專利名稱：基于檢測slc45a3-elk4融合轉錄子的用于診斷前列腺癌的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及癌癥的診斷和治療領域。確切地說，本發明涉及基于檢測 SLC45A3-ELK4轉錄子的用于診斷前列腺癌的組合物和方法。
背景技術：
同其它易位腫瘤類似，前列腺癌中的成紅細胞特異性轉化基因(ETS)家族成員的染色體重排，可能代表了一種特定的前列腺癌亞類，其依據是有研究揭示了此類腫瘤變化的形態特征(Mosquera等人，J Pathol 2007 ；212 :91-101)、存活率(Attard等人，Oncogene 2008 ；27 :253-63 ；Cheville 等人，J Clin Oncol 2008；26 :3930-6 ；Demichelis 等人， Oncogene 2007 ；26 :4596-9)和特異性的表達譜(Setlur 等人，J Natl Cancer Inst 2008 ； 100:815-25)。雄激素調節的基因是5'基因組調控型啟動子元件的主要組成部分，在前列腺癌中其與ETS融合(Tomlins等人，Nature 2007 ；448 :595-9)。舉例來講，雄激素調節的跨膜蛋白酶的啟動子，絲氨酸2 (TMPRSS)基因被融合入轉錄因子ETS家族成員的編碼區域，即通常的v-ets骨髓成紅細胞增多癥病毒似6癌基因同源物(鳥類)(ERG) (Helgeson 等人，Cancer Res 2008 ；68 :73-80 ；Tomlins 等人，Cancer Res 2006 ；66 :3396-400 ；Han 等人.Cancer Res 2008 ;68 :76四_37)。這些融合基因的存在可以作為前列腺癌和其它類型腫癌治療的診斷標志物和合適的治療靶標。SLC45A3(溶質載體家族45，成員3)，又稱為普羅斯汀(prostein)，其是一前列腺特異的雄激素調節的基因，已有研究顯示其是ETVl 和 ETV5 的 5'伴侶 CTomlins 等人，Nature 2007 ；448 :595-9 ；Helgeson 等人，Cancer Res 2008 ；68 :73-80)。多數情況顯示SLC45A3重排發生在與ERG(80% )或者ETVl (10%)連接處，但是前列腺癌中剩余10%的SLC45A3的3'伴侶尚未鑒定出來。ELK4(ETS-功能域蛋白(SRF輔助蛋白1))，是轉錄因子ETS家族的一個成員，最近的研究將其描述為一種靶向 LNCaP細胞的新的雄激素受體，其能夠促進細胞生長(Malikonen等人，Oncogene 2008 ；Aug 21；27(36) :4865-76. Epub 2008 May 12)。
發明概述根據本發明，SLC45A3和ELK4之間的融合轉錄子首次被鑒定出來。已有研究顯示， 前列腺癌患者中這些轉錄子的表達水平較高。在一個實施例中，本發明提供了一種在患者中診斷癌癥的方法，例如診斷前列腺癌的方法，此方法的依據是測定患者樣本中SLC45A3-ELK4融合分子水平的升高情況。
在一個特定實施例中，融合分子是一轉錄子，其表示SLC45A3 mRNA的5'部分和 ELK4 mRNA的3'部分之間的融合。在一些實施例中，融合轉錄子包含SLC45A3 mRNA的5' 部分，該5‘部分至少包括SLC45A3的外顯子1，且其融合到ELK4 mRNA的3'部分，該3' 部分至少包括ELK4的外顯子2。在另一些實施例中，融合轉錄子包含SLC45A3的外顯子 1，和SLC45A3的外顯子2、3和4中的一個或多個外顯子的一部分，以及ELK4的外顯子2和 ELK4下游外顯子中的一個或多個。檢測中使用的適宜的樣品來源為包含核酸的生物樣品，生物樣品的例子包括前列腺組織、血液、尿液、精液、前列腺分泌物和前列腺細胞。可以通過多種技術包括基于雜交或者擴增的技術來實現對融合核酸分子的檢測。 可以使用專門設計用來選擇性的鑒定融合分子的那些引物和探針，包括那些與融合接頭處具有特異性的引物。可以通過任意已知的適于蛋白測定的方法來對那些來源于融合核酸分子的融合蛋白進行檢測，包括使用融合蛋白特異性抗體例如融合接頭處的特異性抗體的免疫檢測方法。在另一個實施例中，本發明提供了一種組合物和試劑盒，其包含可用于本發明診斷方法的試劑。在另一個實施例中，本發明提供一種鑒定可用于癌癥治療(例如前列腺癌)的試劑的方法，此方法的依據是確定試劑是否能夠抑制SLC45A3-ELK4融合分子在體外細胞中的生物功能或者降低SLC45A3-ELK4融合分子的水平。在另一個實施例中，本發明提供一種治療癌癥的方法，例如患者的前列腺癌，此方法是通過給予患者能夠抑制SLC45A3-ELK4融合分子的生物功能或者降低其水平的試劑來實現的。
圖la-Id.。前列腺癌、良性前列腺組織和LNCaP細胞中SLC45A3-ELK4 mRNA的檢測結果。la.染色體lq32. 1 (Chr. Iq32. 1)的示意圖，其示出了 SLC45A3和ELK4的位置和相對距離。紅色箭頭和線條分別表示SLC45A3-ELK4 TAQMAN分析引物和探針。lb. 31個前列腺癌樣品中的SLC45A3-ELK4和ELK4 mRNA水平相對于內控基因(TCFLl)水平的TAQMAN 表達數據，該表達數據被校準到相對于6個良性樣品中表達水平的平均值的倍數，其中具有高于10倍的相對SLC45A3-ELK4 mRNA水平的樣品以深紅色標注。右側的圖形示出了， SLC45A-ELK4 mRNA在10個癌細胞系和1個良性腎細胞系中的相對水平與其在良性前列腺上皮細胞系RWPE-I中的相對水平的比較。Ic.各種SLC45A3-ELK4 cDNA變異體(ν)的 cDNA測序結果，所用cDNA通過擴增(引物為箭頭所示)并使用凝膠從RCR和5' RACE (引物為箭頭所示)中分離獲得。