用于干細(xì)胞培養(yǎng)的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用于干細(xì)胞培養(yǎng)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。具體而言，本公開涉及可用于基本未分化狀態(tài)的干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)而同時(shí)維持高生存力的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是可再生器官、修復(fù)組織、制備或遞送生物因子以及治療疾病或病癥的潛在來(lái)源。

發(fā)明內(nèi)容
在單細(xì)胞條件下，人多能干細(xì)胞(hPQ例如人胚胎干細(xì)胞(hES)和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(hiPS)極其脆弱，這妨礙了實(shí)際應(yīng)用。本公開表明，用非肌肉肌球蛋白II (匪II)的高效抑制劑(例如肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑(blelAistatin))處理相當(dāng)大地增強(qiáng)了克隆密度和懸浮條件下hES和hiPS細(xì)胞的存活，并且與合成的基質(zhì)一起支持用于自我更新的確定環(huán)境。本公開通過(guò)消除培養(yǎng)過(guò)程中動(dòng)物或人來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)提供用于人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(hiPS)和人胚胎干細(xì)胞(hES)增殖的基本上無(wú)病原體的培養(yǎng)環(huán)境。本公開證明了抑制肌球蛋白II增加細(xì)胞-基質(zhì)粘附和細(xì)胞存活，這有效支持了 hiPS和hES細(xì)胞在完全限定培養(yǎng)基中的化學(xué)合成的培養(yǎng)物質(zhì)聚D-賴氨酸包被上的自我更新。因?yàn)槿硕嗄芨杉?xì)胞的誘導(dǎo)利用了與細(xì)胞維持和擴(kuò)大相同的培養(yǎng)環(huán)境，所以該方法還可用于對(duì)于基于細(xì)胞的治療方法所必需的完全無(wú)異源材料的新hiPS和hES細(xì)胞系的誘導(dǎo)。當(dāng)前的無(wú)飼養(yǎng)層hESC培養(yǎng)方法需要特定的包被，例如Matrigel (基質(zhì)膠)，血清成分和人細(xì)胞來(lái)源的ECM，hESC需要粘附到其上以增殖。本公開提供促進(jìn)在缺乏此類包被和飼養(yǎng)層下的干細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)組合物和條件。本公開至少因?yàn)橄铝性蛴绊慼ESC培養(yǎng)技術(shù)首先，因?yàn)镸atrigel 或人細(xì)胞來(lái)源的ECM是多種細(xì)胞外基質(zhì)例如層粘連蛋白、纖連蛋白、和IV型膠原的混合物，其成分可隨批次而不同，通過(guò)消除使用細(xì)胞來(lái)源的材料，可以使當(dāng)前取決于包衣材料的質(zhì)量和條件而高度變化的hESC繁殖過(guò)程進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化；第二，由于細(xì)胞來(lái)源的生物材料從來(lái)不能夠完全避免生物污染，包括病毒和抗原，不需要細(xì)胞來(lái)源的包衣將導(dǎo)致對(duì)GMP級(jí)hESC的生長(zhǎng)相當(dāng)有利；第三，雖然人重組ECM可以繞開潛在的污染問(wèn)題，但是它們與簡(jiǎn)單地使用塑料組織培養(yǎng)板在制備時(shí)間、工作量和成本方面沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)性； 以及第四，由于合成的小分子相對(duì)簡(jiǎn)單并具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，所以對(duì)于它們轉(zhuǎn)移至臨床環(huán)境中認(rèn)為是有利的。實(shí)際上，例如Rock抑制劑Y27632已經(jīng)成功地用于臨床研究。在本文中描述了用于本公開的方法和組合物中的另外的化學(xué)抑制劑。
本公開提供了包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和肌球蛋白I I抑制劑的組合物。肌球蛋白II抑制劑可以是肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或其類似物。基礎(chǔ)培養(yǎng)基可包含完全確定成分培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，組合物中還可以包括ROCK抑制劑。在某些實(shí)施方案中，組合物中可包括血清，包括與細(xì)胞類型同種異體的或者自體的血清。在又一實(shí)施方案中，組合物還可進(jìn)一步包括氨基酸，例如非必需氨基酸。在另一實(shí)施方案中，在組合物中可以包括還原劑 (例如β巰基乙醇)。在組合物中可以包括抗微生物劑和/或抗真菌劑。本公開還提供包含補(bǔ)加有非必需氨基酸、抗氧化劑、還原劑、生長(zhǎng)因子、丙酮酸鹽和肌球蛋白II抑制劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組合物。肌球蛋白II抑制劑可以是肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或其類似物。本公開還提供包含聚-D-賴氨酸或者以聚-D-賴氨酸包被的組織培養(yǎng)板、瓶或生長(zhǎng)基底，確定成分培養(yǎng)基和肌球蛋白II抑制劑的試劑盒。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，試劑盒可以如此區(qū)室化，以致于本公開的組合物可以在使用前混合。肌球蛋白II抑制劑可以是肌球蛋白II 馬達(dá)活性抑制劑或其類似物。本公開還提供培養(yǎng)干細(xì)胞(包括hiPS和ESC)的方法，包括將干細(xì)胞懸浮于包含肌球蛋白II抑制劑的培養(yǎng)基中；和在聚-D-賴氨酸包被的組織培養(yǎng)基底存在下培養(yǎng)干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基。在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基無(wú)動(dòng)物產(chǎn)物。本公開還提供干細(xì)胞培養(yǎng)物，包含在包含確定成分培養(yǎng)基和肌球蛋白II抑制劑的組合物中的干細(xì)胞，其中無(wú)干細(xì)胞和Neu5Gc并且其中干細(xì)胞沒(méi)有在任何動(dòng)物產(chǎn)物材料存在下培養(yǎng)(例如培養(yǎng)至少1、2、5、10、20、30、40或50或更多代)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在聚-D-賴氨酸存在下培養(yǎng)干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，肌球蛋白II抑制劑是肌球蛋白II 馬達(dá)活性抑制劑或其類似物。


圖IA-D顯示肌球蛋白II是調(diào)節(jié)ES細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞接觸中的Rock下游的典型效應(yīng)物。㈧以混雜的(scrambled)) siRNA轉(zhuǎn)染的mES(CJ7)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，顯示對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞粘附?jīng)]有影響，而以靶向肌球蛋白IIA和IIB兩者的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞-細(xì)胞接觸的顯著破壞。細(xì)胞接觸指數(shù)支持形態(tài)學(xué)觀察。數(shù)據(jù)是平均值士30，** <0.001，11 = 5。(B)免疫熒光分析將MYPTl蛋白質(zhì)定位在未分化ES細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞間連接部位。插圖顯示同一集落的相差圖像。(C)描述Rock通過(guò)MYPTl的抑制而調(diào)節(jié)肌球蛋白II功能的分子途徑。虛線表示直接磷酸化和活化MRLC的替代的Rock功能。(D)在通過(guò)siRNA的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中，mES細(xì)胞以MYPTl siRNA轉(zhuǎn)染，并且M小時(shí)后，以Y27632處理M小時(shí)。細(xì)胞能夠?qū)挂种苿┑膹?qiáng)破壞細(xì)胞接觸作用而維持它們的細(xì)胞-細(xì)胞完整性。在挽救實(shí)驗(yàn)中， 以Y27632處理M小時(shí)的mES細(xì)胞，隨后以靶向MYPTl的siRNA轉(zhuǎn)染。M小時(shí)后，將細(xì)胞拍照。相當(dāng)大比例的細(xì)胞能夠恢復(fù)它們的細(xì)胞-細(xì)胞接觸并且形成了前集落樣結(jié)構(gòu)。通過(guò)表現(xiàn)形態(tài)學(xué)觀察的CCI定量細(xì)胞-細(xì)胞接觸狀態(tài)。數(shù)據(jù)是平均值士SD，**p < 0. 005,η = 5。 標(biāo)尺，25 μ m。圖2顯示ES細(xì)胞中的siRNA介導(dǎo)的基因沉默。為了確定mES細(xì)胞中的siRNA轉(zhuǎn)染效率，使用Lipofectamine 2000以40nM的綠色熒光團(tuán)(FAM)標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且M小時(shí)后，在熒光倒置顯微鏡上評(píng)價(jià)細(xì)胞。實(shí)際上幾乎所有的細(xì)胞摻入了熒光團(tuán)標(biāo)記的
