及其中的參考；Goding(1986)Monoclonal
            
Antibodies Principles and Practice(2d ed. ) Academic Press,New York,NY ;和 Kohler和Milstein (1975)Nature 256 :495_497。適于抗體制備的其它技術包括選擇噬菌體和相似載體中重組抗體庫。參見，Huse 等(1989) Science 246 :1275-1281 JPWard 等(1989)Nature 341:544-546。特異性單克隆和多克隆抗體和抗血清通常以(例如)至少約0. I u M、至少約0. 01 ii M或更高的Kd結合，并且通常以至少約0. 001 u M或更高的Kd結合。對于某些治療應用，需要人源化抗體。美國專利5，482，856號中可發現制備嵌合(人源化)抗體的詳細方法。Borrebaeck(編)(1995) Antibody Engineering,第2版Freeman and Company, NY(Borrebaeck) ;McCafferty 等(1996)Antibody Engineering, APractical Approach IRL at Oxford Press,Oxford,England (McCafferty),和Paul (1995)Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ(Paul)中可發現關于人源化和其它抗體生產與工程技術的另外的詳情。例如,在Ostberg等(1983), Hybridoma 2 361-367、0stberg，美國專利第4，634，664號和Engelman等，美國專利第4，634，666號中有關于具體步驟的另外的詳情。核酸和多肽序列變異體如本文所述，本發明提供了核酸多聚核苷酸序列和多肽氨基酸序列，例如血凝素和神經氨酸酶序列，和(例如)包含所述序列的組合物和方法。本文公開了所述序列的實例。然而，本領域技術人員將了解本發明未必限制于本文公開的那些序列，并且本發明還提供了許多具有本文所述功能的相關和無關序列，例如編碼HA和/或NA分子的序列。技術人員將了解公開序列的許多變異體包括在本發明內。例如，產生功能相同的序列的公開序列的保守改變包括在本發明內。核酸多聚核苷酸序列的變異體(其中變異體雜交至少一個公開序列)被視為包括在本發明內。例如，通過標準序列比較技術確定的本文公開序列的唯一子序列也包括在本發明內。沉默變異由于遺傳密碼的簡并性，任選地生成編碼本發明的多肽和/或病毒的任一核酸序列，一些序列與本文的HA和NA核酸和多肽的序列同一性水平較低。以下提供了指定在生物和生化文本中存在的遺傳密碼的典型密碼子表。表I
            
密碼子表
            
權利要求
            
1.一種分離或重組多肽，所述多肽選自以下  a)包含SEQID NO : I的氨基酸序列的多肽；  b)包含含至少一個選自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQID NO 1的氨基酸序列的多肽；  c)包含含K119E和A186D氨基酸取代的SEQID NO : I的氨基酸序列的多肽；  d)包含含K119N和A186D氨基酸取代的SEQID NO : I的氨基酸序列的多肽；  e)包含含D222G和/或Q223R取代的SEQID NO : I的氨基酸序列的多肽；  f)包含(i)含D222G和/或Q223R取代和(ii)進一步含至少一個選自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO : I的氨基酸序列的多肽；  g)包含⑴含D222G和/或Q223R取代和(ii)進一步含K119E和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO :I的氨基酸序列的多肽；  h)包含⑴含D222G和/或Q223R取代和(ii)進一步含K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO :I的氨基酸序列的多肽；  i)包含SEQID NO : I的殘基1-327的氨基酸序列的多肽；  j)包含含至少一個選自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO :1的殘基1-327的氨基酸序列的多肽；  k)包含含K119E和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO :1的殘基1-327的氨基酸序列的多肽；  I)包含含K119N和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO :1的殘基1-327的氨基酸序列的多肽；  m)包含含D222G和/或Q223R取代的SEQ ID NO :1的殘基1-327的氨基酸序列的多肽；  n)包含(i)含D222G和/或Q223R取代和(ii)進一步含至少一個選自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO :I的殘基1-327的氨基酸序列的多肽；  0)包含⑴含D222G和/或Q223R取代和(ii)進一步含至少一個選自K119E和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO :I的殘基1-327的氨基酸序列的多肽；  P)包含(i)含D222G和/或Q223R取代和(ii)進一步含至少一個選自K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO :I的殘基1-327的氨基酸序列的多肽；q)包含含SEQ ID NO 6氨基酸序列的多肽；r)包含含SEQ ID NO 6的殘基1-327的氨基酸序列的多肽；  s)包含與(a)至(r)任一多肽的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的多肽；  t)包含(a)至(r)任一多肽的氨基酸序列的多肽，所述多肽中少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸殘基被取代、缺失或插入；u)包含(a)至(r)任一多肽的氨基酸序列和還包含H273Y取代的多肽；和V)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的多肽。
            
2.根據權利要求I所述的分離或重組多肽，其中所述多肽為免疫原性的。
            
3.一種無菌組合物，包含權利要求I所述的分離或重組多肽。
            
4.一種抗體，其對權利要求I所述的分離或重組多肽有特異性。
            
5.一種免疫原性組合物，包含免疫有效量的權利要求I所述的分離或重組多肽。
            
6.一種重配流感病毒，包含編碼權利要求I所述的分離或重組多肽的核酸。
            
7.一種分離或重組核酸，包含編碼權利要求I所述的多肽的核苷酸序列。
            
8.根據權利要求7所述的分離或重組核酸，包含SEQID NO 3或SEQ ID NO :7的核苷酸序列。
            
9.根據權利要求7所述的分離或重組核酸，其中所述核酸為DNA。
            
10.根據權利要求7所述的分離或重組核酸，其中所述核酸為RNA。
            
11.根據權利要求7所述的分離或重組核酸，其中所述多聚核苷酸編碼免疫原性多肽。
            
12.—種組合物，包含權利要求7所述的分離或重組核酸。
            
13.—種免疫原性組合物，包含免疫有效量的權利要求7所述的分離或重組核酸。
            
14.一種重配流感病毒，包含權利要求7所述的核酸。
            
15.一種重配流感病毒，包含權利要求8所述的核酸。
            
16.一種重配流感病毒，其中所述重配流感病毒為6:2重配病毒，所述重配病毒包含6個來自一個或多個供體病毒的內部基因組片段、編碼權利要求I所述的多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。
            
