反應筒內多重核酸序列的檢測的制作方法

專利名稱：反應筒內多重核酸序列的檢測的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物和化學領域，更具體地涉及分子生物學和人類遺傳學領域。本發明涉及鑒定樣品中特定核酸序列的領域。具體地，本發明涉及在反應中擴增和檢測核酸序列的領域。本發明涉及用于檢測樣品中核酸序列的設備和筒。
背景技術：
靈敏、特異并快速檢測樣品中生物介質如病原體的診斷實驗對疾病和診斷生物介質監控愈加重要。對于存在感染性或其他有害介質的早期檢測，很少有試驗能在合適的時間精確檢測生理學或臨床相關的生物體。DNA微陣列是通過共價連接到化學基質上的排列在固體表面的極微小的DNA位點集合，其通常代表單個基因。DNA陣列與其他類型微陣列的差異僅在于它們測量DNA或用 DNA作為其檢測系統的部分。用DNA微陣列的定性或定量檢測利用高嚴謹性條件下DNA-DNA 或DNA-RNA雜交的選擇性和基于熒光團的檢測。DNA陣列通常用于表達概況，即同時監控數千個基因的表達水平，或用于比較基因組雜交。這個系統的缺陷在于分析前需要進行多重步驟。而且，所述陣列不靈敏。迄今，最敏感的檢測方法涉及PCR。用多重檢測法確定單一樣品中含或不含多個生物介質。多重PCR在單一 PCR反應中使用多種獨特引物組以產生對不同DNA序列(即不同轉基因)特異的各種大小的擴增子。通過一次定位多基因，可從單一測試運行中獲得額外信息，否則需要數倍所述試劑和更多時間來完成。各引物組的退火溫度必須優化以在單一反應中正確工作，且擴增子大小即其堿基對長度需要有足夠的差異以在凝膠電泳顯現時形成不同條帶。多重實時PCR是一種可用作診斷測試的方法。基于PCR的測試會受到用于在符合成本效益數量的反應管中測試多種試劑的PCR反應優化復雜性限制。作為一般規律，探針數量需要支持高度特異的從兩種到多至五種序列的確認結果。本領域技術人員會意識到用許多不同的引物對和探針來優化PCR反應可能是艱難的任務，其隨著待檢測的目標數量增加而愈加難處理。基于PCR的測試也可能受到用于結果分析的獨特標記數量限制。例如， 實時PCR測試一般使用熒光標記。單個反應中可使用的熒光標記的數量受到光學檢測系統中可用的熒光顏色通道數量的限制。能同時擴增和檢測多核酸序列的設備和/或筒是有利的。發明概述本發明涉及在反應筒內擴增和檢測核酸序列的方法，其包括下述步驟，⑴提供包括至少一核酸分子的樣品，(ii)在所述筒的第一反應室內提供用于擴增反應的試劑，(iii) 將所述樣品與所述擴增試劑混合，(iv)在所述筒的所述第一反應室內擴增至少一核酸，(ν) 將至少部分所述擴增反應轉移到所述筒的各含有探針組的第二和第三反應室中，其中(a) 各探針組由至少3種探針組成，(b)各所述探針對核酸序列特異，(C)每組至少有兩種探針攜帶相同標記，(d)給定的探針組里攜帶相同標記的各探針的解鏈溫度(Tm)和所述探針組里具有相同標記的另一探針有大于5°C的差異，(e)其中攜帶所述相同標記的探針在解鏈溫度(Tm)上不同，從而它們可通過熔點相區分，(f)進行熔點分析以確定哪種所述探針特異性結合核酸。本發明一個巨大優勢在于可分析的目標數量比現有技術大得多。進一步檢測發現探針被分離，這表明其不在擴增反應中，因此聚合酶不消化它們。本發明還包括實施擴增和檢測目標核酸序列的方法的筒，其包括(i)用于擴增反應的第一反應室，(ii)兩個或更多反應室，其中之一包含至少3種對核酸序列特異的探針，其中至少兩種探針攜帶相同標記，其中攜帶相同標記的各探針的解鏈溫度(Tm)和具有相同標記的另一探針有大于2°C的差異，其中所述攜帶相同標記的探針在解鏈溫度(Tm)上不同從而它們可通過熔點相區分，以及所述第一與所述兩個或更多反應室之間的連接。本文所用術語“筒”指本發明文章中允許所述擴增子從所述第一反應室在封閉系統內轉移到所述第二組反應室中的設備(優選微流體的)。所述筒可由聚合材料制成。材料優選聚丙烯、聚苯乙烯、C0C、聚碳酸酯、PMMA等。所述材料優選具有低自發熒光的透明材料。所述筒優選機械加工、熱模壓印或注模。本發明所用術語“核酸序列”指本發明內容中核酸上的序列。核酸可以是RNA、DNA、 cDNA (互補 DNA)、LNA (鎖核酸)、mRNA (信使 RNA)、mtRNA (線粒體)、rRNA (核糖體 RNA)、 tRNA (轉運 RNA)、nRNA (核 RNA)、siRNA (短干擾 RNA)、snRNA (小核 RNA)、snoRNA (小核仁 RNA)、scaRNA(小卡哈爾(Cajal)體特異RNA)、微小RNA、dsRNA(雙鏈RNA)、核酶、核糖開關、 病毒RNA、dsDNA (雙鏈DNA)、ssDNA (單鏈DNA)、質粒DNA、粘粒DNA、染色體DNA、病毒DNA、 mtDNA(線粒體DNA)、nDNA(核DNA)、snDNA(小核DNA)等或與樣品內大量核酸可區別的任何其他類或亞類核酸。本發明所用術語“探針”指能結合其他核酸的核酸。本文所用術語“組織”指人體、動物或植物內任何組織或液體，包括但不限于乳房、 前列腺、血液、血清、腦脊液、肝、腎、頭和頸、咽、甲狀腺、胰腺、胃、結腸、結直腸、子宮、子宮頸、骨、骨髓、睪丸、腦、神經組織、卵巢、皮膚和肺。