專利名稱：利用萃取發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物燃料領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其中，丁醇產(chǎn)品通過在發(fā)酵期間萃取至一種不能與水混溶的萃取劑組合物而被除去， 其中所述萃取組合物包含第一溶劑和第二溶劑。
背景技術(shù)：
丁醇是一種重要的工業(yè)化學(xué)品，其具有多種用途，例如用作燃料添加劑，在塑料工業(yè)中用作化學(xué)原料，以及在食品和食用香料工業(yè)中用作食品級(jí)的萃取劑。每年，通過石油化工手段生產(chǎn)100至120億磅的丁醇，并且對(duì)該日用化學(xué)品的需求可能還會(huì)增加。有若干種化學(xué)合成方法是已知的。然而，這些生產(chǎn)丁醇的方法利用來源于石油化工產(chǎn)品的原料，并且普遍成本高昂和有害生態(tài)環(huán)境。若干種通過發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法同樣是已知的，例如ABE方法，這種發(fā)酵方法產(chǎn)生一種丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物。通過丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)進(jìn)行的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發(fā)酵是已知最古老的工業(yè)發(fā)酵之一；負(fù)責(zé)產(chǎn)生這些溶劑的途徑和基因也同樣如此。通過ABE方法進(jìn)行的ι- 丁醇生產(chǎn)受1- 丁醇對(duì)丙酮丁醇梭菌的毒性效應(yīng)限制。已有報(bào)導(dǎo)稱，利用對(duì)細(xì)菌無毒的特定萃取劑的原位萃取發(fā)酵方法提高了用丙酮丁醇梭菌發(fā)酵進(jìn)行的1-丁醇生產(chǎn)(例如參見 Roffler 等人，Biotechnol. Bioeng. 31 135-143，1988 ；Roffler 等人，Bioprocess Engineering 2:1-12,1987,禾口 Evans 等人，Appl. Environ. Microbiol. 54 1662-1667, 1988)。與上述野生型的丙酮丁醇梭菌不同，重組的表達(dá)宿主菌還被報(bào)導(dǎo)表達(dá)1- 丁醇、 2- 丁醇和異丁醇的生物合成途徑。這些重組的宿主具有以比ABE方法更高的產(chǎn)量生產(chǎn)丁醇的潛能，因?yàn)樗鼈儾划a(chǎn)生諸如丙酮和乙醇這樣的副產(chǎn)品。使用這些重組的宿主時(shí)，丁醇的生物生產(chǎn)似乎受限于丁醇對(duì)發(fā)酵中所用宿主微生物的毒性閾值。美國(guó)專利公布20090305370 公開了從至少一種可發(fā)酵的碳源生產(chǎn)丁醇的方法，通過利用一種重組的微生物宿主進(jìn)行發(fā)酵，其中在發(fā)酵過程中丁醇被萃取至特定的有機(jī)萃取劑中，所述方法克服了毒性問題，導(dǎo)致丁醇生產(chǎn)的有效滴度、有效速率和有效產(chǎn)量的提升。用于從發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)和回收丁醇的改進(jìn)的方法在不斷地被尋求。同樣期望找到低成本的方法和對(duì)工藝可操作性的改進(jìn)。不斷地需要鑒定用于發(fā)酵培養(yǎng)基的改良的萃取劑，例如表現(xiàn)出更高的分配系數(shù)、更低的粘度、更低的密度、商業(yè)上有用的沸點(diǎn)、和充分的微生物生物相容性的萃取劑。發(fā)明概述本文提供的是從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收丁醇的方法，所述方法包括
a)提供發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含丁醇、水、至少一種可發(fā)酵的碳源、和從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與包含第一溶劑和第二溶劑的不能與水混溶的萃取劑組合物接觸，其中所述第一溶劑選自C12-C22脂肪醇、C12至C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22 脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺以及它們的混合物，所述第二溶劑選自C7-C11醇、C7-C11羧酸、C7-C11 羧酸的酯、C7-C11醛以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；c)將所述含丁醇的有機(jī)相與所述水相分離；以及d)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇以制得回收的丁醇。還提供了用于生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括a)提供從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)在包含水相和不能與水混溶的萃取劑組合物的雙相發(fā)酵培養(yǎng)基中，使所述微生物生長(zhǎng)足以令丁醇被萃取至所述萃取劑組合物中的時(shí)間從而形成含丁醇的有機(jī)相，其中所述萃取劑組合物包含第一溶劑和第二溶劑，所述第一溶劑選自C12-C22脂肪醇、C12至C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，所述第二溶劑選自C7-C11醇、 C7-C11羧酸、C7-C11羧酸的酯、C7-C11醛、C12-C22脂肪酰胺以及它們的混合物，其中所述雙相發(fā)酵培養(yǎng)基包含按體積計(jì)從約10%至約90%的所述不能與水混溶的萃取劑組合物；C)將所述含丁醇的有機(jī)相與所述水相分離；以及d)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇以制得回收的丁醇。