17.—種重配流感病毒，其中所述重配流感病毒為7:1重配病毒，所述重配病毒包含編碼權利要求I所述的多肽的第一基因組片段，并且還包含6個內部基因組片段和編碼來自一個或多個供體病毒的神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。
            
18.根據權利要求16或17所述的重配流感病毒，其中所述供體病毒包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
19.根據權利要求16至18中任一項所述的重配流感病毒，其中所述供體病毒選自A/Ann Arbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17。
            
20.根據權利要求16至19中任一項所述的重配流感病毒，其中所述病毒為活病毒。
            
21.根據權利要求16至20中任一項所述的重配流感病毒，其中所述第一基因組片段編碼包含具有至少一個選自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO : I的氨基酸序列的多肽。
            
22.根據權利要求16至20中任一項所述的重配流感病毒，其中所述第一基因組片段編碼包含含K119E和A186D氨基酸取代的SEQID NO 1的氨基酸序列的多肽。
            
23.根據權利要求16至20中任一項所述的重配流感病毒，其中所述第一基因組片段編 碼包含含K119N和A186D氨基酸取代的SEQID NO 1的氨基酸序列的多肽。
            
24.根據權利要求21至23中任一項所述的重配流感病毒，其中所述第一基因組片段編碼的多肽的氨基酸序列還包含D222G和/或Q223R取代。
            
25.根據權利要求16至24中任一項所述的重配流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽為豬流感病毒神經氨酸酶。
            
26.根據權利要求16至24中任一項所述的重配流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽為NI神經氨酸酶。
            
27.根據權利要求16至26中任一項所述的重配流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
            
28.—種在細胞培養物中生成重配流感病毒的方法，所述方法包括  a)將多種包含流感病毒基因組的載體引入宿主細胞群中，其中多種載體包含第一流感株的6個內部基因組片段、編碼權利要求I所述的多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段，并且其中所述細胞群能支持流感病毒的復制；  b)培養所述宿主細胞群；和  c)回收多種重配流感病毒。
            
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述第一基因組片段編碼包含具有至少一個選自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽。
            
30.根據權利要求28所述的方法，其中所述第一基因組片段編碼包含含K119E和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO :I的氨基酸序列的多肽。
            
31.根據權利要求28所述的方法，其中所述第一基因組片段編碼包含含K119N和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO :I的氨基酸序列的多肽。
            
32.根據權利要求28所述的方法，其中所述第一基因組片段編碼的多肽的氨基酸序列還包含D222G和/或Q223R取代。
            
33.根據權利要求28至32中任一項所述的方法，其中所述第二基因組片段為豬流感病毒基因組片段。
            
34.根據權利要求28至33中任一項所述的方法，其中所述神經氨酸酶多肽為NI神經氨酸酶。
            
35.根據權利要求28至34中任一項所述的方法，其中所述神經氨酸酶多肽包含SEQIDNO 4的氨基酸序列。
            
36.根據權利要求28至35中任一項所述的方法，其中所述第一流感病毒株包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
37.根據權利要求28至35中任一項所述的方法，其中所述第一流感株選自A/AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17。
            
38.根據權利要求28至37中任一項所述的方法，其中所述重配流感病毒適合以鼻內疫苗制劑施用。
            
39.根據權利要求28至38中任一項所述的方法，其中所述包含流感病毒基因組的多種載體包含A型流感病毒基因組。
            
40.根據權利要求28至39中任一項所述的方法，其中所述多種載體為多種質粒載體。
            
41.根據權利要求28至40中任一項所述的方法，其中所述宿主群包括以下的一種或多種Vero細胞、PerC6細胞、MDCK細胞、293T細胞或COS細胞。
            
42.根據權利要求28至41中任一項所述的方法，其中所述方法不包括輔助病毒的使用。
            
43.根據權利要求28至42中任一項所述的方法，其中所述多種載體由8種載體組成。
            
44.一種免疫原性組合物，包含權利要求I所述的分離或重組多肽。
            
45.一種免疫原性組合物，包含權利要求7所述的分離或重組核酸。
            
46.根據權利要求44或45所述的組合物，還包含賦形劑。
            
47.根據權利要求46所述的組合物，其中所述賦形劑為藥學上可接受的賦形劑。
            
48.一種免疫原性組合物，包含權利要求14至27中任一項所述的重配流感病毒。
            
49.根據權利要求48所述的組合物，還包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
            
50.根據權利要求48或49所述的組合物，其中所述組合物為流感減毒活疫苗。
            
51.—種生成重配流感病毒疫苗的方法，所述方法包括  a)將多種包含流感病毒基因組的載體引入宿主細胞群中，其中多種載體包含第一流感株的至少6個內部基因組片段、編碼權利要求I所述的多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段，并且其中所述細胞群能支持流感病毒復制；  b)培養所述宿主細胞群；  c)回收多種重配流感病毒；和  d)提供一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
            
52.根據權利要求51所述的方法，其中所述第一基因組片段編碼包含含至少一個選自K119E、K119N和A186D的氨基酸取代的SEQID NO 1的氨基酸序列的多肽。
            
53.根據權利要求51所述的方法，其中所述第一基因組片段編碼包含含K119E和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO :I的氨基酸序列的多肽。
            