所用SLC45A3-ELK4 cDNA變異體(ν)具體如下變異體1 SLC45A3 (外顯子1) -ELK4 (外顯子2)；變異體2 :SLC45A3 (外顯子1-2) -ELK4 (外顯子2)； 變異體3 :SLC45A3(截短的外顯子1)-ELK4 (外顯子2)；變異體4 :SLC45A3 (外顯子1，外顯子2的起點-外顯子4的末端)-SLC45A3和ELK4-ELK4 (外顯子2、之間84個堿基對的基因間序列；變異體5 :SLC45A3(外顯子1-外顯子4) -SLC45A3和ELK4-ELK4 (外顯子2)之間的基因間序列。Id.柱形圖示出了從6個尿液樣品分離得到的RNA的TAQMAN測定(圖Ia和Ib所示)結果。將SLC45A3-ELK4的原始值校準到相對于對照基因TCFLl的值，然后將顯示為陰性癌癥結果的活檢材料的SLC45A3-ELK4值設為1。圖Id示出了其它5個樣品 (C08、C03、C33和C30對應于癌癥陽性活檢，C13對應于癌癥陰性活檢)的相對mRNA。圖2.傳統PCR實驗的結果。使用圖Ic所示的引物，對從35個前列腺癌樣品、6個良性樣品、6個前列腺癌細胞系(NCI-H660、VCaP、PC3、LNCaP、DU145、22_Rvl)以及1個良性細胞系(RWPE-I)中提取的總RNA進行RT-PCR分析。這一凝膠圖示出了，前列腺癌樣品 (PCa)以及 NCI-H660、VCaP, PC3、LNCaP 和 RWPE-I 細胞的代表性條帶。圖3a_3b.分隔SLC45A3和ELK4的染色體1區域的基因組學特征。3a. Chr. Iq32區域的示意圖，其示出了對13個擴增子中的每一個都具有特異性的引物對的位置。SLC45A3 外顯子5和ELK4外顯子1的位置也已經被標識出來。3b.從16個前列腺癌樣品(從左至右按照所述TAQMAN方法測定的SLC45A3-ELK4mRNA的函數進行排序)中獲得的13個擴增子中的每一個以及來源于LNCaP細胞中的擴增子的定量PCR分析結果。將前列腺癌樣品分成2組SLC45A3-ELK4 mRNA水平比良性樣品高10倍的組(“高”)；SLC45A3-ELK4 mRNA水平與良性樣品相似的組(“低”)。所有的Q-PCR實驗重復三次。條狀圖顯示平均的校準后的值，該校準后的值已經被校準到未被改變過的染色體Iq上的另一個區域。圖4a-4c.雄激素刺激LNCaP細胞，誘導SLC45A3-ELK4 (圖如)，誘導內源性的 ELK4(圖4b)mRNA和誘導KLK3 (PSA)mRNA(圖4c)。柱形圖表示在給定時間點時使用InM的 R1881分別在不存在10 μ M氟他胺(黑色的柱)或者存在10 μ M氟他胺(灰色的柱)的條件下處理LNCaP細胞所引起的平均誘導倍數。氟他胺處理的方法是細胞先使用10 μ m氟他胺預處理2小時，然后在給定時間點將培養液移除，并更換以含有InM R1881和10 μ M氟他胺的新鮮培養液。所有的實驗均重復三次(標準差以誤差線表示)。
發明的詳細說明有研究顯示，在前列腺癌組織和有患前列腺癌風險的男性尿液樣品中， SLC45A3-ELK4融合轉錄子尤其是SLC45A3-ELK4融合轉錄子呈現出高水平表達。已經鑒定出一些SLC45A3-ELK4融合轉錄子的變異體，且已證明它們受到雄激素調節。本申請公開了可用于診斷癌癥尤其是用于診斷前列腺癌的組合物和方法，這些組合物和方法的完成是基于對SLC45A3-ELK4融合分子進行檢測。此外，本申請還提供了藥物篩選方法和治療方法。SLC45A3-ELK4 融合分子本申請公開了可以在前列腺癌患者中檢測到的SLC45A3-ELK4轉錄子(即mRNAs) 的實施方式。這些融合轉錄子被認為是由區別于染色體重排的事件所引起的，所述染色體重排是指前列腺癌中存在的其它ETS融合事件。不受任何理論的束縛，這些SLC45A3-ELK4 融合轉錄子可能是反式剪接、基因組重排或者以上這兩種機制結合產生的一種結果。一旦被翻譯，則該融合轉錄子可以生成融合蛋白。本申請中，術語“SLC45A3-ELK4融合分子”可以是嵌合的核酸分子(基因組DNA、 cDNA和RNA)或者是嵌合的蛋白分子。舉例來講，SLC45A3-ELK4融合轉錄子或者mRNA分子至少由SLC45A3mRNA的5 ‘部分組成，該5'部分至少與ELK4 mRNA的3'部分連接。SLC45A3-ELK4融合轉錄子還可以包含一序列，該序列來自SLC45A3基因和ELK4基因之間的基因間區域(intergenic region)。 SEQ ID NOs :6-8表示SLC45A3 cDNA和兩個ELK4 cDNA (對應于兩個剪接變異體)序列。
構成融合轉錄子的SLC45A3 mRNA的5'部分可以包含SLC45A3 mRNA的5'非翻譯區域。mRNA的5'非翻譯區域起始于+1位(即轉錄起始位點)，且剛好終止于編碼區域起始密碼子之前。構成融合轉錄子的SLC45A3 mRNA的5'部分還可以包含SLC45A3 mRNA的一個或者多個外顯子的全長或者片段。SEQ ID N0:6示出了人SLC45A3 mRNA的五個外顯子。術語外顯子的一“部分”，是指外顯子的連續序列，其比外顯子的全長要短。一般來講，外顯子的一部分在長度上可以是至少5個、10個、15、20個、25個、30個、35個、40個核