5SiRNA0插圖表示相差圖像。為了評(píng)價(jià)內(nèi)源基因被siRNA處理敲低的水平，當(dāng)將兩種不同的 siRNA混合時(shí)，以40nM或25nM的靶向特定基因的每一 siRNA轉(zhuǎn)染mES細(xì)胞。24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，并進(jìn)System分析和QPCR分析。對(duì)于Wfestern分析，使用β-肌動(dòng)蛋白作為加樣對(duì)照。雖然似乎Rock I siRNA具有同種型特異性的作用，但是Rock II siRNA以相似方式影響兩種同種型。因此，僅當(dāng)通過(guò)共轉(zhuǎn)染Rock I和Rock II siRNA使Rock I和RockII 同時(shí)耗竭時(shí)，才能評(píng)價(jià)Rock siRNA對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞接觸的影響。對(duì)于QPCR分析，將數(shù)據(jù)針對(duì) β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。mES細(xì)胞中肌球蛋白IIC的內(nèi)源mRNA水平比其它肌球蛋白低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。雖然肌球蛋白IIC特異性siRNA處理進(jìn)一步降低表達(dá)水平至對(duì)照的40%， 但是沒(méi)有觀察到對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞接觸的實(shí)質(zhì)影響。標(biāo)尺，25 μ m。圖3A-D顯示調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞通訊的liho-Rock-肌球蛋白II信號(hào)軸在hES細(xì)胞中是保守的。(A)未分化hES細(xì)胞(H9)的形態(tài)學(xué)，顯示緊密連接的集落。通過(guò)投射電子顯微鏡的超微結(jié)構(gòu)分析表明在細(xì)胞-細(xì)胞接觸部位存在特化的連接復(fù)合體(箭頭)。(B)以C3 胞外酶(20yg/ml)處理M小時(shí)的hES細(xì)胞表現(xiàn)出緊密的細(xì)胞-細(xì)胞連接被破壞。超微結(jié)構(gòu)分析顯示，C3處理的細(xì)胞偶爾會(huì)通過(guò)細(xì)胞邊緣的小區(qū)域與毗鄰細(xì)胞接觸(插圖)。(C) Y27632以比對(duì)于mES細(xì)胞(10 μ M)的濃度更高的濃度(20 μ Μ)分解生長(zhǎng)在基質(zhì)膠上的hES 細(xì)胞中的細(xì)胞-細(xì)胞連接。細(xì)胞接觸指數(shù)概述了抑制劑對(duì)hES細(xì)胞的影響。數(shù)據(jù)是平均值士SD，**p < 0. 001，η = 5。(D)在對(duì)照條件下生長(zhǎng)的hES細(xì)胞的免疫熒光分析顯示，肌球蛋白IIA專一性定位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸部位，其與E-鈣黏著蛋白的亞細(xì)胞分布重疊。肌球蛋白II特異性的合成的抑制劑肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑(10 μ M)以與在C3或Υ27632 處理的細(xì)胞中所看到的相似的方式破壞hES細(xì)胞中的細(xì)胞-細(xì)胞連接。標(biāo)尺，25 μ m。圖4A-E顯示肌球蛋白II選擇性抑制劑肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑增強(qiáng)在確定條件下的人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS)的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用、細(xì)胞存活和自我更新。(A)以不同濃度肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或Y27632處理的PDL包被上的hiPS細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。 在抑制劑缺乏下hiPS細(xì)胞沒(méi)有粘附到PDL包被上(數(shù)據(jù)未顯示)。(B)以不同濃度肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或Y27632處理的懸浮培養(yǎng)的hiPS細(xì)胞的胚狀體形成。在顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野內(nèi)的胚狀體數(shù)量。數(shù)據(jù)是平均值士SD，n = 5。在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中觀察到類似的結(jié)果。(C)在2. 5μ M的肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或Υ27632存在下在基質(zhì)膠或 PDL上生長(zhǎng)的hiPS細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。(D)如通過(guò)QPCR所測(cè)定的在2. 5 μ M肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或Υ27632存在下在基質(zhì)膠或PDL上生長(zhǎng)的hiPS細(xì)胞中0ct3/4的表達(dá)。(E) 在2. 5 μ M肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑存在下在PDL包被上生長(zhǎng)傳代15次hiPS細(xì)胞的形態(tài)學(xué)(頂圖)。中圖顯示圖通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)評(píng)價(jià)的在同樣條件下生長(zhǎng)的hiPS細(xì)胞中的 0ct3/4表達(dá)。在基質(zhì)膠上生長(zhǎng)的hiPS細(xì)胞表現(xiàn)出未分化集落和分化成纖維細(xì)胞的混合物 (底圖)。標(biāo)尺，除(E)底圖外為50 μ m，100 μ m。圖5顯示總結(jié)調(diào)節(jié)ES細(xì)胞中基礎(chǔ)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的Mio-Rock-肌球蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑的模型。在研究中使用的化學(xué)物和siRNA分別以紅色和星號(hào)突出顯示。虛線表示細(xì)胞完整性和自我更新途徑之內(nèi)或之間潛在的機(jī)械相互作用。箭頭表示活化并且橫線表示移植。圖6A-L顯示通過(guò)肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑抑制匪II增強(qiáng)在克隆和懸浮培養(yǎng)條件下hPS細(xì)胞的存活。(a)如通過(guò)Western和免疫細(xì)胞化學(xué)分析所測(cè)定的hES細(xì)胞中NMHCIIA和IIB的表達(dá)。β -肌動(dòng)蛋白用作加樣對(duì)照。(b)通過(guò)ALP測(cè)定評(píng)價(jià)的hiPS細(xì)胞的克隆測(cè)定。hiPS細(xì)胞以每孔一個(gè)細(xì)胞鋪于存在或缺乏5μ M肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑的96孔板中7天，隨后通過(guò)ALP測(cè)定評(píng)價(jià)。(c)通過(guò)ALP陽(yáng)性集落孔的數(shù)量與所接種孔的數(shù)量的比率測(cè)定克隆效率。