54.根據權利要求51所述的方法，其中所述第一基因組片段編碼包含含K119N和A186D氨基酸取代的SEQ ID NO :I的氨基酸序列的多肽。
            
55.根據權利要求51所述的方法，其中所述第一基因組片段編碼的多肽的氨基酸序列還包含D222G和/或Q223R取代。
            
56.根據權利要求51至55中任一項所述的方法，其中所述第二基因組片段為豬流感病毒基因組片段。
            
57.根據權利要求51至55中任一項所述的方法，其中所述神經氨酸酶多肽為NI神經氨酸酶。
            
58.根據權利要求51至57中任一項所述的方法，其中所述神經氨酸酶多肽包含SEQIDNO 4的氨基酸序列。
            
59.根據權利要求51至58中任一項所述的方法，其中所述第一流感病毒株包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
60.根據權利要求51至59中任一項所述的方法，其中所述重配流感病毒適合以鼻內疫苗制劑施用。
            
61.根據權利要求51至60中任一項所述的方法，其中所述包含流感病毒基因組的多種載體包含A型流感病毒基因組。
            
62.根據權利要求51至61中任一項所述的方法，其中所述第一流感株選自A/AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17。
            
63.根據權利要求51至62中任一項所述的方法，其中所述重組病毒適合以鼻內疫苗制劑施用。
            
64.—種重配流感病毒，包含在受治療者中對病毒感染產生免疫原應答以預防或治療所述病毒感染的有效量的權利要求I所述的多肽。
            
65.根據權利要求64所述的重配流感病毒，其中所述受治療者為哺乳動物。
            
66.根據權利要求65所述的重配流感病毒，其中所述哺乳動物為人類。
            
67.根據權利要求64-66中任一項所述的重配流感病毒，其中所述病毒感染為流感病毒感染。
            
68.根據權利要求64-67中任一項所述的重配流感病毒，其中所述重配流感病毒將在體內施用給所述受治療者或在體外或離體施用給所述受治療者的一個或多個細胞。
            
69.根據權利要求64-68中任一項所述的重配流感病毒，其中向所述受治療者施用預防性或治療性治療所述病毒感染的有效量的包含所述重配流感病毒和藥學上可接受的賦形劑的組合物。
            
70.一種提高重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度的方法，包括改變在與SEQID NO 1的位置119或186的氨基酸殘基相對應的位置上的血凝素多肽氨基酸殘基，從而提聞所述流感病毒在含胚卵中的最聞滴度。
            
71.根據權利要求70所述的方法，其中與SEQID NO 1的位置119的所述氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改變。
            
72.根據權利要求71所述的方法，其中與SEQID NO 1的位置119的所述氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改為谷氨酸(E)。
            
73.根據權利要求71所述的方法，其中與SEQID NO 1的位置119的所述氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改為天冬酰胺(N)。
            
74.根據權利要求70所述的方法，其中與SEQID NO :I的位置186的所述氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改變。
            
75.根據權利要求74所述的方法，其中與SEQID NO 1的位置186的所述氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改為天冬氨酸(D)。
            
76.根據權利要求70所述的方法，其中與SEQID NO 1的位置119和186的所述氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改變。
            
77.根據權利要求76所述的方法，其中與SEQID NO :1的位置119的所述氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改為谷氨酸(E)，并且與SEQ ID NO 1的位置186的所述氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改為天冬氨酸(D)。
            
78.根據權利要求76所述的方法，其中與SEQID NO 1的位置119的所述氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改為天冬酰胺(N)，并且與SEQ ID NO :1的位置186的所述氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改為天冬氨酸(D)。
            
79.根據權利要求70至78中任一項所述的方法，其中所述血凝素多肽為Hl血凝素多肽。
            
80.根據權利要求70至78中任一項所述的方法，其中所述血凝素多肽為豬流感病毒血凝素多肽。
            
81.根據權利要求70至80中任一項所述的方法，其中所述血凝素多肽包含SEQID NO:I的氨基酸序列。
            
82.根據權利要求811所述的方法，其中所述血凝素多肽還包含D222G和/或Q223R取代。
            
83.根據權利要求70至82中任一項所述的方法，其中所述重配流感病毒包含選自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17 的病毒的至少6個內部基因組片段。
            
84.根據權利要求70至82中任一項所述的方法，其中所述重配流感病毒包含選自A/Ann Arbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17 的病毒的7個基因組片段。
            
85.根據權利要求70至83中任一項所述的方法，其中所述重配或重組流感病毒包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
86.根據權利要求85所述的方法，其中所述重配流感病毒包含A/AnnArbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66的至少6個內部基因組片段。
            
87.根據權利要求85所述的方法，其中所述重配流感病毒包含A/AnnArbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66的7個內部基因組片段。
            
88.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中相對于不含氨基酸改變的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少2倍。
            
89.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中相對于不含氨基酸改變的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少4倍。
            
90.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中相對于不含氨基酸改變的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少8倍。
            
91.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中相對于不含氨基酸改變的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少10倍。
            
92.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中相對于不含氨基酸改變的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少20倍。
            
93.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中相對于不含氨基酸改變的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至10倍。
            
94.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中相對于不含氨基酸改變的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至20倍。
            
95.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中相對于不含氨基酸改變的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至40倍。
            
96.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中相對于不含氨基酸改變的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至20倍。
            
97.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中相對于不含氨基酸改變的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至40倍。
            
98.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og10PFU/ml的滴度。
            
99.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約81og1QPFU/ml的滴度。
            
100.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約8. 51og10PFU/ml的滴度。
            
101.根據權利要求70至87中任一項所述的方法，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約91og1(lPFU/ml的滴度。
            
102.一種免疫原性組合物，包含權利要求70至101中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
103.—種流感疫苗，包含權利要求70至101中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
104.一種冷適應、溫度敏感、減毒流感活疫苗，包含權利要求70至101中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
105.一種包含血凝素多肽的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含在與SEQID NO :I的位置119或186的所述氨基酸殘基相對應的位置上的改變的氨基酸殘基。
            