苷酸或者更長。在一個實施例中，融合轉錄子包含至少SLC45A3的外顯子1，或者外顯子1的一部分。在另一個實施例中，融合轉錄子包含至少SLC45A3的外顯子1或者它的一部分，以及 SLC45A3的一個或者多個下游外顯子(即外顯子2、3、4和幻的全部或者部分。構成融合轉錄子的ELK4 mRNA的3 ‘部分可以包含轉錄自ELK4基因的3 ‘非翻譯區域。3'非翻譯區域是mRNA的片段，其位于編碼區域的后面且不會被翻譯。3'非翻譯區域通常在后面帶有多聚腺苷酸尾巴。構成融合轉錄子的ELK4 mRNA的3'部分還可以包含來自ELK4 mRNA 3'端的一個或者多個外顯子的全長或者片段，例如外顯子5、外顯子4、外顯子3a、外顯子北和外顯子 2，或者它們的片段。SEQ ID NOS :7-8表示人ELK4 cDNA的兩個剪接變異體的外顯子。在一個特定實施例中，SLC45A3-ELK4融合轉錄子由SLC45A3 mRNA的5'部分組成，該5'部分包含至少SLC45A3的外顯子1，該5'部分連接到ELK4 mRNA的3'部分，該 3'部分包含有外顯子2或者外顯子2的一部分，以及一個或者多個ELK4 mRNA的下游外顯子。這種融合轉錄子的一個實施例是以下實施例中提到的變異體1，其含有SEQ ID N0:1所示的接頭序列。在另一個實施例中，SLC45A3-ELK4融合轉錄子由SLC45A3 mRNA的5'部分組成， 該5'部分包含SLC45A3的外顯子1和外顯子2的一部分，所述5'部分融合到ELK4 mRNA 的3'部分，該3'部分包括ELK4 mRNA的外顯子2或者外顯子2的一部分以及下游外顯子。這種融合轉錄子的實施例是下面實施例中提到的變異體2和變異體3，兩者分別含有 SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的接頭序列。在另一個實施例中，SLC45A3-ELK4融合轉錄子由SLC45A3 mRNA的5'部分組成， 該5'部分包括SLC45A3的外顯子1、外顯子2的一部分，以及外顯子4的一部分，所述5' 部分融合到ELK4 mRNA的3 ‘部分，該3'部分包括ELK4 mRNA的外顯子2或者外顯子2的一部分以及下游外顯子。這種融合轉錄子的一個實施例是下面實施例中提到的變異體4，其含有SEQ ID NO 4所示的接頭序列。在另一個實施例中，SLC45A3-ELK4融合轉錄子由SLC45A3 mRNA的5'部分組成， 該5 ‘部分包括SLC45A3的外顯子3和外顯子4的至少一部分，所述5 ‘部分融合到ELK4 mRNA的3'部分，該3'部分包括ELK4 mRNA的外顯子2或者外顯子2的一部分以及下游外顯子。這種融合轉錄子的一個實施例是以下實施例中提到的變異體5，其含有SEQ ID NO 5所示的接頭序列。通過翻譯，融合轉錄子可以生成融合蛋白。由于融合轉錄子的形成可能會引起移碼，所以融合轉錄子中ELK4 mRNA部分所編碼的氨基酸可能會或者可能不會與ELK4 mRNA
7的3'部分原始編碼的氨基酸相一致。診斷基礎根據本發明，患者癌癥的診斷是基于檢測樣品中的SLC45A3-ELK4融合分子來實現的。已有研究證明，SLC45A3-ELK4融合轉錄子表達水平升高這一現象會特異性地出現在前列腺癌患者中，并且也認為會在其它癌癥中出現。因此，本發明所提供的方法可用于診斷癌癥，其包括但不限于，前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、胰腺癌和肺癌。術語受試的“患者”包括所有的哺乳動物患者，尤其是人類患者。術語“診斷”是指，確定患者是否患有或者可能患有癌癥。基于檢測SLC45A3-ELK4 融合分子的診斷方法可以和其它的診斷方法組合使用，從而減少假陽性或者假陰性結果。適合用于檢測的樣品來源包括任何生物樣品，只要其含有本申請中所描述的可用于檢測的融合分子。樣品來源的實例包括，組織、尿液、血液、精液、前列腺分泌物或者前列腺細胞。在一個特定實施例中，直腸指檢(DRE)后，迅速收集尿液樣品，直腸指檢通常會導致前列腺細胞從前列腺散落到尿道中。可以對以上來源的樣品進行進一步的處理，從而富集融合分子或者含有融合分子的細胞。處理方法可以包括，從血液中獲取血清或者血漿成分、從尿液中獲取上清液或者細胞顆粒成分、組織均漿處理、細胞裂解處理等等，從而提供適于對融合分子進行分析的材料。癌癥的診斷可以通過檢測是否存在高水平融合分子的方式來完成。可替換地或者另外地，診斷還可以通過檢測是否存在高水平的特定融合分子的方式來完成，這可以根據該特定融合分子的組成或者特征來確定。本申請中，“高水平”是指與對照水平相比明顯增加的水平，對照水平是指在正常組織中檢測到的融合分子的水平(例如正常或者良性組織，和/或正常非前列腺組織)。明顯增加是指增加至少50%,75%U00% (正常水平的兩倍)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、 8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍或者更多。 舉例來講，SLC45A3-ELK4融合轉錄子可以通過RT-PCR方法進行檢測，RT-PCR使用的引物包含第一引物和第二引物，其中，第一引物對應于或者特異于SLC45A3 mRNA的5' 部分的序列(例如外顯子1)，第二引物特異于或者對應于ELK4 mRNA的3'部分的序列(例如外顯子2或者任意其它的下游外顯子)。陽性信號表示存在一個或者多個SLC45A3-ELK4 融合轉錄子變異體，或者存在不同變異體的組合。水平(信號)的定量以及將其與正常組織水平進行對比的結果可以為診斷提供基礎依據。 當提到寡聚核苷酸引物或者探針“對應于”或者“特異于”某一序列時，其是指，這些引物或者探針與該序列具有足夠的同一性，從而使引物或者探針在嚴格條件下可以與該序列或者該序列的互補鏈進行雜交。所謂嚴格條件是從溫度、離子強度以及是否存在其它化合物(例如有機溶劑)這幾個方面來定義。舉例來講，“高度嚴格條件”可以包括42°C 下，在由 5x SSPE (43. 8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O 和 1. 85g/l EDTA，用 NaOH 將 pH 調至 7. 4)、0. 5%SDS,5x Denhardt試劑和100 μ g/ml變性的鮭精DNA所組成的溶液中進行雜交 然后用含有0. Ix SSPE和1. 0% SDS的溶液在42°C或者更高的溫度下沖洗。“中等嚴格條件，，包括42°C下，在切 SSPE、Na0H、0. 5% SDSjx Denhardt 試劑和 100 μ g/ml 變性的鮭精 DNA組成的溶液中進行雜交；隨后用含有1. Ox SSPE和1. 0% SDS的溶液在42°C下進行沖洗。