數(shù)據(jù)是平均值士30，*郵<0.01，11 = 3。從hES細(xì)胞得到相似結(jié)果。(d-g)在粘附條件下hiPS細(xì)胞的細(xì)胞生存力測(cè)定。細(xì)胞以IXlO5個(gè)細(xì)胞/孔一式三份鋪于PDL包被的12孔板中。M小時(shí)后，將細(xì)胞拍照(d)，并且通過(guò)臺(tái)盼蘭排染法計(jì)數(shù)有活力細(xì)胞的數(shù)量(e)。鋪于含肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑的細(xì)胞顯示存活率相當(dāng)大地高于對(duì)照。數(shù)據(jù)是平均值士SD，*p < 0. 05，< 0. 01，< 0. 001，η = 3。相同的實(shí)驗(yàn)每一細(xì)胞系重復(fù)至少3次并且顯示代表性的數(shù)據(jù)。對(duì)于每一單獨(dú)的細(xì)胞系觀察到對(duì)不同濃度肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或Y-27632具有相同的反應(yīng)模式。從hES細(xì)胞得到相似的結(jié)果。(f)hiPS細(xì)胞凋亡的評(píng)價(jià)。對(duì)用于(e)中細(xì)胞生存力測(cè)定的細(xì)胞進(jìn)行TUNEL分析。數(shù)據(jù)是平均值士30，郵<0.05，*郵<0.01，11 = 3。(g)通過(guò)使用抗裂解型胱天蛋白酶-3抗體的Western分析評(píng)價(jià)與(e)中所示相同條件下鋪板的細(xì)胞。β-肌動(dòng)蛋白用作加樣對(duì)照。(h-Ι)肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑處理增加了懸浮培養(yǎng)中的hPS細(xì)胞的存活。 hiPS(FS)或hES (BGNOl)細(xì)胞于肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或Y-27632存在或缺乏下在懸浮培養(yǎng)液中培養(yǎng)2天，隨后拍照(顯示hiPS細(xì)胞)(h)，并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)(i，j)。還開展TUNEL測(cè)定(k)和檢測(cè)裂解型胱天蛋白酶-3的Western分析⑴(顯示來(lái)自hiPS細(xì)胞的數(shù)據(jù))。數(shù)據(jù)是平均值士SD，*p < 0. 05，< 0. 01，η = 3。β -肌動(dòng)蛋白用作加樣對(duì)照。標(biāo)尺,25 μ m。圖7A-H顯示增強(qiáng)的NMHCIIA7A mES細(xì)胞存活率。(a)通過(guò)^festern分析評(píng)價(jià)親本野生型(RW4)和NMHCIIA7A.突變體mES細(xì)胞中NMHCIIA和NMHCIIB表達(dá)。β -肌動(dòng)蛋白用作加樣對(duì)照。(b)生長(zhǎng)于明膠包被板上的RW4和NMHCIIA7A-突變體細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。突變體細(xì)胞顯示松散的細(xì)胞-細(xì)胞接觸，而RW4細(xì)胞表現(xiàn)出緊密的細(xì)胞-細(xì)胞粘附。(c-e) NMHCIIAVAmES細(xì)胞存活率高于RW4。將細(xì)胞以1 X IO5個(gè)細(xì)胞/孔的密度一式三份鋪于明膠包被的12-孔板中。M小時(shí)后，將細(xì)胞拍照(c)，并通過(guò)活細(xì)胞計(jì)數(shù)(d)以及TUNEL測(cè)定 (e)評(píng)價(jià)。圖是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)是平均值士SD，*p < 0. 05，η = 3。(f) NMHCIIB7BmES細(xì)胞的相差圖像。細(xì)胞保持細(xì)胞-細(xì)胞粘附。(c，d)NMHCIIB7B mES細(xì)胞如上所述鋪板并且開展細(xì)胞生存力(g)和TUNEL(h)測(cè)定。數(shù)據(jù)是平均值士SD，n = 3。標(biāo)尺，25 μ m。圖8A-G顯示對(duì)匪II的抑制增強(qiáng)人和小鼠多能干細(xì)胞中自我更新調(diào)節(jié)物的表達(dá)。 (a-d)hES細(xì)胞以IX IO5個(gè)細(xì)胞/孔鋪于基質(zhì)膠包被的6-孔板中不含肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑的mTeSR中。對(duì)小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成新鮮的mTeSR或者含不同濃度肌球蛋白II 馬達(dá)活性抑制劑或不含肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑的hESm中。在更換培養(yǎng)基后48小時(shí)時(shí)，收獲細(xì)胞提取RNA或蛋白質(zhì)。通過(guò)QPCR檢測(cè)mTeSR(a)或hESm(b)中生長(zhǎng)的細(xì)胞中的 0ct3/4和Nanog表達(dá)，或者通過(guò)Western分析檢測(cè)hESm中生長(zhǎng)的細(xì)胞中的0ct3/4和Nanog 表(c，d)。生長(zhǎng)在不含肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑的mTeSR中的細(xì)胞的條件指示為“對(duì)照”。從hiPS細(xì)胞得到相似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)于QPCR，將數(shù)據(jù)針對(duì)β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在Y軸上的表達(dá)水平以任意單位顯示(對(duì)照設(shè)置為1.0)。對(duì)于Western 分析，β-肌動(dòng)蛋白用作加樣對(duì)照。(e)還對(duì)在相同條件下(含5μ M或不含肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑的hESm)生長(zhǎng)的細(xì)胞開展免疫細(xì)胞化學(xué)以檢測(cè)0ct3/4表達(dá)。在每一條件之間使用完全相同的參數(shù)，包括對(duì)于每一濾光片的曝光時(shí)間捕獲圖像。相差圖像顯示生長(zhǎng)于hESm中的細(xì)胞表現(xiàn)出大而扁的形態(tài)，而生長(zhǎng)于mTeSR(對(duì)照)中的細(xì)胞保持緊湊且致密的形態(tài)。標(biāo)尺，25 μ m。(f)通過(guò)QPCR分析在LIF存在下生長(zhǎng)的野生型(RW4)和NMHCIIA7 AmES細(xì)胞中的0ct3/4和Nanog的表達(dá)。數(shù)據(jù)針對(duì)β -肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)照設(shè)置為1. O。(g)通過(guò)Western分析評(píng)價(jià)在LIF存在或缺乏下生長(zhǎng)2天的相同組的mES細(xì)胞系。β-肌動(dòng)蛋白用作加樣對(duì)照。圖9Α-Η顯示肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑處理支持完全確定條件下的hPS細(xì)胞的自我更新。(a-d)hiPS細(xì)胞于肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑存在下在PDL上生長(zhǎng)20代。顯示了在肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑/PDL條件(a)或標(biāo)準(zhǔn)無(wú)飼養(yǎng)層條件(Matr igel ) (b) 下的hiPS細(xì)胞的形態(tài)血。通過(guò)使用共焦顯微鏡的免疫熒光評(píng)價(jià)在肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑/PDL條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞0ct3/4表達(dá)的高倍圖像或相差圖像(c)。(d)通過(guò)Western分析評(píng)價(jià)在標(biāo)準(zhǔn)無(wú)飼養(yǎng)層(基質(zhì)膠)、肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑/PDL或Y-27632/PDL條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞中的0ct3/4和Nanog表達(dá)。β -肌動(dòng)蛋白用作加樣對(duì)照。