106.根據權利要求105所述的重配或重組流感病毒，其中所述改變的氨基酸殘基與SEQ ID NO : I的位置119的氨基酸殘基相對應。
            
107.根據權利要求106所述的重配或重組流感病毒，其中與SEQIDNO 1的位置119的氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改為谷氨酸(E)。
            
108.根據權利要求106所述的重配或重組流感病毒，其中與SEQIDNO 1的位置119的氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改為天冬酰胺(N)。
            
109.根據權利要求105所述的重配或重組流感病毒，其中所述改變的氨基酸殘基與SEQ ID NO : I的位置186的氨基酸殘基相對應。
            
110.根據權利要求109所述的重配或重組流感病毒，其中與SEQIDNO :1的位置186的氨基酸殘基相對應的所述氨基酸殘基被改為天冬氨酸(D)。
            
111.根據權利要求105所述的重配或重組流感病毒，其包含在與SEQID NO:l的位置119和186的氨基酸殘基相對應的位置上的改變的氨基酸殘基。
            
112.根據權利要求111所述的重配或重組流感病毒，其中與SEQIDNO :1的位置119的氨基酸殘基相對應的所述改變的氨基酸殘基被改為谷氨酸(E)，并且與SEQ ID NO: I的位置186的氨基酸殘基相對應的所述改變的氨基酸殘基被改為天冬氨酸(D)。
            
113.根據權利要求111所述的重配或重組流感病毒，其中與SEQIDNO :1的位置119的氨基酸殘基相對應的所述改變的氨基酸殘基被改為天冬酰胺(N)，并且與SEQ ID NO:l的位置186的氨基酸殘基相對應的所述改變的氨基酸殘基被改為天冬氨酸(D)。
            
114.根據權利要求105至113中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽為Hl血凝素多肽。
            
115.根據權利要求105至113中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽為豬流感病毒血凝素多肽。
            
116.根據權利要求105至115中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含SEQ ID NO : I的所述氨基酸序列。
            
117.根據權利要求116所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽還包含D222G和/或Q223R取代。
            
118.根據權利要求105至117中任一項所述的重配流感病毒，還包含選自A/AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17 的病毒的至少6個內部基因組片段。
            
119.根據權利要求105至117中任一項所述的重配流感病毒，還包含選自A/AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17 的病毒的7個基因組片段。
            
120.根據權利要求105至119中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
121.根據權利要求120所述的重配流感病毒，其中所述重配流感病毒包含選自A/AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17 的病毒的至少6個內部基因組片段。
            
122.根據權利要求120所述的重配流感病毒，其中所述重配流感病毒包含選自A/AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17 的病毒的7個基因組片段。
            
123.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含所述改變的氨基酸殘基的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少2倍。
            
124.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含所述改變的氨基酸殘基的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少4倍。
            
125.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含所述改變的氨基酸殘基的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少8倍。
            
126.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含所述改變的氨基酸殘基的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少10倍。
            
127.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含所述改變的氨基酸殘基的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少20倍。
            
128.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含所述改變的氨基酸殘基的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至10倍。
            
129.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含所述改變的氨基酸殘基的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至20倍。
            
130.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含所述改變的氨基酸殘基的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至40倍。
            
131.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含所述改變的氨基酸殘基的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至20倍。
            
132.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含所述改變的氨基酸殘基的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至40倍。
            
133.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og10PFU/ml的滴度。
            
134.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約81og1(lPFU/ml的滴度。
            
135.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約8. 51og10PFU/ml的滴度。
            
136.根據權利要求105至122中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約91og1(lPFU/ml的滴度。
            
137.一種免疫原性組合物，包含權利要求105至136中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
138.—種流感疫苗，包含權利要求105至136中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
139.—種冷適應、溫度敏感、減毒流感活疫苗，包含權利要求105至136中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
140.一種包含基因組片段的重配流感病毒，所述基因組片段編碼包含除在位置119上的氨基酸E或N和在位置186上的氨基酸D外的SEQ ID NO 1的氨基酸序列的多肽。
            
141.一種包含HA基因組片段的重配流感病毒，所述HA基因組片段編碼包含除在位置119上的氨基酸E或N和在位置186上的氨基酸D外的HlNl豬流感病毒氨基酸序列的多肽。
            
142.—種包含HA基因組片段的重配流感病毒，所述HA基因組片段編碼包含除在位置119和位置186上的非天然存在的氨基酸外的HlNl豬流感病毒氨基酸序列的多肽。
            
143.一種免疫原性組合物，包含通過權利要求28至43中任一項所述的方法生成的所述重配流感病毒。
            
144.根據權利要求143所述的組合物，還包含一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
            
145.根據權利要求143或144所述的組合物，其中所述組合物為減毒流感活疫苗。
            
146.一種包含血凝素多肽的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽在與SEQ IDNO 1的氨基酸殘基位置119相對應的位置上或在與SEQ ID NO 1的氨基酸殘基位置186相對應的位置上包含非天然存在的氨基酸。
            
147.根據權利要求146所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽在與SEQIDNO 1的氨基酸殘基位置119相對應的位置上或在與SEQ ID NO :1的氨基酸殘基位置186相對應的位置上包含非天然存在的氨基酸。
            
148.根據權利要求146所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含至少一個選自以下的非天然存在的氨基酸在與SEQID NO : I的位置119的氨基酸殘基相對應的氨基酸殘基處的谷氨酸(E)，在與SEQ ID NO 1的位置119的氨基酸殘基相對應的氨基酸殘基處的天冬酰胺(N)和在與SEQ ID NO : I的位置186的氨基酸殘基相對應的氨基酸殘基處的天冬氨酸⑶。
            