本文所用術語“引物組”指可在特異位置即序列與核酸分子相互作用的一組3種或更多試劑。本文中，“標記”指共價或非共價結合探針的部分，其可產生可被光學或其他物理方法檢測的信號。發明詳述本發明涉及在反應筒內擴增和檢測核酸序列的方法，其包括下述步驟，(i)提供包括至少一核酸分子的樣品，( )在所述筒的第一反應室內提供用于擴增反應的試劑，(iii) 將所述樣品與所述擴增試劑混合，(iv)在所述筒的所述第一反應室內擴增至少一核酸，(ν) 將至少部分所述擴增反應轉移到所述筒的各含有探針組的第二和第三反應室中，其中(a) 各探針組由至少3種探針組成，(b)各所述探針對核酸序列特異，(c)每組至少有兩種探針攜帶相同標記，(d)給定的探針組里攜帶相同標記的各探針的解鏈溫度(Tm)和所述探針組里具有相同標記的另一探針有大于2°C的差異，(e)其中攜帶所述相同標記的探針在解鏈溫度(Tm)上不同，從而它們可通過熔點相區分，(f)進行熔點分析以確定哪種所述探針特異性結合核酸。
在另一個實施方式中，各探針組由至少4種探針組成且每組中至少有兩種探針攜帶相同的標記。在另一個實施方式中，各探針組由至少5種探針組成且每組中至少有兩種探針攜帶相同的標記。在另一個實施方式中，各探針組由至少6種探針組成且每組中至少有兩種探針攜帶相同的標記。在另一個實施方式中，各探針組由至少6種探針組成且每組中至少有兩種探針攜帶相同的標記。在另一個實施方式中，各探針組由至少7種探針組成且每組中至少有兩種探針攜帶相同的標記。也可3種或更多具有一個標記。在另一個實施方式中，各探針組由至少8種探針組成且每組中至少有兩種探針攜帶相同的標記。也可3種或更多具有一個標記。在另一個實施方式中各探針組由至少9種探針組成且每組中至少有兩種探針攜帶相同的標記。也可3種或更多具有一個標記。在另一個實施方式中各探針組由至少10種探針組成且每組中至少有兩種探針攜帶相同的標記。也可3種或更多具有一個標記。在一個實施方式中有多于10種探針，至少3種具有相同標記且解鏈溫度有至少 2°C的差異。本方法所基于的基本原理是，在擴增反應結束時用允許目標差異的單個雙標記探針進行解鏈曲線分析。所述相同標記的探針Tm有差異。在第二和更多的室里完成此分析。 通過將這些探針置于第二和更多的室里來避免其水解。本發明的觀點第一次使Tm分布不依賴于聚合酶表現外切活性時的溫度。PCR反應或等溫擴增過程結束時，所述探針可水解且混合物在連續熒光監控中進行逐步升溫。如典型TaqMan實時PCR，由所述探針產生的熒光信號基于FSrster共振能量轉移(FRET)現象。然而與TaqMan實時PCR中發生的相反，在此實施方式中可用的探針分子沒有通過Taq聚合酶發生水解。而是所述過程依賴于在所述探針從其目標上脫離以形成隨機單鏈構象時觀察到的FRET降低。當雙標記探針從其和所述目標序列的雜交物中釋放出來時，所述探針的報告和淬滅分子之間的平均距離會變得更小。由于所述FRET效應與該距離的6次冪成反比，可容易地檢測出探針雜交和解鏈構型之間熒光發射的差異。總方案如圖6所示。在此，逐個循環顯示不同反應溫度的熒光變化。在本發明的優選實施方式中，所用聚合酶缺少5' -3'外切核酸酶活性。所述擴增反應的反應體積在10_200μ 1之間。檢測反應的反應體積優選在 1-100 μ 1 之間。第二和更多室里的探針可以凍干、瓊脂糖或果膠或藻酸鹽包埋或簡單干燥。為了更好闡明本發明，我們指出

圖1。本發明的探針組包括至少兩種探針。在一個實施方式中，探針組可視為所有共享同一標記的探針，但也可視為共享同一解鏈溫度(Tm) 的探針。理想情況下，探針組里具有相同標記或彼此不能區分標記的探針具有不同的解鏈溫度。探針組里具有相同或非常相似的解鏈溫度的探針應該具有不同標記。本領域技術人員知道所述試劑普遍包括例如擴增酶、緩沖液、核苷酸等。當然這取決于擴增的類型。
本發明人開發了可用如20種模板進行多重擴增反應的方法。在一個實施方式中， 使用5種不同的標記且所有共享同一標記的探針具有稍微不同的解鏈溫度，理想上大于 5°C。另一方面所有共享同一解鏈溫度的探針具有不同的標記。通過在擴增期間或之后檢測所述標記和所述解鏈溫度，本發明人首次提供了可在一個管中分析如所述20種模板的方法。具有相同標記探針的解鏈溫度的差異大于2°C、大于3°C、大于4°C、大于5°C、大于 6°C、大于7°C、大于8°C、大于9°C或大于10°C。理想情況下，所述探針的差異小于18°C、小于17°C、小于16°C、小于15°C、小于14°C、小于13°C、小于12°C或小于11°C。原則上所述“通過測定標記探針是否結合其核酸序列來檢測擴增的核酸”和“檢測各給定標記探針從其結合的核酸序列上分離時的溫度”可在給定反應結束時或所述反應期間完成。在此，優選在所述筒的第一反應室中擴增所述至少一核酸之后的擴增后完成所述檢測。