(e)通過(guò)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量確定在肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑/PDL、Y-27632/PDL或標(biāo)準(zhǔn)無(wú)飼養(yǎng)層(基質(zhì)膠) 條件下培養(yǎng)的hiPS細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。每一數(shù)據(jù)點(diǎn)顯示為平均值士SD，n = 3。在肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑/PDL、Y-27632/PDL或標(biāo)準(zhǔn)無(wú)飼養(yǎng)層條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞的群體倍增時(shí)間分別為約32. 1小時(shí)、32. 2小時(shí)或31. 8小時(shí)。WhES細(xì)胞得到相似的結(jié)果。(f)將在肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑/PDL條件下生長(zhǎng)20代的細(xì)胞收獲，并將大約2X IO6個(gè)細(xì)胞皮下注射入SCID/beige小鼠內(nèi)。4至8周后，收集畸胎瘤，并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。證實(shí)每一畸胎瘤樣品中存在3胚層衍生的組織。(g)通過(guò)免疫熒光分析檢查石蠟包埋的畸胎瘤切片。在畸胎瘤來(lái)源的組織中檢測(cè)到組織特異性標(biāo)記物，例如巢蛋白、甲胎蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。(h)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的G-顯帶對(duì)在確定條件(肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑/PDL)下生長(zhǎng)20代的hiPS(R5)細(xì)胞進(jìn)行核型分析，并證實(shí)保持染色體完整性。標(biāo)尺，25 μ m。圖IOA-D顯示肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑處理增強(qiáng)粘附條件下的hPS細(xì)胞的存活。(a)hiPS細(xì)胞以IXlO5個(gè)細(xì)胞/孔接種于基質(zhì)膠包被的12-孔板中。M小時(shí)后，通過(guò)臺(tái)盼蘭排染測(cè)定法計(jì)數(shù)活細(xì)胞的數(shù)量。數(shù)據(jù)是平均值士SD，*p < 0. 05，**p < 0. 01，
<0. 001,η = 3。(b)hiPS細(xì)胞的凋亡測(cè)定。在熒光顯微鏡下檢測(cè)TUNEL-FITC-陽(yáng)性細(xì)胞， 并且計(jì)算TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與PI-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比率。數(shù)據(jù)是平均值士SD，*p < 0. 05，
< 0. 01，η = 3。(c)在PDL包被的皿中的含不同濃度肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑培養(yǎng)基中生長(zhǎng)M小時(shí)的hiPS細(xì)胞的高倍相差圖像。注意用肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑處理的粘附細(xì)胞的延長(zhǎng)的細(xì)胞突起。(d)使用鋪于PDL包被皿上的hiPS細(xì)胞測(cè)定不同濃度 MLCK抑制劑ML-7對(duì)細(xì)胞生存力的作用。觀察到細(xì)胞存活沒(méi)有顯著增加。從使用hES細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)得到相似的結(jié)果。標(biāo)尺，25 μ m。圖IlA-C顯示通過(guò)肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑增強(qiáng)懸浮培養(yǎng)的hiPS細(xì)胞的存活。hiPS(NHDFl)細(xì)胞在肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或Y-27632存在或缺乏下懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)2天，并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)(a)和TUNEL測(cè)定(b)。數(shù)據(jù)是平均值士 SD，*p < 0. 05，
<0. 01，η = 3。(c)懸浮條件下生長(zhǎng)的hiPS細(xì)胞以不同濃度的ML-7處理。在以ML-7處理的細(xì)胞中觀察到存活率沒(méi)有差異。
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圖12顯示在確定條件下培養(yǎng)的hES細(xì)胞中保持了染色體完整性。hES(H9)細(xì)胞在確定條件(肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑/PDL)下生長(zhǎng)20代，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)G-帶核型分析評(píng)價(jià)。證實(shí)了沒(méi)有異常的雌性核型分析。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到的那樣，在附圖中表示的數(shù)據(jù)和信息僅是代表性的并且沒(méi)有描述本公開的全部范圍。
具體實(shí)施例方式如本文和后附權(quán)利要求書中所使用，單數(shù)形式“一”、“和”和“the”包括復(fù)數(shù)形式， 除非上下文明確地另外說(shuō)明。因此，例如，當(dāng)提到“細(xì)胞”時(shí)包括此類細(xì)胞的復(fù)數(shù)形式，并且當(dāng)提到“試劑”時(shí)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種試劑，等等。同樣，“或”的使用意思是指“和/或”，除非另外說(shuō)明。類似地，“包含”、“包含著”、 “包含的”、“包括”、“包括著”和“包括著”可互換并且不旨在是限制性的。還應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解，當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“包含”描述不同實(shí)施方案時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將
理解，在一些特定情況下，實(shí)施方案可備選地使用“基本上由......組成”或“由......組
成”描述。雖然在實(shí)施本公開的方法和組合物中可使用與本文所述的方法和材料相似或等效的那些方法和材料，但是本文描述示例性的方法、裝置和好材料。除非另外定義，在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本公開所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。因此，如在本申請(qǐng)通篇中所使用，下列術(shù)語(yǔ)將具有下列含義。多能干細(xì)胞是經(jīng)歷自我更新而同時(shí)保持了產(chǎn)生所有三胚層衍生組織和生殖細(xì)胞譜系能力的細(xì)胞類型。雖然來(lái)源于人胚泡的多能人胚胎干細(xì)胞(hES)是用于治療疾病和病癥例如帕金森病、心肌梗塞、脊髓損傷和糖尿病的基于細(xì)胞治療的有希望的來(lái)源，但是由于它們的免疫原性和倫理問(wèn)題妨礙了它們的臨床潛能。本公開證明，liho-Rock-肌球蛋白II (RRM)信號(hào)軸調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞_基質(zhì)相互作用，以及hiPS和hES細(xì)胞兩者的細(xì)胞存活?；谠撔畔ⅲ竟_提供組合肌球蛋白II的化學(xué)抑制劑的培養(yǎng)系統(tǒng)(例如肌球蛋白II選擇性的化學(xué)抑制劑)。此外，本公開證明生長(zhǎng)在確定的合成的D-賴氨酸上的hES和 hiPS可以用于培養(yǎng)hES和hiPS細(xì)胞。因此，進(jìn)一步添加低濃度肌球蛋白II抑制劑(例如諸如肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑及其類似物)與單一的合成基質(zhì)的組合，以及完全確定成分培養(yǎng)基提供了如此的培養(yǎng)系統(tǒng)，即其減少(或消除)來(lái)自人來(lái)源或動(dòng)物來(lái)源培養(yǎng)系統(tǒng)的病原體的存在?？