149.根據權利要求148所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含在與SEQ ID NO : I的位置119的氨基酸殘基相對應的氨基酸殘基處的谷氨酸(E)和在與SEQ IDNO 1的位置186的氨基酸殘基相對應的氨基酸殘基處的天冬氨酸(D)。
            
150.根據權利要求148所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含在與SEQ ID NO :1的位置119的氨基酸殘基相對應的氨基酸殘基處的天冬酰胺(N)和在與SEQID NO : I的位置186的氨基酸殘基相對應的氨基酸殘基處的天冬氨酸(D)。
            
151.根據權利要求146至150中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽為Hl血凝素多肽。
            
152.根據權利要求146至150中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽為豬流感病毒血凝素多肽。
            
153.根據權利要求146至152中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含在位置119和/或186上有氨基酸取代的SEQ ID NO : I的氨基酸序列。
            
154.根據權利要求153所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽還包含D222G和/或Q223R取代。
            
155.根據權利要求146至154中任一項所述的重配流感病毒，其還包含選自A/AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17 的病毒的至少6個內部基因組片段。
            
156.根據權利要求146至154中任一項所述的重配流感病毒，其還包含選自A/AnnArbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17 的病毒的7個基因組片段。
            
157.根據權利要求146至156中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
158.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的 最高滴度提高至少2倍。
            
159.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少4倍。
            
160.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少8倍。
            
161.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少10倍。
            
162.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高至少20倍。
            
163.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至10倍。
            
164.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至20倍。
            
165.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高2至40倍。
            
166.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至20倍。
            
167.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中相對于不含非天然存在的氨基酸的相同重配或重組流感病毒，所述重配或重組流感病毒在含胚卵中的最高滴度提高5至40倍。
            
168.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og10PFU/ml的滴度。
            
169.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約81og1(lPFU/ml的滴度。
            
170.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約8. 51og10PFU/ml的滴度。
            
171.根據權利要求146至157中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約91og1(lPFU/ml的滴度。
            
172.一種免疫原性組合物，包含權利要求146至171中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
173.—種流感疫苗，包含權利要求146至171中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
174.—種冷適應、溫度敏感、減毒流感活疫苗，包含權利要求146至171中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
175.一種包含血凝素多肽的重配或重組流感病毒，所述血凝素多肽包含SEQ ID NO6的氨基酸序列。
            
176.一種包含血凝素多肽的重配或重組流感病毒，所述血凝素多肽包含與SEQ ID NO6的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%,至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。
            
177.—種包含血凝素多肽的重配或重組流感病毒，所述血凝素多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO 6的氨基酸序列。
            
178.一種包含血凝素多肽的重配或重組流感病毒，所述血凝素多肽包含SEQ ID NO6的殘基1-327的氨基酸序列。
            
179.一種包含血凝素多肽的重配或重組流感病毒，所述血凝素多肽包含與SEQ ID NO6的殘基1-327的氨基酸序列有至少95 %、至少98 %、至少98. 5 %、至少99 %、至少99. 2 %、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。
            
180.—種包含血凝素多肽的重配或重組流感病毒，所述血凝素多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ ID NO 6的殘基1-327的氨基酸序列。
            
181.根據權利要求175至180中任一項所述的重配或重組流感病毒，其還包含選自A/Ann Arbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17 的病毒的至少6個內部基因組片段。
            
182.根據權利要求175至180中任一項所述的重配或重組流感病毒，其還包含A/AnnArbor/6/60的至少6個內部基因組片段。
            
183.根據權利要求175至180中任一項所述的重配或重組流感病毒，其還包含A/Puerto Rico/8/34的至少6個內部基因組片段。
            
184.根據權利要求175至180中任一項所述的重配或重組流感病毒，其還包含選自A/Ann Arbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17 的病毒的7個基因組片段。
            
185.根據權利要求175至180中任一項所述的重配或重組流感病毒，其還包含A/AnnArbor/6/60的7個基因組片段。
            
186.根據權利要求175至180中任一項所述的重配或重組流感病毒，其還包含A/Puerto Rico/8/34的7個基因組片段。
            
187.根據權利要求175至186中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
188.根據權利要求175至187中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og10PFU/ml的滴度。
            
189.根據權利要求175至187中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約81og1(lPFU/ml的滴度。
            
190.根據權利要求175至187中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約8. 51og10PFU/ml的滴度。
            
191.根據權利要求175至187中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約91og1(lPFU/ml的滴度。
            
192.根據權利要求175至187中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約9. 51og10PFU/ml的滴度。
            
193.根據權利要求175至187中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約101og1(lPFU/ml的滴度。
            
194.一種免疫原性組合物，包含權利要求175至193中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
195.—種流感疫苗，包含權利要求175至193中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
196.—種冷適應、溫度敏感、減毒流感活疫苗，包含權利要求175至193中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
197.根據權利要求105至196中任一項所述重配重組流感病毒，其還包含神經氨酸酶多肽。
            
198.根據權利要求197所述的重配重組流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽為豬流感病毒神經氨酸酶。
            
199.根據權利要求197所述的重配重組流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽為NI神經氨酸酶。
            
200.根據權利要求197所述的重配重組流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽包含SEQID NO 4的氨基酸序列。
            
201.—種重配或重組流感病毒，包含供體病毒的6個內部基因組片段、編碼血凝素多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。
            
202.根據權利要求201所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含SEQIDNO 6的氨基酸序列。
            
203.根據權利要求201所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含與SEQID NO 6的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。
            
204.根據權利要求201所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO 6的氨基酸序列。
            
205.根據權利要求201所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含SEQIDNO 6的殘基1-327的氨基酸序列。
            
206.根據權利要求201所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含與SEQID NO 6的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。
            
207.根據權利要求201所述的重配或重組流感病毒，其中所述血凝素多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO 6的殘基1-327的氨基酸序列。
            
208.根據權利要求201至207中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽為豬流感病毒神經氨酸酶。
            