適合用在檢測中的寡聚核苷酸引物或者探針除了包含序列結合區域，還可以包含其它組件，例如包含這樣一種序列，該序列不會結合接頭序列(例如是標記序列或者啟動子序列)，也不會在接頭處干擾接頭序列與靶標序列的結合。相似地，引物或者探針可以包含非核酸部分，例如不會對靶標結合產生干擾的標記。除此之外或者說是作為檢測(也就是任何類型的)融合分子的一種替代方式，也可以根據特定融合分子的組分或者特征的不同來檢測特定的融合分子。例如，可以通過使用對應于SLC45A3 mRNA的5'部分的第一引物和對應于ELK4 mRNA的3'部分的第二引物進行RT-PCR分析，然后在瓊脂糖上對獲得的RT-PCR產物進行評價從而確定RT-PCR產物的尺寸。本申請所舉例的包括SLC45A3的外顯子1和ELK4的外顯子2的變異體1，其接頭處長度為325bp(SEQ ID NO :1)，而圖Ic和SEQ ID NOS :2_5所示的變異體2_5的接頭處的長度分別為615bp、379bp、371bp和774bp。也可以對RT-PCR的產物進行測序，以評價融合轉錄子的同一性。可替換地，還可以在雜交或者擴增類的分析例如RT-PCR、FISH中使用那些根據特定變體的接頭序列而專門設計的引物或者探針，從而對特定的融合轉錄子變異體的存在與否及其水平進行評價。為了舉例之目的，SEQ ID NOS 1_5示出了 5個融合轉錄子變異體的接頭序列，其中接頭點以星號示出，SLC45A3和ELK4之間的共有核苷酸以下劃線示出。
變異體1 :SLC45. A3 (外顯子1) -ELK4 (外顯子2)
AACCTGGAGATTTAAAAGCCGCCGGCTGGCGCGCGTGGGGGGCAAGGAA
GGGGGGGCGGAACCAGCCTGCACGCGCTGGCTCCGGGTGACAGCCGCGC
GCCTCGGCCA*G*CTCATTGCTATGGACAGTGCTATCACCCTGTGGCAGTT
CCTTCTTCAGCTCCTGCAGAAGCCTCAGAACAAGCACATGATCTGTTGGA
CCTCTAATGATGGGCAGTTTAAGCTTTTGCAGGCAGAAGAGGTGGCTCGT
CTCTGGGGGATTCGCAAGAACAAGCCTAACATGAATTATGACAAACTCAG
CCGAGCCCTCAGATACTATTATGTAAAG(SEQ ID NO :1)
變異體2 :SLC45A3 (外顯子1) -SLC45A3 (外顯子2的起點)-ELK4 (外顯子2)
AACCTGGAGATTTAAAAGCCGCCGGCTGGCGCGCGTGGGGGGCAAGGAA
GGGGGGGCGGAACCAGCCTGCACGCGCTGGCTCCGGGTGACAGCCGCGC
GCCTCGGCCAGGATCTGAGTGATGAGACGTGTCCCCACTGAGGTGCCCCA
CAGCAGCAGGTGTTGAGCATGGGCTGAGAAGCTGGACCGGCACCAAAGG
GCTGGCAGAAATGGGCGCCTGGCTGATTCCTAGGCAGTTGGCGGCAGCAA
GGAGGAGAGGCCGCAGCTTCTGGAGCAGAGCCGAGACGAAGCAGTTCTG
GAGTGCCTGAACGGCCCCCTGAGCCCTACCCGCCTGGCCCACTATGGTCC
AGAGGCTGTGGGTGAGCCGCCTGCTGCGGCACCGGAAAGCCCAGCTCTTG
CTGGTCAACCTGCTAACCTTTGGCCTGGAGGTGTGTTTGGCCGCAGGCATC
ACCTATGTGCCGCCTCTGCTGCTGGAAGTGGGGGTAGAGGAGAAGTTCAT
GACCATGGTGCTG*GCTCATTG*CTATGGACAGTGCTATCACCCTGTGGCA
GTTCCTTCTTCAGCTCCTGCAGAAGCCTCAGAACAAGCACATGATCTGTTG
GACCTCTAATGATGGGCA(SEQ ID NO 2)
變異體3 :SLC45A3(外顯子1)-SLC45A3 (外顯子2的起點)-SLC45A3 (外顯子2的終
9點)-ELK4(外顯子2)
AACCTGGAGATTTAAAAGCCGCCGGCTGGCGCGCGTGGGGGGCAAGGAA
GGGGGGGCGGAACCAGCCTGCACGCGCTGGCTCCGGGTGACAGCCGCGC
GCCTCGGCCAGGATCTGAGTGATGAGACGTGTCCCCACTGAGGTGCCCCA
CAGCAGCTCTTGCTGGTCAACCTGCTAACCTTTGGCCTGGAGGTGTGTTTG
GCCGCAGGCATCACCTATGTGCCGCCTCTGCTGCTGGAAGTGGGGGTAGA
GGAGAAGTTCATGACCATGGTGCTG*GCTCATTG*CTATGGACAGTGCTAT
CACCCTGTGGCAGTTCCTTCTTCAGCTCCTGCAGAAGCCTCAGAACAAGC
ACATGATCTGTTGGACCTCTAATGATGGGCA(SEQ ID NO :3)