梢允褂帽竟_培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞類型包括來(lái)自任何哺乳動(dòng)物包括人、猴和猿的干細(xì)胞，并且包括胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞和Nanog iPS細(xì)胞(見(jiàn)例如Nature，448 313-318，2007年7月；和Takahashi等，Cell，131 (5) :861-872 ；該兩篇文獻(xiàn)通過(guò)參考并入本文)。例如，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS或iPSC)是通過(guò)(內(nèi)源基因的)選擇性基因表達(dá)或者通過(guò)以異源基因轉(zhuǎn)染從非多能細(xì)胞得到的一種類型的多能干細(xì)胞。誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞由日本京都大學(xué)的Shinya Yamanaka研究組描述。Yamanaka已經(jīng)鑒定了在胚胎干細(xì)胞中特別活躍的基因，并使用反轉(zhuǎn)錄病毒以選擇的這些基因轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞。最后，分離了對(duì)于多能干細(xì)胞產(chǎn)生必需的四個(gè)關(guān)鍵的多能性基因0ct-3/4、 S0X2、c-Myc和Klf4。通過(guò)抗生素選擇從細(xì)胞中分離出1^x15+細(xì)胞。該研究組與來(lái)自哈佛大學(xué)、MIT和加州大學(xué)洛杉磯分校的兩個(gè)其他獨(dú)立研究組一起公布了的一項(xiàng)研究顯示成功地將小鼠成纖維細(xì)胞重編程進(jìn)入iPS并且甚至產(chǎn)生活的嵌合體。雖然iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞在分子和功能水平實(shí)際上相同，但是將它們的治療潛能轉(zhuǎn)化成醫(yī)學(xué)應(yīng)用存在關(guān)鍵的障礙。問(wèn)題之一是，由于用于iPS細(xì)胞重編程和繁殖的當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)方案包括不適宜用于潛在臨床目的的動(dòng)物來(lái)源的材料，所以需要開發(fā)產(chǎn)生和擴(kuò)增hiPS細(xì)胞的確定的方法。用于hiPS和hES細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境基本上依賴于兩大主要元素，即培養(yǎng)基和ECM包被，后者包括基質(zhì)膠，一種廣泛用于無(wú)培養(yǎng)層培養(yǎng)方法的小鼠腫瘤細(xì)胞來(lái)源的ECM的混合物。雖然在理解自我更新機(jī)制中的最新進(jìn)展已經(jīng)導(dǎo)致制造出完全限定培養(yǎng)基，由于ECM結(jié)構(gòu)成分的復(fù)雜性和關(guān)于多能干細(xì)胞細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)相互作用方面的基礎(chǔ)研究積累不足，所以滿足嚴(yán)格的臨床標(biāo)準(zhǔn)的包被方法的開發(fā)仍然是主要的挑戰(zhàn)。細(xì)胞遷移、肌球蛋白合成和ECM相互作用在細(xì)胞發(fā)育、分化以及某些疾病例如動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎和腎小球腎炎的發(fā)展中是重要的。細(xì)胞遷移的最初事件是突出物向遷移方向的極化和延伸。Rho家族小GTP酶通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞粘附控制這些突出物(板狀偽足和絲足)的形成。Rac和Cdc42分別參與板狀偽足和絲足的形成，并且他0參與張力纖維的形成和收縮。通過(guò)這些Mio家族成員的協(xié)同調(diào)節(jié)使細(xì)胞能夠遷移。當(dāng)通過(guò)激動(dòng)劑刺激細(xì)胞時(shí)，⑶P結(jié)合形式的Mio家族小GTP酶轉(zhuǎn)變成GTP結(jié)合形式，并且它們與效應(yīng)分子相互作用。MiO通過(guò)其效應(yīng)分子例如MiO-激酶/R0CK/R0K和肌球蛋白磷酸酶的肌球蛋白結(jié)合亞基(MBQ調(diào)節(jié)肌球蛋白磷酸化(Kimura等，1996)?；罨?Rho與Iih0-激酶和MBS相互作用并活化Mio-激酶。隨后，活化的Iiho-激酶磷酸化肌球蛋白輕鏈(MLC)和MBS。MBS的磷酸化使肌球蛋白磷酸酶失活。ESC源自胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)。ESC可無(wú)限生長(zhǎng)(自我更新)而同時(shí)保持產(chǎn)生所有體細(xì)胞類型和生殖細(xì)胞譜系的能力(多能性)。這種特異性的干細(xì)胞功能已經(jīng)在分子水平進(jìn)行了研究，結(jié)果鑒定出主要轉(zhuǎn)錄因子例如0ct3/4和Nanog以及分泌的信號(hào)分子包括白血病抑制因子(LIF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和Wnt具有關(guān)鍵作用。最近對(duì)hESC的誘導(dǎo)開啟了使用多能干細(xì)胞作為治療疾病例如帕金森病和糖尿病的細(xì)胞移植治療來(lái)源的大門。隨著對(duì)hESC用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究需求的日益增加，有必要研究如何調(diào)節(jié)多能性以開發(fā)過(guò)硬的技術(shù)以便誘導(dǎo)和擴(kuò)大在誘導(dǎo)任何分化類型的成體細(xì)胞之前處于整個(gè)細(xì)胞治療策略中心地位的hESC。干細(xì)胞是能夠分化成其它細(xì)胞類型，包括具有特定的專門功能的那些細(xì)胞(例如組織特異性細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞及其祖細(xì)胞)的細(xì)胞。祖細(xì)胞(即“專能”)是可以產(chǎn)生不同的終末分化細(xì)胞類型的細(xì)胞，和能夠產(chǎn)生不同祖細(xì)胞的細(xì)胞。產(chǎn)生一些或許多，但并非全部生物體細(xì)胞類型的細(xì)胞常常稱作“多能性”干細(xì)胞，其能夠分化成成熟生物體身體內(nèi)的任何細(xì)胞類型，雖然在不重編程時(shí)它們不能夠去分化成衍生它們的細(xì)胞。如將認(rèn)識(shí)到的那樣，“專能干細(xì)胞/祖細(xì)胞(例如神經(jīng)干細(xì)胞)比多能干細(xì)胞具有更窄的分化潛能。比多能干細(xì)胞甚至更原始的另一類細(xì)胞(即未定型至走向特定分化的命運(yùn))是所謂的“全能”干細(xì)胞(例如受精卵，處于發(fā)育中二細(xì)胞和四細(xì)胞階段的胚胎細(xì)胞)，可具有分化成特定物種任何細(xì)胞類型的能力。例如，單個(gè)全能干細(xì)胞將產(chǎn)生完整的動(dòng)物，以及特定物種(例如人)中存在的無(wú)數(shù)的細(xì)胞類型。如可認(rèn)識(shí)到的那樣，在分離和培養(yǎng)干細(xì)胞用于移植、細(xì)胞再生和取代治療、藥物開發(fā)、產(chǎn)生模型系統(tǒng)用于研究哺乳動(dòng)物發(fā)育、以及基因治療存在很大的興趣。然而，當(dāng)前的培養(yǎng)條件在其維持分離的干細(xì)胞處于未分化但增殖狀態(tài)的能力有限。例如，使用已經(jīng)補(bǔ)加白血病抑制因子(LIF)的無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)可以維持胚胎干細(xì)胞和生殖細(xì)胞。另一方面，當(dāng)細(xì)胞在沒(méi)有適當(dāng)?shù)娘曫B(yǎng)細(xì)胞層或者來(lái)自適當(dāng)飼養(yǎng)細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基情況下培養(yǎng)時(shí)，甚至在 LIF存在下培養(yǎng)時(shí)，用于維持人胚胎干細(xì)胞的常規(guī)技術(shù)導(dǎo)致它們快速分化。此外，培養(yǎng)未分化干細(xì)胞的當(dāng)前方法除了需要添加飼養(yǎng)細(xì)胞層(或者來(lái)自適當(dāng)飼養(yǎng)細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基)外，還需要諸如使用血清。對(duì)成分諸如血清、飼養(yǎng)細(xì)胞和/或條件培養(yǎng)基使培養(yǎng)干細(xì)胞過(guò)程復(fù)雜化，另外，對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，培養(yǎng)條件會(huì)導(dǎo)致異種材料的污染。 