專利名稱：改善磷酸鹽在植物中溶解性的方法
技術領域：
本發明涉及將具有高水平吲哚-3-乙酸(IAA)的細菌用于農業應用，例如改善農業產量和增加植物生長肥料的可用性。
背景技術：
氮(N)和磷(P)是植物生長的主要限制因素。一些微生物改善N和P的攝取和可用性，使化學肥料依賴性最小。與別的主要營養如氮相比，磷(P)是迄今多數土地情況中最少移動和植物可利用的。盡管土壤中富含有機和無機形式的P，但其經常是植物生長主要甚至首要的限制因素。 全世界許多土壤是缺乏P的，因為即使是在肥沃的土壤中，游離濃度(植物可利用的形式) 通常仍較低，這是由于可溶性P與鈣、鐵或鋁的高反應活性導致P沉淀(36，41)。此外由于成本限制，在發展中國家中沒有廣泛使用提供三種主要植物營養(N、P和鉀)的化學肥料。 在這些地區，磷酸鹽巖(Phosphate Rock, PR)的直接應用越來越多，即使I3R釋放的P通常對于作物生長來說太少(9，38)。已知許多微生物，特別是假單胞菌屬(Pseudomonas)、桿菌屬(Bacillus)和根瘤菌屬(Rhizobium)，具有改變它們代謝的能力以響應細胞生長可用的磷。代謝的轉變通過抑制和誘導不同基因來介導，所述基因的產物涉及范圍從P源的攝取和獲得到新細胞組分的從頭合成(36，18)。此外，體外研究顯示在一些這類細菌中觀察到P 溶解活性和生長素吲哚-3-乙酸(IAA)的生成(39，17)，盡管沒有證明連接IAA生成和P溶解的直接關聯。在不同的微生物中研究P攝取。包括苜蓿根瘤菌(S.meliloti)在內的許多細菌具有至少兩種P轉運系統，與高和低親和力轉運系統相一致。所述高親和力系統由Ph0CDET 操縱子編碼，而低親和力系統由pit (在orfA-pit操縱子內)編碼。在苜蓿根瘤菌中編碼兩種P轉運系統的基因表達受PhoB激活劑控制。在P過量情況下，PhoB失活，pho⑶E環表達。在P有限的情況下，所述低親和力Pit通透酶系統受活化的PhoB抑制，而高親和力 PhoCDET系統被誘導并變為P轉運的主要機制(10)。許多菌株含有產物pstSCAB同系物作為高親和力磷酸鹽轉運子。在沒有磷脅迫時觀察到苜蓿根瘤菌1021的pstC ORF中的1堿基缺失很可能負責(通過PhoB) 12個磷饑餓誘導基因的中等組成型激活(24，43)。在植物和微生物中，PR溶解的主要機制是H+分泌、有機酸生成和酸性磷酸酶生物合成(2，3)。包括乙酸、乳酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸、檸檬酸、葡糖酸、酮葡糖酸等的有機酸可與磷酸鐵和磷酸鋁中的鐵或鋁形成復合體，從而將植物可利用的磷酸鹽釋放到土壤中(18， 22)。有機酸還可通過阻斷土壤顆粒的P吸收位置或通過與土壤礦物表面的陽離子形成復合體來提高P利用率(36)。大多數有機磷化合物的礦物化通過磷酸酶進行。土壤中這些酶的主要來源被認為是微生物來源。具體地，磷酸酶活性在根圍明顯增加。多數土壤的PH值從酸性到中性。因此，酸性磷酸酶在此過程中應起主要作用(36)。在本發明中，分析了苜蓿根瘤菌1021株RD64的P溶解能力和其對苜蓿宿主植物生長的影響。
本作者使用苜蓿根瘤菌_截形苜蓿(S. meliloti-M. truncatula)系統，因為所述細菌可利用微陣列且苜蓿是用于不確定的根瘤發育的公認模式系統。所述RD64株之前已工程改造為過量生成IAA(11，35)，顯示其能在液體生長培養基中釋放與野生型1021相比最多78倍的IAA (12，21)。之前也有報道稱在用IAA處理的大腸桿菌(E.coli)細胞(7)中發現RD64更加耐鹽以及其他非生物脅迫(5)。被該株根瘤化的苜蓿植物具有較高程度的保護免受鹽脅迫誘導的氧化損傷(5)。此外，之前證明IAA以尚未了解的機制引發非常遠的系統如轉化人細胞(15)、大腸桿菌(8)和苜蓿根瘤菌(21)的三羧酸循環或檸檬酸循環、TCA循環中酶的誘導。為了評價苜蓿根瘤菌RD64中IAA過量生成引發的總體效應，用微陣列分析比較了野生型1021和RD64及用IAA和其他四種化學上或功能上相關的分子處理的1021的基因表達圖譜。在RD64和IAA處理的1021細胞差異表達的基因中，本作者發現pho操縱子的兩個基因。該意外發現引導作者檢測RD64中礦物P溶解機制和P饑餓情況下該菌株改善苜蓿生長的潛在能力。