還提供了用于生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括a)提供從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)使上述微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中上述微生物將丁醇產(chǎn)生到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中以制得含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基；c)使所述含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基的至少一部分與包含第一溶劑和第二溶劑的不能與水混溶的萃取劑組合物接觸，其中所述第一溶劑選自C12-C22脂肪醇、C12至C22脂肪酸、 C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺以及它們的混合物，所述第二溶劑選自 C7-C11醇、C7-C11羧酸、C7-C11羧酸的酯、C7-C11醛以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；d)將所述含丁醇的有機(jī)相與所述水相分離；e)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇；以及f)使所述水相的至少一部分返回至所述發(fā)酵培養(yǎng)基。在實(shí)施方案中，所述丁醇為1-丁醇。在實(shí)施方案中，所述丁醇為2-丁醇。在實(shí)施方案中，所述丁醇為異丁醇。在實(shí)施方案中，所述第一溶劑選自油醇，二十二醇，鯨蠟醇，月桂醇，肉豆蔻醇，硬脂醇，油酸，月桂酸，肉豆蔻酸，硬脂酸，肉豆蔻酸甲酯，油酸甲酯，月桂酸，1-十二烷醇，以及它們的組合。在實(shí)施方案中，所述第一溶劑包含油醇。在實(shí)施方案中，所述第二溶劑選自1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、2-十一烷醇、 1-壬醛，和它們的組合。在實(shí)施方案中，所述第二溶劑選自1-壬醇、1-癸醇、1-壬醛、和它們的組合。在實(shí)施方案中，所述第二溶劑包含ι-癸醇。在實(shí)施方案中，所述第一溶劑包含油醇，并且所述第二溶劑包含ι-癸醇。 在實(shí)施方案中，所述萃取劑包含按所述第一和第二溶劑的總體積計(jì)約30%至約 90%的第一溶劑。在實(shí)施方案中，所述萃取劑包含約50%至約70%的第一溶劑。在實(shí)施方案中，所述萃取劑與發(fā)酵培養(yǎng)基的比率為從約1 20至約20 1的體積體積比。
在實(shí)施方案中，所述接觸進(jìn)一步包括在使所述發(fā)酵培養(yǎng)基和第一溶劑與第二溶劑接觸之前，使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與第一溶劑接觸。在實(shí)施方案中，所述與第二溶劑的接觸和所述與第一溶劑的接觸在相同的容器中發(fā)生。在實(shí)施方案中，所述丁醇的一部分通過包括以下步驟的方法同時(shí)從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中被移除a)用氣體從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中汽提丁醇，以形成含丁醇的氣相；以及b)從所述含丁醇的氣相回收丁醇。在實(shí)施方案中，所述經(jīng)基因修飾的微生物選自細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、絲狀真菌、和酵母。在實(shí)施方案中，細(xì)菌選自發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、 沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬 (Pediococcus)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽孢桿菌屬 (Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、禾口短桿菌屬(Brevikicterium)。在實(shí)施方案中，所述細(xì)菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌包含a)編碼異丁醇生物合成途徑的一組基因；和b)下列基因的刪除PflB、LdhA、adhE，以及frdA，frdB， frdC、和FrdD中的至少一種。在實(shí)施方案中，所述一組基因包括a)如SEQ ID N0:1所示的 budB ；b)如 SEQ ID NO 3 所示的 ilvC ；c)如 SEQ ID NO 5 所示的 ilvD ；d)如 SEQ ID NO 7 所示的kivD;和e)如SEQ ID N0:9所示的sadB。在實(shí)施方案中，所述酵母選自伊薩酵母屬 (Issatchenkia)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula) 和糖酵母屬(Saccharomyces)。在實(shí)施方案中，所述經(jīng)基因修飾的微生物包含丁醇生物合成途徑。