此外，飼養(yǎng)細(xì)胞和異種培養(yǎng)成分(例如胎牛血清等等)的使用增加了干細(xì)胞被不必要成分 (例如異常細(xì)胞、病毒、會(huì)引起干細(xì)胞群體接受體內(nèi)免疫反應(yīng)的細(xì)胞、異種融合細(xì)胞等等) 污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此限制了干細(xì)胞作為治療劑或者在生產(chǎn)治療劑中的治療潛能。本公開提供用于在缺乏動(dòng)物產(chǎn)物的情況下培養(yǎng)干細(xì)胞的組合物、方法和系統(tǒng)。因此，本公開提供無(wú)動(dòng)物產(chǎn)物的干細(xì)胞、使用此類干細(xì)胞的方法和包含此類干細(xì)胞的組合物。 本公開還提供用于在飼養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物材料缺乏情況下在完全確定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，而同時(shí)維持高生存力(例如等于或高于典型的干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù))并維持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)的方法和組合物。本公開包括修飾干細(xì)胞維持過(guò)程中的細(xì)胞信號(hào)發(fā)放，由此組織分化并且同時(shí)維持旺盛的細(xì)胞增殖的方法和組合物。例如，本公開的培養(yǎng)基將缺乏N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)和/或乳酸脫氫酶增高癥病毒(LDEV)，它們是來(lái)源于存在動(dòng)物產(chǎn)物的培養(yǎng)基的污染物。本公開證明，通過(guò)選擇性化學(xué)抑制劑肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑抑制肌球蛋白 II增強(qiáng)hiPS和hES細(xì)胞的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用和細(xì)胞存活，這是人多能干細(xì)胞在臨床相關(guān)培養(yǎng)環(huán)境下成功生長(zhǎng)的關(guān)鍵要素。此外，由于用于hiPS細(xì)胞和hES細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程的培養(yǎng)條件與用于人多能干細(xì)胞常規(guī)維持和生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件基本上相同，所以本公開中開發(fā)的技術(shù)可用于產(chǎn)生無(wú)動(dòng)物來(lái)源材料的新的hiPS和hES細(xì)胞系。通過(guò)由特異性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)的多種粘附分子、它們互聯(lián)的支架蛋白質(zhì)以及肌動(dòng)蛋白-細(xì)胞骨架的協(xié)同合作實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞接觸。雖然研究已經(jīng)證明，數(shù)種細(xì)胞外分泌性信號(hào)分子例如LIF、BMP、FGF、TGF- β /Nodal和Wnt對(duì)于多能性遺傳程序是重要的， 但是關(guān)于控制細(xì)胞-細(xì)胞通訊和整合的特異性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子在多能ESC內(nèi)的功能意義知道的很少。細(xì)胞-細(xì)胞接觸受多種類型粘附分子和互聯(lián)骨架結(jié)構(gòu)，包括肌球蛋白的調(diào)節(jié)，肌球蛋白是一種ATP-驅(qū)動(dòng)的分子馬達(dá)，其還決定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和極性細(xì)胞功能。siRNA介導(dǎo)的功能喪失實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于ES細(xì)胞的細(xì)胞粘附需要非肌肉肌球蛋白II。肌球蛋白II是雙頭常規(guī)肌球蛋白，它包括三種同種型，HA, IIB和IIC，它們當(dāng)中除了 IIC外均在ES細(xì)胞中表達(dá)， 而分化的細(xì)胞表達(dá)所有這三種同種型。驚人的是，當(dāng)肌球蛋白IIA和IIB同種型同時(shí)缺乏時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞-細(xì)胞接觸的瓦解，這模擬了在缺乏Mio和Rock功能的細(xì)胞中所觀察到的表型。Rock磷酸化MYPTl并使其失活，以保護(hù)驅(qū)動(dòng)肌球蛋白II功能的磷酸化的活化形式MRLC。發(fā)現(xiàn)MYPTl專一性地定位于mES細(xì)胞中的細(xì)胞-細(xì)胞接觸部位。如果Rock通過(guò)抑制mES細(xì)胞中的MYPTl控制肌球蛋白功能，則缺乏MYPTl將從Rock抑制劑的強(qiáng)大效應(yīng)中援救本來(lái)的細(xì)胞-細(xì)胞通訊。與該假設(shè)相一致，在抑制劑處理之前或之后使MYPTl缺乏分別導(dǎo)致細(xì)胞-細(xì)胞接觸明顯地保護(hù)或恢復(fù)。當(dāng)ESC在未分化狀態(tài)下生長(zhǎng)時(shí)，保持了較小的細(xì)胞大小和高的核/質(zhì)比并經(jīng)歷緊密的集落形成。然而，當(dāng)它們開始分化時(shí)表現(xiàn)出更大的和更扁的形態(tài)學(xué)，并且偶爾降低細(xì)胞-細(xì)胞接觸，然后遷移至集落的外面。不管形態(tài)學(xué)觀察的描述性性質(zhì)如何，由于形態(tài)學(xué)準(zhǔn)確地代表干細(xì)胞的特異生物學(xué)狀態(tài)，所以它仍然常規(guī)用作主要且可靠的指標(biāo)確定ESC分化狀態(tài)。整聯(lián)蛋白和受體酪氨酸激酶(RTK)通過(guò)例如G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)向細(xì)胞骨架發(fā)信號(hào)可導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞的活性，包括細(xì)胞形態(tài)、遷移、增殖和存活的變化產(chǎn)生不同的影響。整聯(lián)蛋白與黏著斑(FA)復(fù)合體的其它成分一起充當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架之間的連接。整聯(lián)蛋白活化導(dǎo)致黏著斑激酶(FAK)和Src激酶活化，這導(dǎo)致其它FA成分例如樁蛋白和Crk 相關(guān)底物P130CAS的磷酸化，以及信號(hào)銜接蛋白的募集。這除了 FA動(dòng)力學(xué)和FA周轉(zhuǎn)之外， 還通過(guò)肌動(dòng)蛋白裝配實(shí)現(xiàn)。RTK以相似的方式利用內(nèi)在的酪氨酸激酶活性磷酸化它們的細(xì)胞內(nèi)環(huán)和/或相關(guān)信號(hào)成分上的部位。這導(dǎo)致銜接蛋白和調(diào)節(jié)磷酸肌醇信號(hào)下游介導(dǎo)物的信號(hào)激酶的募集， 小的GTP酶活化，和MAP激酶級(jí)聯(lián)。GPCR利用異源三聚體G蛋白起始的第二信使歐聯(lián)至相似的信號(hào)機(jī)制，影響肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)行為。細(xì)胞對(duì)外界信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)通過(guò)大量的信號(hào)級(jí)聯(lián)發(fā)生，包括Iih0家族小的GTP 酶(I h0、Rac和cdc4》和它們的激活劑，鳥苷酸交換因子(GEF)，以及下游蛋白質(zhì)激酶效應(yīng)子，包括Mio-激酶/ROCK和p21活化激酶(PAK)。這些級(jí)聯(lián)使調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架行為的蛋白質(zhì)聚集，包括肌動(dòng)蛋白相互作用調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)例如肌動(dòng)蛋白絲切蛋白、Arp2/3、Ena/ VASP、成蛋白、肌動(dòng)蛋白抑制蛋白和凝溶膠蛋白。通過(guò)不同途徑發(fā)信號(hào)可導(dǎo)致不同肌動(dòng)蛋白依賴性結(jié)構(gòu)的形成，它們的協(xié)調(diào)裝配/分解對(duì)于定向細(xì)胞遷移和其它細(xì)胞行為是重要的。 還通過(guò)向肌球蛋白發(fā)信號(hào)調(diào)節(jié)遷移，這涉及前緣肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)并能使細(xì)胞后部收縮。