209.根據權利要求201至207中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽為NI神經氨酸酶。
            
210.根據權利要求201至207中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
            
211.根據權利要求201至210中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述供體病毒選自 A/Ann Arbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17o
            
212.根據權利要求201至210中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述供體病毒為 A/Ann Arbor/6/60。
            
213.根據權利要求201至210中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述供體病毒為 A/Puerto Rico/8/34。
            
214.根據權利要求201至213中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
215.根據權利要求201至214中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og10PFU/ml的滴度。
            
216.根據權利要求201至214中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約81og1(lPFU/ml的滴度。
            
217.根據權利要求201至214中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約8. 51og10PFU/ml的滴度。
            
218.根據權利要求201至214中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約91og1(lPFU/ml的滴度。
            
219.根據權利要求201至214中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約9. 51og10PFU/ml的滴度。
            
220.根據權利要求201至214中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約101og1(lPFU/ml的滴度。
            
221.一種免疫原性組合物，包含權利要求201至220中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
222.—種流感疫苗，包含權利要求201至220中任一項的所述重配或重組流感病毒。
            
223.—種冷適應、溫度敏感、減毒流感活疫苗，包含權利要求201至220中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
224.—種重配或重組流感病毒，包含供體病毒的6個內部基因組片段、編碼血凝素多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。
            
225.根據權利要求224所述的重配或重組流感病毒，其中所述第一基因組片段包含SEQ ID NO 7的核苷酸序列。
            
226.根據權利要求224所述的重配或重組流感病毒，其中所述第一基因組片段包含SEQ ID NO 7的84至1064的核苷酸序列。
            
227.根據權利要求224至226中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽為豬流感病毒神經氨酸酶。
            
228.根據權利要求224至226中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽為NI神經氨酸酶。
            
229.根據權利要求224至226中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
            
230.根據權利要求224至226中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述第二基因組片段包含SEQ ID NO : 5的核苷酸序列。
            
231.根據權利要求224至230中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述供體病毒選自 A/Ann Arbor/6/60> A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17o
            
232.根據權利要求224至230中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述供體病毒為 A/Ann Arbor/6/60。
            
233.根據權利要求224至230中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述供體病毒為 A/Puerto Rico/8/34。
            
234.根據權利要求224至233中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
235.根據權利要求224至234中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約7. 51og10PFU/ml的滴度。
            
236.根據權利要求224至234中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約81og1(lPFU/ml的滴度。
            
237.根據權利要求224至234中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約8. 51og10PFU/ml的滴度。
            
238.根據權利要求224至234中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約91og1(lPFU/ml的滴度。
            
239.根據權利要求224至234中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約9. 51og10PFU/ml的滴度。
            
240.根據權利要求224至234中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配或重組流感病毒生長到在含胚卵中至少約101og1(lPFU/ml的滴度。
            
241.一種免疫原性組合物，包含權利要求224至240中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
242.—種流感疫苗，包含權利要求224至240中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
243.—種冷適應、溫度敏感、減毒流感活疫苗，包含權利要求224至240中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
244.—種在受治療者中對病毒感染產生免疫原應答以預防或治療所述病毒感染的有效量的權利要求14-27或140-142中任一項所述的重配流感病毒。
            
245.根據權利要求244所述的重配流感病毒，其中所述受治療者為哺乳動物。
            
246.根據權利要求245所述的重配流感病毒，其中所述哺乳動物為人類。
            
247.根據權利要求244-246中任一項所述的重配流感病毒，其中所述病毒感染為流感病毒感染。
            
248.根據權利要求244-247中任一項所述的重配流感病毒，其中所述重配流感病毒將在體內施用給所述受治療者或在體外或離體施用給所述受治療者的一個或多個細胞。
            
249.根據權利要求244-248中任一項所述的重配流感病毒，其中向所述受治療者施用預防性或治療性治療所述病毒感染的有效量的包含所述重配流感病毒和藥學上可接受的賦形劑的組合物。
            
250.一種在受治療者中對病毒感染產生免疫原應答以預防或治療所述病毒感染的有效量的權利要求105-136、146-171、175-193、197-220或224-240中任一項所述的重配或重組流感病毒。
            
251.根據權利要求250所述的重配或重組流感病毒，其中所述受治療者為哺乳動物。
            
252.根據權利要求251所述的重配或重組流感病毒，其中所述哺乳動物為人類。
            
253.根據權利要求250-252中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述病毒感染為流感病毒感染。
            
254.根據權利要求250-253中任一項所述的重配或重組流感病毒，其中所述重配流感病毒將在體內施用給所述受治療者或在體外或離體施用給所述受治療者的一個或多個細胞。
            
255.根據權利要求250-254中任一項所述的重配流感病毒，其中向所述受治療者施用預防性或治療性治療所述病毒感染的有效量的包含所述重配流感病毒和藥學上可接受的賦形劑的組合物。
            
256.—種預防或治療受治療者病毒感染的方法,所述方法包括向所述受治療者施用對病毒感染產生免疫原應答的有效量的權利要求14-27或140-142中任一項所述的重配流感病毒。
            
257.根據權利要求256所述的方法，其中所述受治療者為哺乳動物。
            
258.根據權利要求257所述的方法，其中所述哺乳動物為人類。
            
259.根據權利要求256-258中任一項所述的方法，其中所述病毒感染為流感病毒感染。
            
260.根據權利要求256-259中任一項所述的方法，其中所述重配流感病毒將在體內施用給所述受治療者或在體外或離體施用給所述受治療者的一個或多個細胞。
            
261.根據權利要求256-260中任一項所述的方法，其中向所述受治療者施用預防性或治療性治療所述病毒感染的有效量的包含所述重配流感病毒和藥學上可接受的賦形劑的組合物。
            