P饑餓情況定義為細菌1021或RD64在含有1. OmM磷酸鉀的培養基中生長時段。自由生長條件下觀察到RD64的酸性磷酸酶活性和有機酸分泌的提高。此外，從被該菌株根瘤化的苜蓿植物根部滲出的有機酸含量高于被1021野生型菌株根瘤化的植物所測。此效應與觀察到的這些植物中增加的P溶解和植物干重生成相關聯。發明描述本發明中，用W000/28051 (RD64 株)所述的質粒 pG-Promintron-iaaM-tms2 將苜蓿根瘤菌1021株工程改造為過量生產植物激素IAA。本領域技術人員應理解也可工程改造其他株系。本發明意外發現RD64可高效地從不可溶來源如磷酸鹽巖(PR)中活化P。在P有限條件下，RD64相較1021野生型菌株更高的P活化性與所述高親和力P轉運系統的編碼基因上調、酸性磷酸酶活性的誘導和分泌到生長培養基中的馬來酸、琥珀酸以及富馬酸的增加相關聯。P有限條件在僅細菌生長于確定的最小培養基時涉及5%的PR濃度，或在1021 或RD64根瘤化的苜蓿植物生長于確定的最小培養基時涉及0. 02%的PR濃度。在P有限條件下生長時，與所述野生型菌株(Mt-1021)根瘤化的植物相比，RD64(Mt-RD64)根瘤化的截形苜蓿(Medicago truncatula)植物釋放較高含量的另一種P溶解有機酸，2_羥戊二酸。已證明與Mt-1021植物相比，Mt-RD64植物顯示出較高的干重生成。本作者在此報道了與P有限的Mt-1021植物相比，P有限的Mt-RD64植物的芽和根鮮重也表現出顯著增長。本作者討論了在根瘤菌屬-豆科(rhizobium-legume)模式系統中，與細菌IAA過量生產而不是IAA生產相連的不同因子的平衡相互作用本身是如何在脅迫環境條件下(具體是在P有限情況下)刺激植物生長。因此，能夠為植物生長提供溶解P的土壤細菌如RD64，對改善農業產量特別有利，特別是在熱帶地區如化學肥料使用有限且有大量可利用I3R資源的撒哈拉沙漠以南 (sub-Saharan) jftlK。因此本發明的一個目的是將具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的細菌用于溶解土地中的磷酸鹽巖，其中所述細菌通過轉化能夠增加IAA含量的試劑的編碼基因而獲得。
能夠增加IAA含量的所述試劑優選為吲哚乙酰胺水解酶(iaaM)或色氨酸一氧化物酶(tms2)。 在一個優選的實施方式中，所述細菌屬于根瘤菌屬。所述根瘤菌屬的細菌優選苜蓿根瘤菌種。所述細菌還優選能生成吲哚-3-乙酸(IAA)植物激素。所述細菌還優選包含在豆科植物根瘤中。本發明的另一個目的是為可根瘤化的植物和/或所述植物生長周邊土壤提供可溶性磷的方法，其包括用具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的細菌誘導所述植物根瘤化，其中所述細菌通過轉化能增加IAA含量的試劑的編碼基因而獲得。能夠增加IAA含量的所述試劑優選為吲哚乙酰胺水解酶(iaaM)或色氨酸一氧化物酶(tms2)。所述細菌優選屬于根瘤菌屬。所述根瘤菌屬的細菌還優選是苜蓿根瘤菌種。所述細菌還優選能生成吲哚-3-乙酸(IAA)植物激素。所述細菌優選包含在豆科植物根瘤中。通過涉及下圖的非限制性實施例闡述本發明。圖Si.在P充足條件下(13mM磷酸鉀)，苜蓿根瘤菌細胞中pho操縱子基因的定量 RT-PCR分析。在RD64和用0. 5mM IAA、IncU Trp, ICA和2，4_D處理的1021細胞中高度表達的基因相對表達水平大于1。在1021細胞中高度表達的基因的相對表達水平小于1(對照)。誤差線代表三次獨立生物實驗的標準偏差。
圖1.在P饑餓條件下，苜蓿根瘤菌細胞中pho操縱子基因表達的定量RT-PCR分析。在RD64和用0. 5mM IAA、Ind、Trp, ICA和2，4_D處理的1021細胞中高度表達的基因相對表達水平大于1。在1021細胞中高度表達的基因的相對表達水平小于1(對照)。誤差線代表五次獨立生物實驗的標準偏差(P < 0. 05)。圖2. P饑餓條件下苜蓿根瘤菌細胞中酸性(A)和堿性(B)磷酸酶活性。生長在 MOPS緩沖最小培養基(起始P濃度=13mM)中的對數期細胞經清洗且隨后在不含添加卩(1021和1 64株系)和含有0.5^^、撲？或111(1(1021株系)的相同培養基中重懸。在 30°C下進行3小時處理。數值為四次獨立生物實驗的平均值士SD (ρ < 0. 05)。圖3.釋放到含有5% PR作為P源的苜蓿根瘤菌培養物里的可溶性磷酸鹽。數據為四次獨立生物實驗的平均值士SD(p < 0. 006)。圖S2.細菌上清㈧和根分泌物樣本⑶里的有機酸在210nm處的HPLC色譜圖。 箭頭指向GC-MS鑒定的峰。數字對應下列酸(1)馬來酸，(2)琥珀酸，(3)富馬酸和(4) 2-羥