Rho是小的GTP結(jié)合蛋白質(zhì)，其已經(jīng)被證明是髓磷脂衍生的生長(zhǎng)抑制性信號(hào)的中心整合者(McKerracher和Winton，Neuron，36 :345_348，200 。在髓磷脂相關(guān)抑制劑(例如MAG或Nogo-Α)缺乏情況下，據(jù)信因?yàn)镮ih0-GDI-誘導(dǎo)的他0活性的阻抑，發(fā)生神經(jīng)生長(zhǎng)和再生。在一個(gè)非限定性的機(jī)制中，髓磷脂相關(guān)抑制劑(例如MAG和Nogo-Α)結(jié)合NgR，其反過(guò)來(lái)結(jié)合并活化P75?；罨膒75使Iih0-GDI遠(yuǎn)離他0，使得Iih0通過(guò)將⑶P換成GTP而變成活化的。然后活化的GTP結(jié)合的他0與信號(hào)蛋白質(zhì)例如Mio激酶(ROCK)相互作用抑制軸突生長(zhǎng)和再生(綜述于 Kaplan 和 Miller，Nat. Neurosci.，6 :435-436,2003 中)。Rho GTP酶家族蛋白，包括I hoA、Racl和Cdc42，控制廣泛的細(xì)胞過(guò)程，例如細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、增殖、分化和凋亡(Hall，1994 ；Van Aelst and D' Souzalchorey，1997)。Mio相關(guān)的形成卷曲螺旋的蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶(ROCK)家族成員是Ras相關(guān)小 GTP 酶 Rho 的效應(yīng)子。ROCK 家族包括 ρ 160R0CK (R0CK-1)、R0K α /Rho-激酶/ROCK-II、 蛋白激酶PKN以及citron和citron激酶。ROCK涉及多種疾病和病癥，包括高血壓、腦血管痙攣、冠狀血管痙攣、支氣管哮喘、勃起功能障礙、青光眼、血管平滑肌細(xì)胞增殖、心肌肥大、 malignoma、缺血/再灌注引起的損傷、內(nèi)皮功能障礙、克隆病和大腸炎、神經(jīng)突生長(zhǎng)物、雷諾氏病、咽痛、阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟肥大以及血管周纖維化。ROCK的兩種同種型包括ROCKl (其還稱作ROK- β或pl60R0CK)和ROCKII (其還稱作ROK-α或他0-激酶)。兩種同種型具有65%的總體序列相似性，并且激酶結(jié)構(gòu)域包含 92%的序列同一性。雖然兩種同種型在組織中遍在表達(dá)，但是它們?cè)谀承┙M織中強(qiáng)度不同。ROCKl是具有kr/Thr蛋白激酶活性的IihoA結(jié)合蛋白并且長(zhǎng)度為1358個(gè)氨基酸。多肽包括在N-末端的催化激酶結(jié)構(gòu)域，其長(zhǎng)度大約300個(gè)氨基酸并且包含Ser/Thr 激酶特征性的保守性模體；激酶結(jié)構(gòu)域還涉及與ROCK活性負(fù)調(diào)節(jié)物MioE結(jié)合。此外， ROCKl的C-末端具有數(shù)個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，包括易彎曲的卷曲螺旋區(qū)域內(nèi)的他0-結(jié)合結(jié)構(gòu)域、 pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域和半胱氨酸豐富結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，PH結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕ㄟ^(guò)與脂質(zhì)信使例如花生四烯酸的調(diào)節(jié)可能是必需的。當(dāng)ROCK的羧基末端與激酶結(jié)構(gòu)域相互作用時(shí)降低激酶活性，從而證明了 ROCK具有自身抑制活性。長(zhǎng)度大約80個(gè)氨基酸并且對(duì)于與活化的MioA相互作用所需的Mio-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一些Mio結(jié)合蛋白質(zhì)中存在的結(jié)構(gòu)域具有相當(dāng)大的序列相似性。示例性的ROCK抑制劑包括Y-27632和法舒地爾，它們結(jié)合激酶結(jié)構(gòu)域以ATP競(jìng)爭(zhēng)性機(jī)制抑制ROCK的酶活性。ROCK活化的負(fù)調(diào)節(jié)物包括小的GTP結(jié)合蛋白質(zhì)例如Gem、 RhoE和I ad，它們可以減弱ROCK活性。還可以使用H-1152 二鹽酸鹽(H-1152P-2HC1 ； (S) - (+) -2-甲基-1- [ (4-甲基-5-異喹啉)磺酰]高哌嗪)。另外的ROCK抑制劑包括國(guó)際申請(qǐng)公布號(hào)W0 01/56988 ；WO 02/100833 ；WO 03/059913 ；WO 02/076976 ；WO 04/029045 ；WO 03/064397 ；WO 04/039796 ；WO 05/003101 ；WO 02/085909 ；WO 03/082808 ；WO 03/080610 ； WO 04/112719 ；WO 03/062225 ；和WO 03/062227中描述的那些。在這些例子中的一些例子中，抑制劑中的模體包括吲唑核；2-氨基吡啶/嘧啶核；9-脫氮鳥嘌呤衍生物；含苯甲酰胺；含氨基呋咱；和/或其組合。例如，WO 03/080610涉及作為激酶抑制劑例如ROCK抑制劑的咪唑并吡啶衍生物以及用于抑制ROCKl和/或R0CK2效應(yīng)的方法。上面所引用申請(qǐng)的公開通過(guò)參考并入本文。Rho的另一抑制劑是S-法呢基硫代水楊酸(FTQ及其衍生物和類似物。另一抑制劑是包含咪唑的苯二氮革和類似物(見(jiàn)例如WO 97/30992)。Iiho抑制劑還可以通過(guò)與 ROCKO^ho活化激酶)相互作用作用于下游，導(dǎo)致他0抑制。此類抑制劑描述于美國(guó)專利號(hào) 6，642J63中(其公開全文通過(guò)參考并入本文)?？梢允褂玫钠渌麺io抑制劑描述于美國(guó)專利號(hào)6，642，263和6，451，825中。此類抑制劑可以使用常規(guī)細(xì)胞篩選測(cè)定法鑒定，例如描述于美國(guó)專利號(hào)6，620，591(它們?nèi)耐ㄟ^(guò)參考并入本文)中的方法。在本公開的特定實(shí)施方案中，靶向R0CK1，而不是ROCK 2，其中試劑結(jié)合變構(gòu)部位導(dǎo)致抑制ROCKl。由于只有活性形式的Iih0 GTP酶可以通過(guò)結(jié)合特異的效應(yīng)蛋白質(zhì)(對(duì)于Mio信號(hào)傳導(dǎo)途徑為Mio激酶和Diaphanous的哺乳動(dòng)物同系物mDia)而將信號(hào)傳導(dǎo)至下游途徑，所以認(rèn)為它們是時(shí)空性整合肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和分子馬達(dá)成為高等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)特定構(gòu)象的分子開關(guān)(圖1)。雖然已經(jīng)在許多不同細(xì)胞類型中廣泛研究了 Mio家族蛋白質(zhì)對(duì)于多方面生物學(xué)功能的重要作用，但是在本文描述它們對(duì)于干細(xì)胞調(diào)節(jié)的作用的研究。研究表明，他0 GTP酶對(duì)于控制成年皮膚、造血和間質(zhì)干細(xì)胞中的干細(xì)胞功能起著關(guān)鍵的作用。本公開證明，ESC利用他0信號(hào)傳導(dǎo)途徑控制細(xì)胞-細(xì)胞完整性同時(shí)維持多能性。本公開證明，抑制ROCK導(dǎo)致干細(xì)胞(例如人胚胎干細(xì)胞-hESC和誘導(dǎo)的干細(xì)胞) 具有不需要任何包被例如細(xì)胞外基質(zhì)而在塑料培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的能力。此外，本公開證明，抑制肌球蛋白I I的活性還調(diào)節(jié)干細(xì)胞(例如hES和hiPS)生長(zhǎng)和維持多能性的能力(對(duì)于所述途徑的示意圖見(jiàn)例如圖5)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含肌球蛋白II抑制劑的培養(yǎng)基。在另一實(shí)施方案中， 提供包含ROCK抑制劑、肌球蛋白II抑制劑或其組合的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基用于在飼養(yǎng)層或細(xì)胞外基質(zhì)包被組織培養(yǎng)材料缺乏下培養(yǎng)干細(xì)胞，包括hESC和hiPS細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基用于在聚-D-賴氨酸包被的組織培養(yǎng)材料上培養(yǎng)干細(xì)胞。在又一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基除了包含ROCK抑制劑、肌球蛋白II抑制劑或其組合外還包含其它成分。