262.—種預防或治療受治療者病毒感染的方法，所述方法包括向受治療者施用對所述病毒感染產生免疫原應答的有效量的權利要求105-136、146-171、175-193、197-220或224-240中任一項所述的重配流感病毒。
            
263.根據權利要求262所述的方法，其中所述受治療者為哺乳動物。
            
264.根據權利要求263所述的方法，其中所述哺乳動物為人類。
            
265.根據權利要求262-264中任一項所述的方法，其中所述病毒感染為流感病毒感染。
            
266.根據權利要求262-265中任一項所述的方法，其中將所述重配流感病毒在體內施用給所述受治療者或在體外或離體施用給所述受治療者的一個或多個細胞。
            
267.根據權利要求262-266中任一項所述的方法，其中向所述受治療者施用預防性或治療性治療所述病毒感染的有效量的包含所述重配流感病毒和藥學上可接受的賦形劑的組合物。
            
268.—種在細胞培養物中生成重配流感病毒的方法，所述方法包括  a)將多種包含流感病毒基因組的載體引入宿主細胞群中，其中多種載體包含第一流感株的6個內部基因組片段、編碼血凝素多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段，并且其中所述細胞群能支持流感病毒復制；  b)培養所述宿主細胞群；和  c)回收多種重配流感病毒。
            
269.根據權利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含SEQID NO :6的氨基酸序列。
            
270.根據權利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含與SEQID NO :6的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。
            
271.根據權利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO 6的氨基酸序列。
            
272.根據權利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含SEQID NO :6的殘基1-327的氨基酸序列。
            
273.根據權利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含與SEQID NO 6的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。
            
274.根據權利要求268所述的方法，其中所述血凝素多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO 6的殘基1-327的氨基酸序列。
            
275.根據權利要求268所述的方法，其中所述第一基因組片段包含SEQID NO :7的核苷酸序列。
            
276.根據權利要求268所述的方法，其中所述第一基因組片段包含SEQID N0:7的84至1064的核苷酸序列。
            
277.根據權利要求268-276中任一項所述的方法，其中所述神經氨酸酶多肽為豬流感病毒神經氨酸酶。
            
278.根據權利要求268-276中任一項所述的方法，其中所述神經氨酸酶多肽為NI神經氨酸酶。
            
279.根據權利要求268-276中任一項所述的方法，其中所述神經氨酸酶多肽包含SEQID NO 4的氨基酸序列。
            
280.根據權利要求268-276中任一項所述的方法，其中所述第二基因組片段包含SEQID NO :5的核苷酸序列。
            
281.根據權利要求268-280中任一項所述的方法，其中所述第一流感病毒包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
282.根據權利要求268至281中任一項所述的方法，其中所述第一流感株選自A/AnnArbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17。
            
283.根據權利要求268至281中任一項所述的方法，其中所述第一流感株為A/AnnArbor/6/60。
            
284.根據權利要求268至281中任一項所述的方法，其中所述第一流感株為A/PuertoRico/8/34。
            
285.根據權利要求268至284中任一項所述的方法，其中所述重配流感病毒適合以鼻內疫苗制劑施用。
            
286.根據權利要求268至285中任一項所述的方法，其中所述包含流感病毒基因組的多種載體包含A型流感病毒基因組。
            
287.根據權利要求268至286中任一項所述的方法，其中所述多種載體為多種質粒載體。
            
288.根據權利要求268至287中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞群包含以下的一種或多種Vero細胞、PerC6細胞、MDCK細胞、293T細胞或COS細胞。
            
289.根據權利要求268至288中任一項所述的方法，其中所述方法不包括輔助病毒的使用。
            
290.根據權利要求268至289中任一項所述的方法，其中所述多種載體由8種載體組成。
            
291.—種生成重配流感病毒疫苗的方法，所述方法包括  a)將多種包含流感病毒基因組的載體引入宿主細胞群中，其中多種載體包含第一流感株的至少6個內部基因組片段、編碼血凝素多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段，并且其中所述宿主細胞群能支持流感病毒復制；  b)培養所述宿主細胞群；  c)回收多種重配流感病毒；和  d)提供一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
            
292.根據權利要求291所述的方法，其中所述血凝素多肽包含SEQID NO :6的氨基酸序列。
            
293.根據權利要求291所述的方法，所述血凝素多肽包含與SEQIDNO :6的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%,至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。
            
294.根據權利要求291所述的方法，其中所述血凝素多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO 6的氨基酸序列。
            
295.根據權利要求291所述的方法，其中所述血凝素多肽包含SEQID NO :6的殘基1-327的氨基酸序列。
            
296.根據權利要求291所述的方法，其中所述血凝素多肽包含與SEQID NO :6的殘基1-327的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99.4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列。
            
297.根據權利要求291所述的方法，其中所述血凝素多肽包含含少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸取代、缺失或插入的SEQ IDNO 6的殘基1-327的氨基酸序列。
            
298.根據權利要求291所述的方法，其中所述第一基因組片段包含SEQID NO :7的核苷酸序列。
            
299.根據權利要求291所述的方法，其中所述第一基因組片段包含SEQID NO:7的84至1064的核苷酸序列。
            
300.根據權利要求291-299中任一項所述的方法，其中所述神經氨酸酶多肽為豬流感病毒神經氨酸酶。
            
301.根據權利要求291-299中任一項所述的方法，其中所述神經氨酸酶多肽為NI神經氨酸酶。
            
302.根據權利要求291-299中任一項所述的方法，其中所述神經氨酸酶多肽包含SEQID NO 4的氨基酸序列。
            
303.根據權利要求291-299中任一項所述的方法，其中所述第二基因組片段包含SEQID NO:5的核苷酸序列。
            
304.根據權利要求291至303中任一項所述的方法，其中所述第一流感病毒株包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
305.根據權利要求291至304中任一項所述的方法，其中所述第一流感株選自A/AnnArbor/6/60>A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17。
            