戊二酸。圖4.釋放到含有5%磷酸鹽巖I3R作為P源的無細菌培養基里的可溶性磷酸鹽的變化(生長在含ra的最小培養基中的細菌的P有限條件)。在生長培養基中加入所述有機酸㈧馬來酸、琥珀酸和富馬酸至模擬1021(0A-1021)、用0.5mM IAA處理的 1021(0A-1021+IAA)和RD64細胞(0A-RD64)釋放量的水平。在生長培養基中加入所述2-羥戊二酸(B)至模擬Mt-1021(0A-Mt-1021)和Mt_RD64 (0A_Mt_RD64)植物釋放量的水平。加入的各有機酸量源自HPLC分析獲得的數據且在材料與方法部分給出。數據為五次獨立生物實驗的平均值士SD(p < 0. 006)。圖5.細菌IAA過表達對截形苜蓿生長的影響。㈧在P有限(0. 02% PR)和P充足(多于SmM磷酸鉀)條件下生長了 4周的植物表型。(B)如(A)所述生長1周的植物根的表型。如㈧所述生長的植物的(C)芽鮮重，⑶根鮮重。數據為平均值士SD(n = 30， ρ < 0. 001)。材料和方法細菌生長條件所述苜蓿根瘤菌野生型1021株和所述包含p-iaaMtms2構建體的過量生成IAA的 RD64株如前所述(12，21)。用于根瘤菌屬(RMM)的標準甘露醇最小培養基改良成含有作為碳源的(w/v)甘露醇、(w/v)氯化銨、用以緩沖的IOmM嗎啉丙磺酸(MOPS ；pH 7.0) 和加至終濃度ImM (P饑餓)和13mM(P充足)的P(KH2PO4)。按所需加入抗生素(5)。P 消耗對于P饑餓實驗，1021野生型和RD64菌株的細胞于30°C在含有1 % (w/v)甘露醇作為碳源和13mM P的RMM肉湯中生長到對數期中期(0D_ = 0. 6)，用不含P的RMM清洗，重懸于相同的培養基且隨后分成3組培養物。無P (-P) U. OmM P (P饑餓細胞)或13mM P (+P 細胞也稱為P充足細胞)分別加入所述三組培養物中。所述P饑餓和P充足1021野生型細胞用0. 5mM IAA處理3. 0小時。為了檢測IAA效應的特異性，將其他四種酸度范圍從酸 (pH 2.9)到弱酸(pH 6. 1)的選定化合物〔吲哚(Ind)，色氨酸(Trp)，吲哚-3-羧酸(ICA) 和2，4- 二氯苯氧基乙酸(2，4-D)〕溶于50% (w/v)乙醇并加入到P饑餓和P充足的1021 野生型細胞中至終濃度為0. 5mM。新介紹的IAA生物合成途徑用Trp生成IAA，因此提出了所述RD64細胞是否Trp饑餓的問題。確實，如作者所述細菌中有將Trp轉變為IAA的兩種新基因，所述兩種基因可能非常有效以至周圍一有Trp分子它們就將其轉變為IAA而沒有 Trp參與蛋白合成。為了排除此細菌可能部分對Trp饑餓，RD64細胞還用0. 5mM Trp處理并用微陣列和RT-PCR分析。最終，為了避免溶劑干擾，用相似量的乙醇溶液處理對照細胞。 每個處理3小時后，分批收集細胞，冷凍并儲存在-80°C用于實驗。對于磷酸鹽溶解實驗，用5%摩洛哥(Moroccan)磷酸鹽巖(PR)(西格瑪-艾爾德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目錄號32)作為P源。當5% I3R用作P源以允許細菌生長時描述為P有限條件。持續進行至少五次獨立實驗。微陣列分析用前述方法對比生長在P充足(13mM)條件下的1021未處理細胞(對照)和 RD64、1021+IAA、1021+Ind、1021+Trp、1021+ICA 和 1021+2，4-D 細胞的基因表達圖譜，如 Imperlini 等報道(21)。RT-PCR 分析如前所述(5)分離P充足和P饑餓細胞的總RNA。用StrataScript 反轉錄試劑 (司查塔基公司(Stratagene))和作為引物的隨機六聚體來合成cDNA。用Power SYBR PCR Master Mix (應用生物系統公司(Applied Biosystems))進行定量PCR。反應在iCycler iQ(伯樂(Bio-Rad))上進行。熱循環條件為95°C 15分鐘，40個循環的95°C變性20秒、 72°C退火(20秒)和延伸(35秒)。用Primer3軟件設計的特異引物對如下。phoB :5，-TTACGTCGTCAAGCCCTTCT-3，(SEQ ID Ni)禾口