將至少部分所述反應轉移到所述筒的各含有探針組的第二和第三反應室中，其中各探針組由至少3種探針組成，各所述探針對核酸序列特異，每組至少有兩種探針攜帶相同標記，給定的探針組里攜帶相同標記的各探針的解鏈溫度(Tm)和所述探針組里具有相同標記的另一探針有大于5°C的差異，其中攜帶所述相同標記的探針在解鏈溫度(Tm)上不同，從而它們可通過熔點相區分，進行熔點分析以確定哪種所述探針特異性結合核酸。可應用不同的擴增方法，例如，滾環擴增(如Liu，等，“滾環DNA合成作為 DNA聚合酶有效模板的小圓形寡核苷酸組”(〃 Rolling circle DNA synthesis =Small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases" ) J. Am. Chem. Soc. 118 :1587-1594(1996))，等溫擴增(如 Walker，等，“Strand displacement amplification__an isothermal, in vitro DNA amplification technique“鏈置換擴增一等溫、體外 DNA 擴增技術”)，Nucleic Acids Res. 20(7) 1691-6 (1992))，連接酶鏈反應(如 Landegren,等，‘‘A Ligase-Mediated Gene Detection Technique,‘‘(連接酶介導的基因檢測技術)，Science 241 1077-1080，1988，或 Wiedmann，等，“Ligase Chain Reaction(LCR) —Overview and Applications,“(“連接酶鏈反應(LCR)—概述和應用”)，PCR Methods and Applications (《PCR方法和應用》)(冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor Laboratory, NY)，1994)第S51-S64頁)。然而，優選聚合酶鏈式反應。如果所述反應為聚合酶鏈式反應，則所述“通過測定標記的探針是否結合其核酸序列來檢測擴增的核酸”和“檢測各給定標記的探針從其結合的核酸序列上分離時的溫度” 可在每個循環后、一次循環后、多于一次循環后、間隔中或所述整個PCR反應結束時完成。 該情況下，部分所述反應在各自循環后轉移到所述檢測室中。PCR反應可由DNA分子的10-100個變性和合成“循環”構成。在優選實施方式中， 在熱循環擴增反應中進行變性的溫度約為90°C至95°C以上，更優選92-94°C。優選的熱循環擴增方法包括聚合酶鏈式反應，其涉及約10至約100個循環，更優選約25至約50個循環，且峰值溫度約為90°C至95°C以上，更優選92-94°C。在一個優選實施方式中，采用DNA 聚合酶I進行PCR反應，可產生相對所涉及反應步驟數量以指數擴增的至少一種靶核酸序列，前提是(a)對靶序列末端的了解足夠詳細，以便合成與其雜交的寡核苷酸引物，和(b) 得到少量靶序列以啟動所述鏈反應。該鏈反應的產物是不連續的核酸雙鏈體，其末端對應于所用特異性引物的末端。可采用任何來源的純化或非純化形式的核酸作為起始核酸，只要其含有或被認為含有所需的靶核酸序列。因此，該方法可采用例如，單鏈或雙鏈DNA。此外，可利用各含一條鏈的DNA-RNA雜合體。也可采用任何這些核酸的混合物，或者相同或不同引物進行前述擴增反應所產生的核酸。擴增的核酸優選DNA。待擴增的靶核酸序列可以僅是較大分子的一部分，或者最初可以不連續分子形式存在，從而該靶核酸構成完整的核酸。待擴增的靶序列最初不必需以純化形式存在；其可以是復雜混合物的微小部分或某特定動物核酸序列的一部分，所述生物體可能只構成特定生物樣品的很小部分。起始核酸可含有一種以上的所需靶核酸序列，這些序列可以相同或不同。因此，所述方法可用于同時擴增位于相同或不同核酸分子上的多種靶核酸序列。所述核酸可獲自任何來源且包括質粒和克隆的DNA、任何來源的DNA，包括細菌、酵母菌、病毒和高等生物如植物或動物。可通過各種技術例如Maniatis等Molecular cloning. A laboratory manual (《分子克隆實驗室手冊》)，(紐約冷泉港實驗室(New York =Cold Spring Harbor Laboratory))第沘0_281 頁 (1982)所述從例如血液或其他液體或組織材料如絨膜絨毛或羊膜細胞中提取DNA。此外可應用坦普勒斯(Templex)技術，其將格納克(Genaco) Tem-PCR技術和魯米耐克斯(Luminex) xMAP技術相結合。該試驗采用基因座特異性引物。可用任何合適的方法，例如磷酸三酯和磷酸二酯法或其自動化實施方式制備寡核苷酸弓I物。在一個這類自動化實施方式中，將二乙基亞磷酰胺用作起始材料并可如 Beaucage 等，Tetrahedron Letters，22 1859-1862 (1981)所述 (其通過引用納入本文)進行合成。一種在修飾的固體支持物上合成寡核苷酸的方法參見美國專利號4，458，006，其通過引用納入本文。也可采用分離自生物源(例如限制性核酸內切酶消化物)的引物。引物長度優選約為15-100個堿基，更優選約20-50個，最優選約 20-40個。