變異體4 :SLC45A3(外顯子1)-SLC45A3 (外顯子2的起點)-SLC45A3 (外顯子4的終點)-SLC45A3和ELK4-ELK4(外顯子2)之間的基因間序列 AACCTGGAGATTTAAAAGCCGCCGGCTGGCGCGCGTGGGGGGCAAGGAA GGGGGGGCGGAACCAGCCTGCACGCGCTGGCTCCGGGTGACAGCCGCGC GCCTCGGCCAGGATCTGAGTGATGAGACGTGTCCCCACTGAGGTGCCCCT ACAC*ACTGGCCTCCCTCTACCACCGGGAGAAGCAG*TGGAGGACTTTTG ACCCGTCTCCTCACCTTCTGATACACACCAACCAACCAGTCAACCAGCCA TTGCTGTTTACTGGATACCT*GCTCATTGCTATGGACAGTGCTATCACCCT GTGGCAGTTCCTTCTTCAGCTCCTGCAGAAGCCTCAGAACAAGCACATGA TCTGTTGGACCTCTAATGATGGGCA(SEQ ID NO :4)
變異體5 :SLC45A3 (外顯子3的終點-)-SLC45A3 (外顯子4) -SLC45A3和ELK4-ELK4 (外顯子2)之間的來源于5' RACE的基因間序列
TGGGCCCCACCGAGCCAGCAGAAGGGCTGTCGGCCCCCTCCTTGTCGCCC CACTGCTGTCCATGCCGGGCCCGCTTGGCTTTCCGGAACCTGGGCGCCCTG CTTCCCCGGCTGCACCAGCTGTGCTGCCGCATGCCCCGCACCCTGCGCCG GCTCTTCGTGGCTGAGCTGTGCAGCTGGATGGCACTCATGACCTTCACGCT GTTTTACACGGATTTCGTGGGCGAGGGGCTGTACCAGGGCGTGCCCAGAG CTGAGCCGGGCACCGAGGCCCGGAGACACTATGATGAAGGCGTTCGGAT GGGCAGCCTGGGGCTGTTCCTGCAGTGCGCCATCTCCCTGGTCTTCTCTCT GGTCATGGACCGGCTGGTGCAGCGATTCGGCACTCGAGCAGTCTATTTGG CCAGTGTGGCAGCTTTCCCTGTGGCTGCCGGTGCCACATGCCTGTCCCACA GTGTGGCCGTGGTGACAGCTTCAGCCGCCCTCACCGGGTTCACCTTCTCAG CCCTGCAGATCCTGCCCTACACACTGGCCTCCCTCTACCACCGGGAGAAG CAG*TGGAGGACTTTTGACCCGTCTCCTCACCTTCTGATACACACCAACCA ACCAGTCAACCAGCCATTGCTGTTTACTGGATACCT*GCTCATTGCTATGG ACAGTGCTATCACCCTGTGGCAGTTCCTTCTTCAGCTCCTGCAGAAGCCTC AGAACAAGCACATGATCTGTTGGACCTCTAATGATGGGCAGTTTAAGCTT TTGCAGGCAGAAGAGGTGG(SEQ ID NO :5)
融合轉錄子可以包含數個接頭，這些接頭一般不會在天然的SLC45A3或者ELK4 mRNAs中檢測到。參見例如變異體4和變異體5。為了對特定融合轉錄子進行檢測，可以根據接頭位點周圍的序列來設計引物或者探針。這些引物在本申請中也可以稱為“接頭-特異的”引物。一般來講，接頭處-特異的寡聚核苷酸引物或者探針在長度上至少應該是14或者 15個核苷酸，或者16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或者更多個核苷酸。接頭處-特異的寡聚核苷酸引物或者探針被設計成與接頭處具有足夠的同一性，從而使引物或者探針在嚴格條件下能夠特異性的與接頭進行雜交。在一些特定實施例中，接頭-特異的引物或者探針從接頭一側算起其包含至少3個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或者12個核苷酸。如果融合接頭含有一個或者多個為兩個連接的核苷酸所共有，則接頭-特異的引物應該包括此等共有的所述一個或多個核苷酸，并且還應該包括從共有的核苷酸一側算起的至少3個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或者12個核苷酸。在其它實施例中，尤其是對于基于擴增反應的檢測，接頭-特異的引物被設計成可以靶向更多的融合的5'伴侶而只能靶向較少的融合的3'伴侶，從而使得引物與天然的非融合SLA45A3或者ELK4 mRNA 之間的雜交最小化。換句話說，引物具有較大的5'部分，其可以與接頭序列的一側發生雜交而非與引物的3'部分雜交，該引物的3'部分其可以與接頭的另一側發生雜交。舉例來講，長度為18個核苷酸的接頭-特異的引物可以包含長為12-14個核苷酸且與接頭序列的一側相對應的5'部分，以及長為4-6個核苷酸且與接頭序列的另一側相對應的3'部分。在一些特定實施例中，接頭-特異的引物根據一接頭來進行設計，在該接頭處 SLC45A3部分和ELK4部分進行了融合。在一個實施例中，接頭-特異的引物根據變異體1 (SEQ ID NO 1)的接頭序列來進行設計。在一個特定實施例中，引物包含至少14到18個核苷酸，并包含SLC45A3外顯子1 中正好位于變異體1接頭點“G”核苷酸前方的至少4個或者5個核苷酸，以及ELK4外顯子 2中正好位于接頭點“G”核苷酸后方的至少4個或者5個核苷酸。在一些實施例中，接頭-特異的引物根據變異體2_3(SEQ ID NO :2_3)的接頭序列來設計。在一個特定實施例中，引物包含至少14到18個核苷酸，以及包含SLC45A3外顯子 2中正好位于變異體2或者3接頭點上的“GCTCATTG”共有片段的前方的至少3個或者4個核苷酸，以及ELK4外顯子2中緊跟在接頭點上共有片段后面的至少3或者4個核苷酸。