5，-CCGGTGAGGACATGAGAAAT-3，(SEQ ID N2)；phoC 5' -ACTCCTGCGCATGATAAACC-3，(SEQ ID N3)禾口5，-TGTTGAGGACGCTCAGTACG-3，(SEQ ID N4)；phoD :5，-TATCTCGTTCCCCTCGTCAC-3，(SEQ ID N5)禾口5，-ACCTTTGTCGACCATCTTGC-3，(SEQ ID N6)；phoE :5，-GCTTCATCCTGTGCTTCCTC-3，(SEQ ID N7)禾口5，-AGACCTTCCTCCGGTTTCAT-3，(SEQ ID N8)；phoT :5，-TGGCGTCGTTCTTTACATGA-3，(SEQ ID N9)禾口5，-GTCTCCTTTTCGAGCGTGAC-3，(SEQ ID N10)；smc02641 :5，-CGAGAGGTGATGACGGAAGT-3，(SEQ ID Nil)禾口5，-ACCGACTTTCTCGCACAGAT-3，(SEQ ID N12)；smc00128 :5， -CTTCAGCATGAACGACCAGA-3， (SEQ ID N13)禾口5，-AAGAACCGCGTAACCTTCCT-3 ‘ (SEQ ID N14)；如前所述(8)，在比較Ct值法中smc02641和smc00128作為管家基因用于數據歸一化。磷酸酶活性如前報道(16)在P有限條件下對堿性和酸性磷酸酶進行分析。報道的單位為 nmol/分鐘/mg蛋白。用Bradford檢驗確定蛋白濃度。磷酸鹽溶解用Saheki等所述的改良菲斯克和撒拜羅法(Fiske and Subarrow)評估可溶性磷酸鹽濃度(37)。植物生長條件。如前報道(5)，截形苜蓿Jemalong 2HA變種的種子經表面滅菌、發芽并轉移到溶液培養單元中。通過提供包含ImM CaCO3和1. ImM KCl (分別替代7. 3mM CaHPO4和1. ImM K2HPO4)的改良延森(Jensen)培養基實現P有限條件。這些植物僅在第一周接受0. 02% 冊。為了收集分泌物，清洗四周齡植物的根、蒸餾水浸沒并在生長室放置48小時。分泌物蒸發至干并用HPLC分析。峰值一致性用GC-MS確定。有機酸和磷酸鹽釋放基于培養物上清中有機酸生成分析獲得的結果，將蘋果酸(MA)、琥珀酸(SU)、富馬酸(FU)和2-羥戊二酸(2HG)加入無細菌培養基中，并測量可溶性磷酸鹽濃度。對于1021 生長刺激條件，加入1.4mg/l FU, 500mg/l MA和lg/1 SU0對于1021+IAA生長刺激條件， 加入 16mg/l FU,860mg/l MA 和 860mg/l SU。對于 RD64 生長刺激條件，加入 5. 6mg/l FU, 840mg/l MA和3. lg/1 SU0對于Mt-1021和Mt_RD64生長刺激條件，分別加入2HG至終濃度49. 6mg/l和115. 2mg/l。無細菌培養基也用0. 5mM IAA溶液處理。刺激生長的培養基是無細菌或其上清的培養基。所述培養基僅包含市售純化粉末(西格瑪公司(SIGMA))的RP 和有機酸，所用有機酸濃度為生長在確定的培養基(含或不含IAA或來自RFD64)中的所述細菌生成的有機酸濃度。用HPLC測量有機酸通過HPLC用反相海波西爾金(Hypersil GOLD) C18 (IOOx 4. 6mm)柱(賽摩電子公司(Thermo Electron Corporation))測量所述有機酸。操作條件和定量如前所述(20)。GC-MS 分析收集自HPLC的有機酸部分經干燥、衍生為其叔丁基二甲基甲硅烷基(tBDMS)衍生物并在Micromass GCT質譜分析儀(英國曼徹斯特的沃特斯公司(Waters corp))上分析，所述分析儀連接裝有7683自動取樣器(加州帕洛阿爾托的安捷侖技術公司(Agilent Technologies))和ZB-5ms (英國麥克爾斯菲爾德的飛諾麥克斯公司(Phenomenex))毛細管柱(30m χ 0. 