重要的是該方法的引物橫跨包含所述目標序列的區域。用含有該序列作為模板的核酸來擴增靶核酸序列。如果所述核酸含有兩條鏈，則將其用作模板之前需要分離所述核酸鏈，其可作為單獨步驟或與合成引物延伸產物同時。可用任何合適的變性方法實施這種鏈分離，包括物理、化學或酶學方法。分離核酸鏈的一種物理方法包括加熱核酸，直到其完全(> 99% )變性。典型熱變性可涉及約80°C到105°C的溫度，優選約90°C到約98°C，更優選93°C到95°C，持續時間約1-10分鐘。在等溫擴增的情況中，也可用稱為解旋酶的這類酶或具有解旋酶活性且已知能變性DNA的RecA酶誘導鏈分離。適合用解旋酶分離核酸鏈的反應條件參見冷泉港定量生物學研討會(Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology)，第 XLIII 卷，DNA :R印lication and Recombination, (DNA :復制和重組)(紐約冷泉港實驗室，1978)，且使用RecA的技術綜述參見C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16 405-37 (198 ，其通過引用納入本文。可用任何合適方法進行所述合成。通常，在緩沖水溶液中進行合成。在一些優選實施方式中，所述緩沖液PH為約7. 5-8. 9。優選地，將摩爾過量(對于克隆核酸，引物模板的比例通常約為1000 1，對于基因組核酸，引物模板的比例通常約為106 1)的寡核苷酸引物加入到含有分離的模板鏈的緩沖液中。然而應理解，如果將本文所述方法用于某些應用，互補鏈的量可能未知，因此不能明確測定相對于互補鏈含量的引物量。然而，作為一個實際問題，當復雜的長鏈核酸鏈的混合物中包含待擴增序列時，加入的引物摩爾量通常超過互補鏈(模板)的量。優選較大的摩爾過量以提高該方法的效率。
也優選在合成混合物中加入適量的三磷酸核苷，優選dATP、dCTP、dGTP、dTTP和/ 或dUTP。核苷酸的優選摩爾濃度為0. 025mM-lmM,優選0. 05-0. 6mM,最優選0. 1-0. 5mM。本發明聚合酶優選選自以下菌屬棲熱菌屬(Thermus)、產液菌屬(Aquifex)、棲熱袍菌屬(Thermotoga)、熱發狀菌屬(Thermocridis)、氫桿菌屬(Hydrogenobacter)、嗜熱藍細菌屬(Thermosynchecoccus)禾口熱厭氧!flifiS (Thermoanaerobacter)。本發明聚合酶優選選自以下生物體伊歐產液菌屬(Aquifex aeolicus)、釀膿產液菌屬(Aquifex pyogenes)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、7_K生棲熱菌(Thermus aquaticus) > JP ^ ff) Jff W^i Ifi lif (Thermotoga neapolitana) > 5F# lif (Thermus pacificus)、艾格索尼棲熱菌(Thermus eggertssonii)禾口海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)。最優選的聚合酶是Taq聚合酶。但是如下文詳述，在一些實施方式中，聚合酶優選具有5' -3'外切酶活性。在其他實施方式中，聚合酶優選缺少5' -3'外切酶活性。在多數實施方式中，聚合酶優選缺少3' -5'外切酶活性在一個實施方式中，在PCR反應中摻入尿嘧啶殘基。尿嘧啶DNA糖基化酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)是大腸桿菌(Escherichia coli)ung基因的產物，且已克隆、測序并在大腸桿菌(E.coli)中表達。尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)能去除DNA(單鏈和雙鏈)中的這些尿嘧啶殘基，但不破壞DNA糖-磷酸二酯主鏈，從而防止其成為雜交靶標或DNA聚合酶的模板。在升高的溫度下，所得脫堿基位點易受到水解切割。因此，去除尿嘧啶堿基通常伴隨著所述DNA的片段化。本領域技術人員知道如何使用尿嘧啶DNA糖基化酶來避免污染。同樣， 此酶以及尿嘧啶核苷酸均可用于本發明試劑盒中。理想情況下，所述第一和第二或更多探針組內的探針標記為熒光標記且具有非常相似的發射波長。理想情況下，這意味著它們可被檢測出而不用改變可能被所述檢測儀器檢測出的波長調節。在第一、第二和第三或更多探針組中的探針的標記優選是相同的。優選攜帶所述相同標記的探針在解鏈溫度(Tm)上不同，從而它們可通過在給定儀器上的熔點相區分。在一個實施方式中，所述雙鏈區段的解鏈轉移可通過監測雙鏈核酸特異(dsNAS) 染料的熒光強度來測量。在一個實施方式中，所述雙鏈核酸特異性染料選自STOR 綠I、 STOR 金、溴化乙啶、溴化丙錠、皮可(Pico)綠、赫斯特(Hoechst) 33258、Y0-PR0-I和 Υ0-Υ0-Ι、SYTO 9、LC Green 、LC Green Plus+、EvaGreen 。