類似地，可以將那些根據鑒定得到的變異體的接頭氨基酸序列專門設計的多肽用于制備抗體，這些抗體可以用于檢測特定的融合蛋白變異體是否存在以及存在的水平。如上所述，為了得到更加準確的診斷結果，基于檢測SLC45A3-ELK4融合分子的診斷方法可以同其它的診斷方法組合使用。其它診斷方法包括，例如測定其它與癌癥相關的融合分子，含有與前列腺癌相關的基因融合分子，例如雄激素調節的跨膜蛋白酶-絲氨酸 2(TMPRSS2)基因與轉錄因子ETS家族中的基因(例如ERG)之間形成的基因融合分子，這些融合分子已經記載在已公開的第2007/0212702號美國申請中，以及SLC45A3基因和ERG 基因之間形成的融合分子。在以下實施例的實驗中，沒有檢測到TMPRSS2-ERG基因融合和 SLC45A3-ELK4融合轉錄子之間存在相互排斥表達的情況。此外，還觀察到數個具有較高 SLC45A3-ELK4轉錄水平的樣品的ERG重排呈現陰性。相應地，對SLC45A3-ELK4融合分子進行檢測這可以為那些基于檢測包含ERG在內的融合分子(包括，TMPRSS2-ERG基因融合) 的診斷方法提供有利的補充。融合分子檢測的技術和方法
融合核苷酸分子可以通過各種已知的核酸類技術來進行檢測，包括雜交技術(例如液相雜交、原位雜交(ISH)比如熒光ISH(FISH)、生物芯片(microarry)、Northern雜交和 Southern雜交)；擴增反應(例如聚合酶鏈式反應(PCR)，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、 轉錄介導的擴增方法(TMA)、連接酶鏈式反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)和核酸序列依賴性擴增(NASBA))以及測序。融合蛋白的檢測可以通過檢測各種已知的可以用來檢測蛋白的分析物來實現，包括例如，免疫分析(例如免疫沉淀、Western雜交、ELISA、免疫組化、免疫細胞化學和流式細胞技術)。組合物和試劑念本發明還提供了可用在上述診斷方法中的組合物和試劑盒，包括，例如適合用于擴增反應的引物或者引物對、適合用于雜交的探針，其包括接頭-特異的引物和探針，以及抗體。引物對可以包括接頭-特異的引物和非接頭-特異的引物。引物和探針可以使用能夠產生可檢測信號或者能夠固定在固相載體上的試劑或者化合物進行標記。其它用涂在另一個實施例中，本發明還提供了一種篩選抗癌化合物的方法。具體地說，該方法是通過檢測候選化合物在癌細胞中降低SLC45A3-ELK4融合分子表達水平或者抑制 SLC45A3-ELK4融合分子生物功能的能力來篩選出合適的化合物。這一方法可以通過在體外使用具有高水平SLC45A3-ELK4融合分子的癌細胞系來實現。候選化合物例如可以包括，核酸分子、小的有機分子和抗體。鑒定出來的化合物可以降低融合分子的mRNA水平或者蛋白水平。在另一個實施例中，本發明提供了一種治療以高水平的SLC45A3-ELK4融合分子為特征的癌癥的方法。高水平的SLC45A3-ELK4融合分子可以在特殊的組織或者器官，和/ 或者血液或者尿液樣品中檢測到。治療方法包括給予癌癥患者某一試劑，該試劑能夠抑制融合分子的生物功能，或者降低融合分子的水平。該試劑可以是小分子、siRNA、反義核苷酸或者抗體中的任意一種，亦或者是它們的組合。siRNAs是指小干擾RNAs，其可以包括長約 18-30或者20-25個核苷酸的雙鏈區域。雙鏈區域中的一條鏈與靶標RNA分子相同或者基本同源。雙鏈區域可以由兩條獨立的RNA鏈形成或者由一個單獨的RNA分子形成(即發夾結構)。在一個實施例中，抗癌試劑包含siRNA，其被設計成靶向SLC45A3-ELK4融合轉錄子中的接頭區域。以下實施例可以參考作為本申請內容一部分的附圖，這些附圖通過圖示的方式對可能實施的特定實施方式進行了說明。對這些實施方式進行詳細描述的目的是為了使本領域技術人員能夠實施本發明，應該理解的是，在不脫離本發明精神的前體下還可以使用其它實施方式來實施本發明。因此，以下對實施方式的描述不應對本發明構成任何限制，本發明的范圍由所附的權利要求書確定。
實施例在以下實施例中，所有的細胞系均購自American Type Culture Collection(ATCC ,Manassas, VA) 0根據供應商的使用手冊培養細胞。按照以下方式進行組織樣品處理和RNA提取使用蘇術精和伊紅(H&E)玻片對癌癥范圍和腫瘤等級(Gleason評分)進行評估。從相應的冷凍組織塊切取1. 5mm的皮區，對含有高密度癌癥病灶(< 10% 間質的或者其它的非腫瘤組織的污染物)的區域進行評分。根據制造商提供的操作方法，利用 TRIzol 試劑(Invitrogen，Invitrogen, Carlsbad, CA)分離 RNA。然后對 RNA 進行DNase核酶處理Qnvitrogen)并使用NanoDrop8000分光光度計進行定量(Thermo Scientific, Wilmington, DE)。最后，使用生物芯片分析系統 2100 (Agilent Technologies Inc.，Santa Clara, CA))對RNA的特性進行檢測。