306.根據權利要求291至304中任一項所述的方法，其中所述第一流感株為A/AnnArbor/6/60。
            
307.根據權利要求291至304中任一項所述的方法，其中所述第一流感株為A/PuertoRico/8/34。
            
308.根據權利要求291至307中任一項所述的方法，其中所述重配流感病毒適合以鼻內疫苗制劑施用。
            
309.根據權利要求291至308中任一項所述的方法，其中所述包含流感病毒基因組的多種載體包含A型流感病毒基因組。
            
310.根據權利要求291至309中任一項所述的方法，其中所述多種載體為多種質粒載體。
            
311.根據權利要求291至310中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞群包含以下的一種或多種Vero細胞、PerC6細胞、MDCK細胞、293T細胞或COS細胞。
            
312.根據權利要求291至311中任一項所述的方法，其中所述方法不包括輔助病毒的使用。
            
313.根據權利要求291至312中任一項所述的方法，其中所述多種載體由8種載體組成。
            
314.一種分離或重組多肽，其中所述多肽選自  a)包含SEQID NO : I的氨基酸序列的多肽；  b)包含含H273Y氨基酸取代的SEQID NO 1的氨基酸序列的多肽；  c)包含SEQID NO :8的氨基酸序列的多肽；  d)包含與(a)至(c)任一多肽的氨基酸序列有至少95%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列同一性的氨基酸序列的多肽；  e)包含(a)至(C)任一多肽的氨基酸序列的多肽，所述多肽中少于3個、少于5個、少于10個、少于15個、少于20個、少于25個、少于30個氨基酸殘基被取代、缺失或插入；
            
315.根據權利要求314所述的分離或重組多肽，其中所述多肽為免疫原性的。
            
316.一種無菌組合物，包含權利要求314所述的分離或重組多肽。
            
317.一種抗體，對權利要求314所述的分離或重組多肽有特異性。
            
318.—種免疫原性組合物，包含免疫有效量的權利要求314所述的分離或重組多肽。
            
319.—種重配流感病毒，包含編碼權利要求314所述的分離或重組多肽的核酸。
            
320.一種分離或重組核酸。包含編碼權利要求314所述的多肽的核苷酸序列。
            
321.根據權利要求320所述的分離或重組核酸，其中所述核酸為DNA。
            
322.根據權利要求320所述的分離或重組核酸，其中所述核酸為RNA。
            
323.根據權利要求320所述的分離或重組核酸，其中所述多聚核苷酸編碼免疫原性多肽。
            
324.一種組合物，包含權利要求320所述的分離或重組核酸。
            
325.一種免疫原性組合物，包含免疫有效量的權利要求320所述的分離或重組核酸。
            
326.一種重配流感病毒，包含權利要求320所述的核酸。
            
327.—種重配流感病毒，包含權利要求321所述的核酸。
            
328.一種重配流感病毒，其中所述重配流感病毒為6:2重配病毒，所述重配病毒包含6個來自一個或多個供體病毒的內部基因組片段、編碼權利要求314的所述多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。
            
329.一種重配流感病毒，其中所述重配流感病毒為7:1重配病毒，所述重配病毒包含編碼權利要求314的所述多肽的第一基因組片段，并且還包含6個內部基因組片段和編碼來自一個或多個供體病毒的神經氨酸酶多肽的第二基因組片段。
            
330.根據權利要求3146或17所述的重配流感病毒，其中所述供體病毒包含一種或多種選自減毒、冷適應和溫度敏感的表型屬性。
            
331.根據權利要求328至330中任一項所述的重配流感病毒，其中所述供體病毒選自A/Ann Arbor/6/60、A/Puerto Rico/8/34、A/Leningrad/134/17/57 和 A/Leningrad/17。
            
332.根據權利要求328至331中任一項所述的重配流感病毒，其中所述病毒為活病毒。
            
333.根據權利要求328至332中任一項所述的重配流感病毒，其中所述第一基因組片段編碼包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列的多肽。
            
334.根據權利要求328至333中任一項所述的重配流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽為豬流感病毒神經氨酸酶。
            
335.根據權利要求328至333中任一項所述的重配流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽為NI神經氨酸酶。
            
336.根據權利要求328至333中任一項所述的重配流感病毒，其中所述神經氨酸酶多肽包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列。
            
337.一種用于在細胞培養物中生成重配流感病毒的方法，所述方法包括  a)將多種包含流感病毒基因組的載體引入宿主細胞群中，其中多種載體包含第一流感株的6個內部基因組片段、編碼權利要求314所述多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段，并且其中所述細胞群能支持流感病毒復制；  b)培養所述宿主細胞群；和  c)回收多種重配流感病毒。
            
338.一種免疫原性組合物，包含權利要求314所述的分離或重組多肽。
            
339.一種免疫原性組合物，包含權利要求328至336中任一項所述的重配流感病毒。
            
340.一種生成重配流感病毒疫苗的方法，所述方法包括  a)將多種包含流感病毒基因組的載體引入宿主細胞群中，其中多種載體包含第一流感株的至少6個內部基因組片段、編碼權利要求314的所述多肽的第一基因組片段和編碼神經氨酸酶多肽的第二基因組片段，并且其中所述細胞群能支持流感病毒復制；  b)培養所述宿主細胞群；  c)回收多種重配流感病毒；和  d)提供一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
            
341.一種重配流感病毒，包含在受治療者中對病毒感染產生免疫原應答以預防或治療所述病毒感染的有效量的權利要求314所述的多肽。
            
全文摘要
            
本發明提供了包含流感血凝素和神經氨酸酶變異體的多肽、多核苷酸、方法、組合物和疫苗。
            
文檔編號C12N7/00GK102802666SQ201080027726 
            
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月24日 優先權日2009年6月25日
            
發明者H·金 申請人:米迪繆尼有限公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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