這些飽和染料能在擴增期間或擴增后以對DNA足夠飽和的情況存在，而同時對PCR的抑制最小。例如，在最大PCR 相容濃度下，所述dsDNA結合染料具有至少50 %的飽和比例。在其他實施方式中，所述飽和比例為至少80%。在其他實施方式中，所述飽和比例為至少99%。應理解飽和比例是相較飽和濃度下同一染料熒光的熒光百分比。飽和濃度是在預定量的dsDNA存在下可提供最高熒光強度的濃度。由于這些染料可以明顯較高的濃度存在而不顯著干擾特定核酸反應，其在監控單鏈核酸和dsDNA的構象上特別有用。優選的反應為聚合酶鏈式反應。所述探針優選選自下組=TaqMan探針、分子信標探針、蝎形探針和光循環儀探針。 擴增產物的檢測本身可通過使用下述探針之一完成=TaqMan探針、分子信標探針、蝎形探針、光循環儀探針、雜交探針、置換探針和其他類型的序列特異性探針形式。
TaqMan⑧測試利用Taq DNA聚合酶的5 ‘核酶活性切割熒光標記探針(FAM 標記的 ΙΟ)。分子信標是形成莖環結構的單鏈寡核苷酸雜交探針(圖幻。所述環包括與目標序列互補的探針序列，且所述莖由定位在探針序列任一側的互補臂序列退火形成。熒光團共價連接在一個臂的末端且淬滅劑共價連接在另一臂的末端。分子信標游離在溶液中時不發熒光。然而，當它們與包含目標序列的核酸鏈雜交時，其發生構型改變從而能明亮地發出熒光。沒有目標時探針是暗的，因為莖將熒光團和非熒光淬滅劑放置很近從而它們短暫共享電子，消除了熒光素發出熒光的能力。當探針遇到目標分子時，其形成比莖雜交物更長且更穩定的探針-目標雜交物。所述探針-目標雜交物的剛性和長度阻止所述莖雜交物同時存在。結果，所述分子信標經歷自發構象重組從而迫使所述莖雜交物解離且所述熒光團和所述淬滅劑彼此離開，恢復熒光。進行基因擴增前在實驗混合物中加入分子信標并實時測量熒光。分子信標可合成具有不同顏色的熒光團，使得本發明方法能夠完成。所得熒光顏色(如果有)聯合所述解鏈溫度的測量來識別病原體。蝎形引物(圖幻是雙功能分子，其中引物與探針共價連接。所述分子也包括熒光團和淬滅劑。沒有目標時，所述淬滅劑幾近吸收熒光團發出的熒光。在蝎形PCR反應期間， 存在目標時所述熒光團和所述淬滅劑分離，其導致發出熒光的增加。所述熒光可在所述反應管中檢測和測量。光循環儀FRET探針系統是一對單鏈熒光標記的寡核苷酸。探針1 (供體探針)在其3'末端用供體熒光團(常用熒光素)標記且探針2 (受體探針)在其5'末端用四種可用的熒光團之一(紅610、640、670或705)標記。探針2的3'游離羥基基團須用磷酸基團(P)封閉以防止TaqDNA聚合酶延伸。為了避免在兩探針上的所述供體和所述受體熒光團之間的任何空間問題，需要有l-5nt的間隔(4-25A的距離)以使這兩個探針彼此分開。 在進行任何實時定量PCR反應前，可在所述管內觀察到熒光背景。實時定量PCR退火步驟期間，PCR引物和光循環儀探針與其特異目標區域雜交使得所述供體染料與所述受體染料非常接近。當供體染料被來自光循環儀器的光(hYl)激發時，能量通過熒光共振能量轉移(FRET)從所述供體轉移到所述受體染料。所述能量轉移引起所述受體染料發出比所述儀器發射光(hYl)波長更長的光(hY》。所述儀器的光學單元檢測所述受體熒光的發射波長。測量的熒光信號的增加與積累的目標DNA量成正比。其他替代探針為遮蔽(Eclipse)探針(愛普客納米基因公司(Epoch，Nanogen)，置換探針(Cheng 等，Nucleic Acids Research，2004，卷 32，第 7 號)，普勒阿得斯(pleiades) 探針(NAR 2007卷35 5 e30)和普萊科塞(plexor)系統(普洛麥格公司(Promega))。當然本發明也包括其他探針系統。在本發明的一個實施方式中，所述TaqMan探針與用于熔點分析的插入染料相結
I=I O在另一實施方式中，所述TaqMan探針與用于熔點分析的雜交探針相結合，在具體實施方式
中所述TaqMan探針是所述雜交探針。在另一個實施方式中，所述TaqMan探針不是所述雜交探針而獨立的寡核苷酸用作雜交探針。理想情況下，所述筒包括用于熔點分析的更多的反應室。理想情況下，所述筒包括 3個或更多用于熔點分析的反應室，4個或更多用于熔點分析的反應室，5個或更多用于熔
10點分析的反應室，6個或更多用于熔點分析的反應室，7個或更多用于熔點分析的反應室或者8個或更多用于熔點分析的反應室。理想情況下，所述筒是一次性制品且當所述筒置于擴增設備中時進行所述擴增和熔點分析。擴增可通過上述不同的技術實現。加工所述筒的儀器需要提供由用于第一反應室的擴增技術規定的充足溫度分布。與擴增技術無關，所述儀器需提供用于更多反應室熔點分析的溫度分布。在圖4中，所述反應包括雜交探針和TaqMan探針。在此，(a)每探針組由例如至少兩種探針組成，其中所述探針是所述雜交探針，(b)各所述探針對核酸序列特異，(c)給定探針組里的各所述雜交探針(例如圖4中的BHQ UBHQ 2, BHQ 3)攜帶不同標記(參見例如圖1中的A列)，(d)當通過加熱從目標核酸序列上分離時，給定探針組里的全部所述探針具有相似的，優選相同的解鏈溫度(Tm)(參見例如圖1中的A列)。