25mm I. D. χ 0. 25 μ md. f.，有 5m 保護柱)的安捷倫(Agilent) 6890 系列氣相色譜儀。用無分流注射技術在250°C和2. Oml/分鐘氦氣流下注射樣本。烘箱設為70°C 持續2分鐘，然后以7°C /分鐘逐步升溫至350°C并持續5分種。所述GC界面和源溫度設為250°C并在70eV以1光譜/秒的獲得速度從0到47分鐘獲取EI+質譜圖。從現有質譜和羅薩穆斯特研究有限公司(Rothamsted Research LTD，英國哈彭登赫特福德)之前分析的標準品的保持時間數據或從NIST質譜數據庫與獲自文獻(30)的保持時間數據聯用來鑒定色譜峰值。采用M\M-15+、M-57+在5ppm內的精確質量測量來核實分析物鑒定。各樣本獲得的色譜圖與衍生試劑空白對比。數據分析用單向方差分析(ANOVA)和徒吉(Tukey)多重比較測試對數據進行統計學評估。結果pho操縱子基因調控本作者用轉錄譜分析法在P充足(13mM)條件下評價了苜蓿根瘤菌細胞中IAA過量生成引發的總體效應。本作者用野生型1021的基因表達圖譜和RD64及用IAA處理的 102K1021+IAA)的基因表達圖譜作比較。為了確定IAA效應的特異性，本作者還比較了未處理的1021細胞與四種化學或功能相似分子如吲哚(1021+Ind)、色氨酸(1021+Trp)、 吲哚-3-羧酸(1021+ICA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(1021+2，4-D)的表達圖譜(42)(表 S1-S6)。
權利要求
1.具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的細菌在溶解土地內磷酸鹽巖的應用，其中所述細菌通過轉化能夠增加IAA含量的試劑的編碼基因而獲得。
2.如權利要求1所述的細菌應用，其特征在于，所述能夠增加IAA含量的試劑為吲哚乙酰胺水解酶(iaaM)或色氨酸一氧化物酶(tms2)。
3.如權利要求2所述的細菌應用，其特征在于，所述細菌屬于根瘤菌屬。
4.如權利要求3所述的細菌應用，其特征在于，所述根瘤菌屬的細菌是苜蓿根瘤菌種。
5.如權利要求4所述的細菌應用，其特征在于，所述細菌能生成吲哚-3-乙酸(IAA)植物激素。
6.如權利要求1-5所述的細菌應用，其特征在于，所述細菌包含在豆科植物根瘤中。
7.—種為可根瘤化的植物和/或所述植物生長周邊土壤提供可溶性磷的方法，所述方法包括用具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的細菌誘導所述植物根瘤化，其中所述細菌通過轉化編碼能增加IAA含量的試劑的基因而獲得。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述能夠增加IAA含量的試劑為吲哚乙酰胺水解酶(iaaM)或色氨酸一氧化物酶(tms2)。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述細菌屬于根瘤菌屬。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述根瘤菌屬的細菌是苜蓿根瘤菌種。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述細菌能生成吲哚-3-乙酸(IAA)植物激素。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述細菌包含在豆科植物根瘤中。
全文摘要
本發明涉及將具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的細菌用于溶解土地中的磷酸鹽巖(phosphate rock)，其中所述細菌通過轉化能夠增加IAA含量的試劑的編碼基因而獲得。
文檔編號C12N1/21GK102414311SQ201080020013
公開日2012年4月11日 申請日期2010年3月23日 優先權日2009年3月23日
發明者R·德費 申請人:國家研究院