在實(shí)施方案中， 所述丁醇生物合成途徑包含至少一種對(duì)所述微生物是異源的基因。在實(shí)施方案中，所述丁醇生物合成途徑包含至少兩種對(duì)所述微生物是異源的基因。在實(shí)施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)一步包含乙醇，并且所述含丁醇的有機(jī)相包含乙醇。還提供了包含發(fā)酵培養(yǎng)基的雙相混合物，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含丁醇、水、至少一種可發(fā)酵的碳源、和從發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；和不能與水混溶的萃取劑組合物，所述萃取劑組合物包含第一溶劑和第二溶劑，所述第一溶劑選自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，并且所述第二溶劑選自C7-C11醇、C7-C11羧酸、C7-C11羧酸的酯、C7-C11醛、C12-C22脂肪酰胺以及它們的混合物。附圖簡(jiǎn)述和序列描述
圖1是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中在使發(fā)酵培養(yǎng)基與萃取劑在發(fā)酵容器中接觸之前，組成所述萃取劑的第一溶劑和第二溶劑在容器中被合并。圖2是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中組成所述萃取劑的第一溶劑和第二溶劑被分別添加至發(fā)酵容器，發(fā)酵培養(yǎng)基在該容器中與所述萃取劑接觸。圖3是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中組成所述萃取劑的第一溶劑和第二溶劑被分別添加至用于使發(fā)酵培養(yǎng)基與所述萃取劑接觸的不同發(fā)酵容器中。圖4是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在發(fā)酵罐的下游進(jìn)行，并且在使發(fā)酵培養(yǎng)基與萃取劑在一個(gè)不同容器中接觸之前，組成所述萃取劑的第一溶劑和第二溶劑在容器中被合并。圖5是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在發(fā)酵罐的下游進(jìn)行，并且組成所述萃取劑的第一溶劑和第二溶劑被分別添加至容器中，發(fā)酵培養(yǎng)基在該容器中與所述萃取劑接觸。圖6是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在發(fā)酵罐的下游進(jìn)行，并且組成所述萃取劑的第一溶劑和第二溶劑被分別添加至用于使發(fā)酵培養(yǎng)基與所述萃取劑接觸的不同容器中。圖7是對(duì)本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案的圖解，其中對(duì)產(chǎn)物的萃取在至少一個(gè)分批發(fā)酵罐中進(jìn)行，通過與發(fā)酵醪液底部或接近底部處的(使發(fā)酵罐充滿萃取劑)包含第一溶劑和第二溶劑的不能與水混溶的萃取劑共流，其中所述萃取劑在該發(fā)酵罐的頂部或接近頂部處的一點(diǎn)流出該發(fā)酵罐。下列序列符合37C. F. R. 1. 821 1. 825 (“對(duì)含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請(qǐng)的要求一序列規(guī)則”)，并且與世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST. 25(1998)和EPO 和PCT的序列列表要求(規(guī)則5. 2和49. 5 (bis規(guī)則)，以及行政指導(dǎo)的208節(jié)和附錄C)相一致。^ 1基因和蛋白質(zhì)SEQ ID號(hào)匯總
權(quán)利要求
1.從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收丁醇的方法，所述方法包括a)提供發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含丁醇、水、至少一種可發(fā)酵的碳源和經(jīng)基因修飾的微生物，所述微生物從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇；b)使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與包含第一溶劑和第二溶劑的不能與水混溶的萃取劑組合物接觸，其中所述第一溶劑選自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺以及它們的混合物，所述第二溶劑選自C7-C11醇、C7-C11羧酸、C7-C11羧酸的酯、C7-C11醛以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；C)將所述含丁醇的有機(jī)相與所述水相分離；以及 d)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇以制得回收的丁醇。