進行反應中的核酸序列的擴增，檢測擴增的核酸并測定各給定標記的探針從其結合的核酸序列上分離時的溫度。在此實施方式中，盡管不是本質上必須的，所述雜交探針的解鏈溫度優選低于擴增所用引物的解鏈溫度。圖5中給出了一個例子。在給定熔點(所述雜交探針Ql的熔點)的PCR反應期間，所述雜交探針Ql會對DNA鏈分離。所述雜交探針攜帶淬滅劑。一旦分離，下游TaqMan 探針會產生來自目前不再被淬滅的熒光標記的信號。已知所述信號引起所述熔點(熔點 mpl)。所述標記已知(FLl)。因此，可確定此雜交標記對例如病原體l(pl)特異，因此可知該病原體存在于所述反應中。同時所述TaqMan探針允許在PCR反應期間在線定量。但本發明的檢測步驟在所述第二或更多室中進行。或者所述反應額外包括雙鏈核酸特異性染料。如果使用雙鏈特異性染料，則所述染料優選選自下組綠I、STOR 金、溴化乙啶、溴化丙錠、皮可綠、赫斯特33258、 YO-PRO-I 和 YO-YO-I，特別優選 SYBR 綠 I。本發明理想情況下，所述雙鏈核酸特異性染料在光譜上可區別于所述探針標記。理想情況下，所述標記是熒光標記且所述標記選自下組FAM(5-或6_羧基熒光素)、VIC, NED、熒光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、HEX、ΤΕΤ、TAMRA, JOE、 ROX、BODIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅、雅基馬黃、Alexa Fluor PET、Biosearch Blue 、Marina Blue 、Bothell Blue , Alexa Fluor, 、350FAM 、SYBR 綠 1、熒光素、EvaGreen 、AlexaFluor, 488J0E 、VIC 、HEX 、ΤΕΤ 、CAL Fluor .金 540、 Yakima Yellow 、ROX 、CAL Fluor 紅 610、Cy3. 5 、Texas Red ,Alexa Fluor 、568Cy5 、 Quasar 670>LightCycIer Red640 、Alexa Fluor 633Quasar 705、LightCycler Red705 、Alexa Fluor 680、SYT0 9、LC Green 、LC Green Plus+、EvaGreen 。在優選的實施方式中，使用不對稱引物濃度。這通過改變各靶標的兩種引物比例實現，產生結合所述探針的DNA鏈的引物加入濃度高于另一引物。本實施方式還優選所述雜交探針的解鏈溫度(Tm)低于所述聚合酶表現出其最優活性的溫度。這提供了雜交探針的分離且為聚合酶與TaqMan探針提供便利。顯然在理想情況下所述方法使用表現出5' -3'外切酶活性的聚合酶。實時PCR需要由熱循環儀、計算機、用于熒光激發和發射收集的光學裝置，和數據獲取和分析軟件組成的儀器平臺。這些機器可獲自數個工廠，其差異在于樣品容量(一些是96孔或384孔標準平板型，其他處理較少的樣品或需要特殊玻璃毛細管，一些具有封閉形式，其他有轉盤(carousel))、激發方法(一些用激光器，其他用具有可調濾片或者一個或多個二極管的寬譜光源)、檢測(一些用相機，其他用光電倍增管，或各種類型的光檢測系統)和總體靈敏度。在所述軟件如何處理數據方面也有平臺特異性差異。原則上包含兩個或更多檢測通道的機器可適用于本發明的方法。在任何情況下所述設備必須裝有本發明的筒(也見圖8和9)。理想情況下，所述筒是一次性制品且當所述筒置于熱循環裝置或限制于等溫擴增的擴增裝置中時進行所述擴增和熔點分析。本發明方法的一個實施方式中，所述等溫擴增設備包括轉子且當所述筒在所述轉子中時進行所述擴增和熔點分析并且通過離心力完成所述至少部分擴增反應向所述筒的
第二、第三和更多反應室中轉移。本發明還包括實施用于擴增和檢測目標核酸序列的方法的筒，其包括(i)用于擴增反應的第一反應室，(ii)兩個或更多反應室，其中之一包含至少3種對核酸序列特異的探針，其中至少兩種探針攜帶相同標記，其中攜帶相同標記的各探針的解鏈溫度(Tm) 和具有相同標記的另一探針有大于2°C的差異，其中所述攜帶相同標記的探針在解鏈溫度 (Tm)上不同從而它們可通過熔點相區分，以及所述第一和所述兩個或更多反應室之間的連接。理想情況下所述筒為微流體筒。所述筒可具有一定流徑(也稱為“流動通道”)，即所應用的液體流過所述筒的路徑。所述反應室排列在所述流徑中，從而液體流經或流入所述模塊。例如它們可能串聯或平行排列，如允許使用多通路。當串聯排列時，所述多孔阻擋層的孔徑可沿著所述流徑減小以避免堵塞。所述模塊可包括固定的、溶液中的或干燥的不同或相同探針。當包含不同探針時，可以同時檢測不同分析物。所述探針可固定于所述檢測室的顆粒上。因此本發明結合流通式和拂過式裝置的特性，從而提供這兩種裝置的特定優勢。所述反應室還可包括核酸例如DNA、RNA、適配體、抗體、Fab片段、Fc尾。其他探針可以是蛋白質例如受體、抗體。