實施例1 前列腺癌、良性前列腺組織和LNCaP細胞系中SLC45A3-ELK4 mRNA的表達。使用TAQMAN方法對SLC45A3-ELK4轉錄子的表達進行篩選。這一方法靶向SLC45A3 的外顯子1和ELK4外顯子2，這是基于SLC45A3和ETVl和ETV5之間的融合接頭(圖la)來實現的，需要注意的是這兩個已知的野生型ELK4 mRNA變異體(NM_001973和NM_021795)在 3'區域處的區別。首先，從以下材料中篩選得到RNA:31個前列腺癌組織樣品、6個良性前列腺組織樣品和11個細胞系。其中該11個細胞系包括，惡性前列腺細胞系(LNCaP、PC-3、 22Rvl、VCaP、NCI-H660、DU-145)、非前列腺細胞系(人上皮樣腎腺癌細胞系ACHN、Caki-I、 A-498、HK-2)，以及非惡性前列腺上皮細胞系(RWPE-I)。盡管SLC45A3-ELK4 mRNA轉錄子的表達非常低(圖lb)，但幾乎所有的樣品都是可以檢測到的。三個前列腺癌樣品表現出 SCL45A3-ELK4的高表達，其表達水平要比良性前列腺組織計算得到的平均水平高10倍。剩下的前列腺癌樣品表現出與良性組織樣品相似的低水平的SLC45A3-ELK4 mRNA水平。在被檢測的所有前列腺樣品中，內源性的ELK4 mRNA水平變化較大。內源性的ELK4 mRNA水平和 SLC45A3-ELK4 mRNA水平之間有很好的總相關性(r = 0. 86)，有些樣品中這兩個轉錄子的表達值具有明顯差異(例如，樣品423_(、20_1\522_0、91_1\1702_(、1765_4、似8_4和1701_ A)。在PC-3和LNCaP細胞以及人上皮樣腎腺癌細胞系ACHN中，發現SLC45A3-ELK4水平相對增加。
實施例2 前列腺癌中SLC45A3-ELK4 mRNA變異體的檢測。為了表征SLC45A3-ELK4轉錄子的組成，使用對應于SLC45A3外顯子1和ELK4外顯子2的引物，進行常規的RT-PCR實驗，然后對擴增產物進行cDNA測序，其中擴增產物來自以下樣品35個前列腺癌樣品、6個良性樣品、6個前列腺癌細胞系(NCI-H660、VCaP、PC3、 LNCaP, DU145、22-RV1)和1個良性細胞系(RWPE-I)。參見圖2。鑒于這一方法敏感度較低，所以只有多數樣品得到一主產物，該主產物由SLC45A3外顯子1以及與其融合在一起的ELK4外顯子2組成(圖lc，見下面所示的變異體1的接頭序列)。檢測到三個罕見的產物，其由SLC45A3的不同外顯子以及與其融合在一起的ELK4外顯子2組成。發現了一種意料之外的擴增產物(變異體4)，其由SLC45A3外顯子1、2和4的全部或者部分組成，且所述的這些外顯子的全部或者部分與來自染色體1區域的84個堿基對發生融合，并在其后面還跟著ELK4外顯子2，其中所述染色體1區域將SLC45A3和ELK4分隔開來。為了使用無偏方法驗證SLC45A3-ELK4mRNA的表達，對樣品1701_A進行5 ‘ RNA連接酶介導的cDNA 末端快速擴增(RACE)。還鑒定得到了另一種SLC45A3-ELK4 mRNA變異體(變異體5)，該變異體由SLC45A3外顯子1-3組成，這些外顯子融合到與前述相同的84個堿基對序列上， 并在其后面跟著ELK4外顯子2。與前列腺癌中表現出的其它融合不同，這些數據所代表的 SLC45A3-ELK4融合是異質的，其中有些融合可以在其融合轉錄子內含有基因間染色體序列。
常規RT-PCR。在以下條件下對SLC45A3-ELK4轉錄子講行定件檢測使用Platinum Taq DNA聚合酶試劑盒(Invitrogen)并以50ng cDNA作為模板，反應體積為25 μ 1。PCR反應使用的引物是SLC45A外顯子1中的正向引物(5 ‘ -CCGCGGAGTAACCTGGAGATTT-3 ‘，SEQ ID NO 37)和 ELK4 外顯子 2 中的反向引物(5' -TGCCCATCATTAGAGGTCCAACAG-3 ‘，SEQ ID NO 38)；鏈式反應的循環條件是94°C下預變性2分鐘，94°C下30秒，56°C下30秒，68°C下 1分鐘，共計40個循環，最后在68°C下進行10分鐘終延伸。使用2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物。cDNA泖丨序。使用MinElute 凝膠分離試劑盒Oliagen)分離與預期的融合轉錄子尺寸相對應的DNA片段，然后在康奈爾大學生命科學中心實驗室(伊薩卡，紐約州)的DNA 測序設施中對該DNA片段進行測序。
實施例3 利用非停入的方法對SLC45A3-ELK4 mRNA進行檢測。利用SLC45A3-ELK4 TAQMAN方法，對14個經過預活檢和直腸指檢后的尿液樣品進行檢測，該尿液樣品來自具有患前列腺癌高風險的男性。根據活檢的前列腺組織的病理學報告，14個待測樣品中的8個被診斷為前列腺癌(圖Id)。對8個相應尿液樣品中的6個和6個樣品中的2個中的SLC45A3-ELK4轉錄子的水平進行檢測，檢測結果表明靈敏度為 75%，特異性為67%，其中，所述6個樣品來自預活檢未顯示有前列腺癌的男性。有趣的是， 如同在前列腺組織中所看到的，只有在幾個前列腺癌相關的樣品中檢測到高水平表達(> 10倍)。下表1是所有14個被分析樣品中具有足夠高TCFLl值的樣品的例聯表。根據該表，通過檢測尿液中SLC45A3-ELK4水平來作為前列腺癌生物標志物方法的敏感度為75%， 特異性為67%，是否為前列腺癌根據活檢材料的結果來確定。
表權利要求
1.一種檢測生物樣品中與前列腺癌有關的融合分子的方法，其包括提供含有核酸的生物樣品，并檢測融合轉錄子的水平，所述融合轉錄子代表SLC45A3 mRNA的5'部分和ELK4 mRNA的3'部分之間的融合，其中，當所述融合轉錄子的水平高于對照水平時，表示生物樣品中存在前列腺癌細胞或者來自前列腺癌細胞的核酸。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述樣品選自由前列腺組織、血液、尿液、精液、 前列腺分泌物和前列腺細胞組成的組。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述樣品來自經過直腸指檢的患者的尿液。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述SLC45A3mRNA的5'部分包含SLC45A3 mRNA 的外顯子1的至少一部分。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述SLC45A3mRNA的5'部分包含SLC45A3 mRNA 的外顯子1和至少一部分外顯子2。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，所述SLC45A3mRNA的5'部分包含，SLC45A3 mRNA的外顯子1和至少一部分外顯子2，還包含至少一種以下組件SLC45A3 mRNA的外顯子3或者外顯子4或者它們的一部分。