2.用于生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括a)提供從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)在包含水相和不能與水混溶的萃取劑組合物的雙相發(fā)酵培養(yǎng)基中，使所述微生物生長(zhǎng)足以令丁醇被萃取至所述萃取劑組合物中的時(shí)間從而形成含丁醇的有機(jī)相，其中所述萃取劑組合物包含第一溶劑和第二溶劑，所述第一溶劑選自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、 C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，并且所述第二溶劑選自C7-C11醇、 C7-C11羧酸、C7-C11羧酸的酯、C7-C11醛、C12-C22脂肪酰胺以及它們的混合物，其中所述雙相發(fā)酵培養(yǎng)基包含按體積計(jì)從約10%至約90%的所述不能與水混溶的萃取劑組合物；C)將所述含丁醇的有機(jī)相與所述水相分離；以及 d)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇以制得回收的丁醇。
3.用于生產(chǎn)丁醇的方法，所述方法包括a)提供從包含至少一種可發(fā)酵的碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；b)使所述微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中所述微生物將丁醇產(chǎn)生到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，從而制得含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基；c)使所述含丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基的至少一部分與包含第一溶劑和第二溶劑的不能與水混溶的萃取劑組合物接觸，其中所述第一溶劑選自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺以及它們的混合物，所述第二溶劑選自C7-C11醇、 C7-C11羧酸、C7-C11羧酸的酯、C7-C11醛以及它們的混合物，以形成包含水相和含丁醇的有機(jī)相的雙相混合物；d)將所述含丁醇的有機(jī)相與所述水相分離；e)從所述含丁醇的有機(jī)相回收丁醇；以及f)使所述水相的至少一部分返回至所述發(fā)酵培養(yǎng)基。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述丁醇為異丁醇。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述萃取劑組合物包含按所述第一和第二溶劑的總體積計(jì)約30%至約90%的第一溶劑。
6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述萃取劑組合物與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的比率為從約1 20至約20 1的體積體積比。
7.權(quán)利要求1的任一項(xiàng)方法，所述方法進(jìn)一步包括在使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與萃取劑組合物接觸之前使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與第一溶劑接觸的步驟。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述與萃取劑組合物的接觸和所述與第一溶劑的接觸在相同的容器中發(fā)生。
9.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述丁醇的一部分通過包括以下步驟的方法同時(shí)從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中被移除a)用氣體從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中汽提丁醇，以形成含丁醇的氣相；以及b)從所述含丁醇的氣相回收丁醇。
10.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包含乙醇。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述乙醇存在于所述含丁醇的有機(jī)相中。
12.雙相混合物，所述雙相混合物包含a)發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含異丁醇、水、至少一種可發(fā)酵的碳源、和從發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)異丁醇的經(jīng)基因修飾的微生物；和b)包含第一溶劑和第二溶劑的不能與水混溶的有機(jī)萃取劑組合物，所述第一溶劑選自 C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它們的混合物，所述第二溶劑選自C7-C11醇、C7-C11羧酸、C7-C11羧酸的酯、C7-C11醛、C12-C22脂肪酰胺以及它們的混合物。
全文摘要
提供了通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，該方法中丁醇產(chǎn)物通過向包含第一溶劑和第二溶劑的不能與水混溶的萃取劑組合物中萃取而被移除。所述第一溶劑選自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺以及它們的混合物。所述第二溶劑選自C7-C11醇、C7-C11羧酸、C7-C11羧酸的酯、C7-C11醛、以及它們的混合物。還提供了從發(fā)酵培養(yǎng)基回收丁醇的方法。
文檔編號(hào)C12P7/16GK102439162SQ201080016711
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者J·W·哈拉姆, M·C·格拉迪, M·加?？? R·帕特奈克 申請(qǐng)人:布特馬斯先進(jìn)生物燃料有限責(zé)任公司