另外的抗體可以多克隆或/和單克隆抗體形式使用。在檢測步驟期間裝有所述筒的裝置優選還包括檢測裝置(“檢測器”)，優選光學讀取。檢測裝置可選自由以下組成的組用于測量光的吸收或發射的光電二極管光傳感器、 用于測量來自探針陣列的光學信號的CCD相機、共聚焦顯微鏡、GMR(巨大磁性電阻)傳感器一用于磁性顆粒、伽瑪檢測器(放射性同位素)、電容橋一用于測量介電性質的變化。優選地，所述檢測器可以是熒光檢測器，用于檢測例如含熒光標記的分析物的熒光。本文所有光學檢測器可稱為“光學讀取”。在一個實施方式中，各檢測室存在一個檢測裝置，在其他實施方式中，兩個或更多檢測室共享同一檢測器。所述轉子的優勢在于所述室可飛越即穿過所述檢測器而且僅需要一個。所述筒優選是微流體裝置，其允許液體在封閉系統中從第一反應容器轉移到至少兩個更多的反應容器中。所述流體轉移優選通過離心力或壓力產生技術(泵機制)實現。 所述反應室之間的流體連接設計使第一反應室的反應液體分流為所需數量的部分。這可通過不同方法實現。對于離心液體轉移，第一和第二反應室之間的連接通道設計決定了轉移液體所需的離心力。或者，所述筒設計中可包括閥門技術(不優選)以調節所述室之間的液體轉移。所述筒可由聚合材料制成。材料優選聚丙烯、聚苯乙烯、C0C、聚碳酸酯、PMMA等。 所述材料優選具有低自發熒光的透明材料。所述筒優選機械加工、熱模壓印或注模。
本發明還涉及PCR裝置中依據本發明的筒。本發明的引物和探針可對各目標特異，例如疾病標記物、病原體、法醫標記物或可通過擴增方法涉及的任何其他目標。本發明特別適用于病原體分析。最常見的細菌疾病是結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的結核病，其每年殺死約200萬人， 大部分在撒哈拉沙漠以南的非洲。致病性細菌導致其他全球性的重大疾病，如可由細菌如鏈球菌(Mi^ptococcus)和假單胞菌O^seudomonas)引起的肺炎，和由細菌如志賀桿菌 (Siigella)、彎曲桿菌(Campylobacter)和沙門菌(Salmonella)引起的食源性疾病。致病性細菌也引起感染如破傷風、傷寒、白喉、梅毒和麻瘋病。食物或水被污染的主要途徑之一是未處理污水釋放到飲用水供應中或農田上，導致吃或喝污染源的人受到感染。在發展中國家大多數污水排放到環境中或農田上。這是霍亂、甲肝、脊髓灰質炎和輪狀病毒的感染介質傳播的典型模式。因此，在一個實施方式中，所述引物和探針對一種或多種致病性細菌特
已所述筒可用于人或獸醫診斷、用于檢測食物或水、用于法醫應用或用于科學目的。 實施例實施例1用熒光標記的探針進行多重實時PCR和隨后解鏈曲線分析的本發明方法的技術概念的實施方式在本實驗中，將證實圖中所示的技術概念的可行性。所述反應如下表所示組成，其設置為四重反應并按表6所示的實驗方案進行。用表8的試劑實現此目的。20x引物混合物和50x探針混合物的組成分別示于表2和3。所述引物和探針的序列示于表1。用來自人白細胞的cDNA作為PCR中的模板核酸生成PCR產物，且用于各靶標的正向和反向引物示于表1，用QiaQuick (凱杰公司，Qiagen) PCR純化試劑盒純化PCR產物并1 1000稀釋使用。如表9所示在單獨的反應中加入模板在第一種情況“僅IC”下，僅加入Ubi模板作為內部陽性對照。在第二種情況下，加入W^i IC和靶標lAlb。在第三種情況下，加入W^i IC 和靶標2Cmyc。在第四種情況下，引入Ubi IC和靶標3TBP。在第五種情況下，加入Ubi IC 和靶標4GAP。對于第六種情況，加入Ubi IC和靶標5SRY作為模板。在具有72位轉子的RotorGene 6000PCR系統(6通道)上進行實時PCR。6檢測通道的規格示于表5，包括適于在各通道中檢測的熒光染料的例子。PCR循環和隨后的解鏈曲線的參數示于表6。然后用適當的儀器軟件分析運行數據。在實時PCR中觀察到的內參(IC)Ct值和各靶標示于表10。檢測探針熔點(最大解鏈峰值示于圖8)，結果示于表11。四重反應在6 種不同實驗條件(表9)下觀察到的解鏈峰值示于圖8。所有反應顯示預期結果，表明CT值在正確的檢測通道中且檢測所加靶標的各探針具有含預期熔點的解鏈峰值。表1:靶標名稱和引物/探針序列寡核苷酸名稱序列(5’-3’)GAPDH 正向(SEQ ID NO. 1)TTCCACCCATGGCAAATGAPDH 反向(SEQ ID NO. 2)GAA GAT GGT GAT GGG ATT TCPE-GAPDH-P (SEQ ID NO. 3)CAA GCT TCC CGT TCT CAG CCSRY 正向(SEQ ID NO. 4)TCC TCA AAA GAA ACC GTG CATSRY 反向(SEQ ID NO. 5)AGA TTA ATG GTT GCT AAG GAC TGG ATSRY-TM-FAM (SEQ ID NO. 6)CAC CAG CAG TAA CTC CCC ACA ACC TCT TTALB 正向(SEQ ID NO. 7〉TGC CCT GTG CAG AAG ACT ATC TAALB 反向(SEQ ID NO. 8)CGA GCT CAA CAA GTG CAG TT