7.根據權利要求1所述的方法，其中，所述ELK4mRNA的3'部分包含所述ELK4 mRNA 的外顯子2的至少一部分。
8.根據權利要求1所述的方法，其中，所述ELK4mRNA的3'部分包含所述ELK4 mRNA 的外顯子2和外顯子北。
9.根據權利要求1所述的方法，其中，所述ELK4mRNA的3'部分包含所述ELK4 mRNA 的外顯子2、外顯子3a、外顯子4和外顯子5。
10.根據權利要求1所述的方法，其中，融合轉錄子的檢測通過使用以下方法實現核酸擴增的方法、核酸雜交的方法，或者核酸擴增和核酸雜交結合的方法。
11.根據權利要求10所述的方法，其中，融合轉錄子的檢測通過使用核酸擴增方法實現，該方法選自聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、轉錄介導的擴增方法(TMA)、連接酶鏈式反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)和核酸序列依賴性擴增(NASBA)。
12.根據權利要求11所述的方法，其中，核酸擴增方法通過使用第一引物和第二引物來完成，其中，所述第一引物特異于SLC45A3 mRNA外顯子1的一部分或者特異于SLC45A3 mRNA外顯子1所述部分的完全互補序列，所述第二引物特異于ELK4 mRNA外顯子2的一部分或者特異于ELK4 mRNA外顯子2的所述部分的完全互補序列。
13.根據權利要求11所述的方法，其中，所述核酸擴增方法通過使用這樣的引物來完成，該引物包含至少一種特異于SLC45A3-ELK4融合轉錄子中SLC45A3序列和ELK4序列之間的接頭的引物。
14.根據權利要求13所述的方法，其中，所述引物特異于任意一種如SEQID NOS 1-5 所示的變異體的SLC45A3序列和ELK4序列之間的接頭。
15.根據權利要求10所述的方法，其中，所述雜交方法選自原位雜交、微點隈雜交、液相雜交和Northern雜交組成的組。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，所述雜交方法通過使用寡聚核苷酸探針來完成，該寡聚核苷酸探針特異于SLC45A3-ELK4融合轉錄子中SLC45A3序列和ELK4序列之間的接頭。
17.根據權利要求16所述的方法，其中，所述探針特異于任意一種SEQID N0S:1_5所示的變異體所含有的SLC45A3序列和ELK4序列之間的接頭。
18.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括檢測TMPRSS22和ERG基因組序列之間的基因融合。
19.根據權利要求1所述的方法，其中，所述檢測步驟使用表2中公開的寡聚核苷酸的任意組合，所述寡聚核苷酸選自SEQ ID NOS 9-36組成的組。
20.一種用于檢測與前列腺癌相關的融合分子的組合物，其包含至少一種以下組份(a)寡聚核苷酸，其含有可以與接頭雜交的序列，在該接頭處SLC45A3mRNA的5'部分和ELK4 mRNA的3'部分發生融合；(b)可以與SLC45A3mRNA的5'部分進行雜交的第一寡聚核苷酸，以及可以與ELK4 mRNA的3'部分進行雜交的第二寡聚核苷酸；(c)特異于一表位的抗體，該表位對應于SLC45A3-ELK4融合轉錄子編碼的嵌合蛋白接頭處上的氨基酸序列；或者(d)抗體，其特異于SLC45A3-ELK4融合轉錄子所編碼的嵌合蛋白。
21.根據權利要求20所述的組合物，其中，組(a)的寡聚核苷酸可以與變異體1(SEQ ID NO :1)、變異體 2 (SEQ ID NO 2)、變異體 3 (SEQ ID NO 3)、變異體 4 (SEQ ID NO 4)或者變異體5(SEQ ID NO 5)的接頭發生特異性雜交；或者可以與SEQ ID Nos. 1-5中的任意一條序列的完全互補序列中存在的與接頭序列完全互補的序列特異性雜交。
22.根據權利要求20所述的組合物，其中，組(b)中的第一和第二寡聚核苷酸選自表2 公開的寡聚核苷酸的組合，所述寡聚核苷酸選自SEQ ID NOS :9-36組成的組。
23.一種治療患者前列腺癌的方法，其包括給予患者一試劑，該試劑能夠抑制融合轉錄子的生物功能或者降低融合轉錄子的水平，所述融合轉錄子中SLC45A3 mRNA的5'部分與 ELK4 mRNA的3'部分相融合。
24.一種鑒定可用于治療患者前列腺癌的試劑的方法，其包括提供具有高水平的融合轉錄子的細胞，該融合轉錄子中SLC45A3 mRNA的5'部分與ELK4 mRNA的3'部分相融合；將所述細胞暴露給候選試劑；從而鑒定出那些能夠抑制融合轉錄子的生物功能或者降低融合轉錄子水平的試劑。
全文摘要
本申請涉及與前列腺癌相關的RNA轉錄子，該轉錄子是人SLC45A3核酸和人ELK4核酸的融合體。本申請還提供了可以用來檢測與癌癥相關的人SLC45A3和ELK4遺傳序列形成的融合轉錄子的組合物和方法，以及用于治療癌癥的組合物和方法。
文檔編號C12N15/62GK102439174SQ201080017474
公開日2012年5月2日 申請日期2010年2月19日 優先權日2009年2月19日
發明者D·S·瑞克曼, M·A·魯賓, 多羅泰·菲戈 申請人:康奈爾大學