權利要求
1.在反應筒內擴增和檢測核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟 (i)提供包括至少一核酸分子的樣品，( )在所述筒的第一反應室內提供用于擴增反應的試劑，(iii)將所述樣品與擴增試劑混合，(iv)在所述筒的所述第一反應室內擴增所述至少一核酸，(ν)將至少部分所述擴增反應轉移到所述筒的各含有探針組的第二和第三反應室中，其中a.各探針組由至少3種探針組成，b.每種所述探針對核酸序列特異，c.每組至少有兩種探針攜帶相同標記，d.給定的探針組里攜帶相同標記的各探針的解鏈溫度(Tm)和所述探針組里具有相同標記的另一探針有大于2°C的差異，e.其中攜帶所述相同標記的探針在解鏈溫度(Tm)上不同，從而它們可通過熔點相區分，(vi)進行熔點分析以確定哪種所述探針特異性結合核酸。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增反應是多重聚合酶鏈式反應。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述至少1種探針組包含至少3種具有相同標記的探針。
4.如權利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述筒還包括用于熔點分析的反應室。
5.如權利要求1-4所述的方法，其特征在于，所述筒是一次性制品且當所述筒置于擴增設備中時進行所述擴增和熔點分析。
6.如權利要求5所示的方法，其特征在于，所述擴增設備包括轉子且當所述筒在所述轉子中時進行所述擴增和熔點分析并且通過離心力將所述至少部分所述擴增反應轉移至所述筒的第二、第三和更多反應室。
7.如權利要求1-6所述的方法，其特征在于，所述探針選自以下組=TaqMan探針、分子信標探針、蝎形探針和光循環儀探針、雜交探針和置換探針。
8.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述標記是熒光標記且所述標記選自下組:FAM(5-或 6-羧基熒光素)、VIC、NED、熒光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、 CY3. 5、CY5. 5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒岡綠、羅丹明綠、羅丹明紅、德克薩斯紅、雅基馬黃、Alexa Fluor PET、Biosearch Blue 、Marina Blue 、Bothell Blue 、Alexa Fluor 、350FAM 、SYBR 綠 1、熒光素、EvaGreen 、Alexa Fluor 488JOE 、VIC 、 HEX 、ΤΕΤ 、CAL Fluor 金 540、Yakima Yellow 、ROX 、CAL Fluor 紅 610、Cy3. 5 、 Texas Red 、Alexa Fluor 、568Cy5 、Quasar 670、LightCycler Red640 、Alexa Fluor633Quasar 705、LightCycler Red705 、Alexa Fluor 680、SYTO 9、LC Green ,LC Green Plus+、EvaGreen 。
9.實施用于擴增和檢測目標核酸序列的方法的筒，所述筒包括a.用于擴增反應的第一反應室，b.兩個或更多反應室，其中之一包含至少3種對核酸序列特異的探針，其中至少兩種探針攜帶相同標記，其中攜帶相同標記的各探針的解鏈溫度(Tm)和具有相同標記的另一探針有大于2°C的差異，其中所述攜帶相同標記的探針在解鏈溫度(Tm)上不同，從而它們可通過熔點相區分，c.所述第一和所述兩個或更多反應室之間的連接。
10.如權利要求9所述的筒，其特征在于，所述筒是微流體筒。
全文摘要
本發明涉及在反應筒內擴增和檢測核酸序列的方法，其包括下述步驟，(i)提供包括至少一核酸分子的樣品，(ii)在所述筒的第一反應室內提供用于擴增反應的試劑，(iii)將所述樣品與所述擴增試劑混合，(iv)在所述筒的所述第一反應室內擴增至少一核酸，(v)將至少部分所述擴增反應轉移到所述筒的各含有探針組的第二和第三反應室中，其中(a)各探針組由至少3種探針組成，(b)每種所述探針對核酸序列特異，(c)每組至少有兩種探針攜帶相同標記，(d)給定的探針組里攜帶相同標記的各探針的解鏈溫度(Tm)和所述探針組里具有相同標記的另一探針有大于2℃的差異，(e)其中攜帶所述相同標記的探針在解鏈溫度(Tm)上不同，從而它們可通過熔點相區分，(f)進行熔點分析以確定哪種所述探針特異性結合核酸。
文檔編號C12Q1/68GK102428189SQ201080020321
公開日2012年4月25日 申請日期2010年5月4日 優先權日2009年5月5日
發明者A·文德, H·恩格爾, R·西麥爾里奇, R·達爾克, T·羅斯曼 申請人:恰根有限公司