例如，培養(yǎng)基可包含氨基酸(例如非必需氨基酸)、抗生素、殺真菌劑、生長(zhǎng)因子、LIF、含硫生物活性化合物(例如β-巰基乙醇)、丙酮酸鹽(例如丙酮酸鈉)、血清 (例如人血清、牛血清)及其任意組合。優(yōu)選地，任何另外的試劑可以來(lái)自與待培養(yǎng)干細(xì)胞相同的物種，或者可以化學(xué)性合成。在仍然進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件缺乏任何動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)物。本公開部分地基于生物學(xué)試劑可以用于促進(jìn)在缺乏動(dòng)物來(lái)源產(chǎn)物情況下培養(yǎng)的干細(xì)胞的增殖和強(qiáng)壯的發(fā)現(xiàn)。此外，本公開基于本公開的生物學(xué)試劑還促進(jìn)在飼養(yǎng)層缺乏下的干細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)、復(fù)制和強(qiáng)壯的發(fā)現(xiàn)。培養(yǎng)基可以是基本上無(wú)血清的，并且不需要使用飼養(yǎng)細(xì)胞層或者來(lái)自分開培養(yǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，雖然在一些實(shí)施方案中，其可以用于在對(duì)于連續(xù)傳代(例如1-50代或更多代)的將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新鮮的、無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)基之前的包括異基因飼養(yǎng)細(xì)胞(或者來(lái)自此類細(xì)胞的條件培養(yǎng)基)的生長(zhǎng)環(huán)境中最初培養(yǎng)干細(xì)胞。根據(jù)本公開的培養(yǎng)基包含肌球蛋白II抑制劑、ROCK抑制劑或其組合。培養(yǎng)基還可包括但不限于非必需氨基酸、抗氧化劑、還原劑、生長(zhǎng)因子和丙酮酸鹽?；A(chǔ)培養(yǎng)基可以是例如Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、DMEM/F_12或K0-DMEM，每一種添加有L-谷氨酰胺(例如包括二肽L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Invitrogen))、非必需氨基酸和β -巰基乙醇。培養(yǎng)基有代表性地在加入至細(xì)胞培養(yǎng)物中之前已經(jīng)滅菌(例如通過(guò)過(guò)濾)。培養(yǎng)基還可以補(bǔ)加有抗生素和殺真菌劑。示例性的肌球蛋白II抑制劑包括肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑(同義詞1-苯基-1，2，3，4-四氫-4-羥基吡咯并[2. 3-b]-7-甲基喹啉_4_酮；C18H16N2O2)和具有通式I
的類似物
1權(quán)利要求
1.組合物，包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和肌球蛋白II抑制劑。
2.權(quán)利要求1的組合物，還包含結(jié)合并抑制RHO的激酶結(jié)構(gòu)域的ROCK抑制劑。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中肌球蛋白II抑制劑是肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或其類似物。
4.權(quán)利要求1的組合物，還包含血清。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中血清與待培養(yǎng)的細(xì)胞是異體的。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中血清與待培養(yǎng)的細(xì)胞是自體的。
7.權(quán)利要求1的組合物，還包含氨基酸。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中氨基酸是非必需氨基酸。
9.權(quán)利要求1的組合物，還包含還原劑。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中還原劑是β-巰基乙醇。
11.權(quán)利要求1的組合物，還包含抗生素和/或殺真菌劑。
12.權(quán)利要求1的組合物，還包含丙酮酸鹽。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中丙酮酸鹽是丙酮酸鈉或丙酮酸鉀。
14.權(quán)利要求1的組合物，還包含LIF。
15.權(quán)利要求1的組合物，還包含L-谷氨酰胺。
16.組合物，包含補(bǔ)加有非必需氨基酸、抗氧化劑、還原劑、生長(zhǎng)因子、丙酮酸鹽和肌球蛋白II抑制劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基是DMEM。
18.試劑盒，包含聚-D-賴氨酸、確定成分培養(yǎng)基和肌球蛋白II抑制劑。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，還包含組織培養(yǎng)基底。
20.權(quán)利要求18的試劑盒，還包含含有生長(zhǎng)因子的添加物。
21.權(quán)利要求18的試劑盒，其中確定成分培養(yǎng)基是無(wú)血清的并且包含重組bFGF、重組 TGF β，具有大約330-350m0sm的容量克分子滲透壓濃度和7. 25至7. 45的pH。
22.權(quán)利要求18的試劑盒，其中肌球蛋白II抑制劑是肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或其類似物。
23.培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，包括將干細(xì)胞懸浮于包含肌球蛋白II抑制劑的培養(yǎng)基中；和在聚-D-賴氨酸包被的組織培養(yǎng)基底存在下培養(yǎng)干細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的方法，其中培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基。
25.權(quán)利要求對(duì)的方法，其中確定成分培養(yǎng)基是無(wú)血清的。
26.權(quán)利要求25的方法，還包含重組bFGF、重組TGFβ、大約330-350m0sm的容量克分子滲透壓濃度和7. 25至7. 45的pH。
27.干細(xì)胞培養(yǎng)物，包含在權(quán)利要求1的組合物中的干細(xì)胞。
28.權(quán)利要求23的干細(xì)胞培養(yǎng)物，其中干細(xì)胞在聚-D-賴氨酸存在下培養(yǎng)。
29.權(quán)利要求27的干細(xì)胞培養(yǎng)物，其中肌球蛋白II抑制劑是肌球蛋白II馬達(dá)活性抑制劑或其類似物。
30.試劑盒，包含權(quán)利要求1或16的組合物。
31.試劑盒，包含區(qū)室化的肌球蛋白II抑制劑，所述區(qū)室化的肌球蛋白II抑制劑將添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基或者確定成分培養(yǎng)基中。
32.培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，包括在飼養(yǎng)層缺乏情況下將干細(xì)胞與權(quán)利要求1或16的組合物接觸，其中干細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。
33.組合物，包含含有重組bFGF、重組TGFii的確定成分培養(yǎng)基，其中組合物是無(wú)血清的并且包含肌球蛋白II抑制劑。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中確定成分培養(yǎng)基具有大約330-350m0sm的容量克分子滲透壓濃度和7. 25至7. 45的pH。
35.在包含聚-D-賴氨酸基底的無(wú)動(dòng)物培養(yǎng)基中和促進(jìn)干細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，其中培養(yǎng)基包含無(wú)動(dòng)物成分和肌球蛋白II抑制劑、ROCK抑制劑或其組合。
全文摘要
本公開提供用于培養(yǎng)干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞的方法和組合物。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102395672SQ201080016516
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者佐藤升 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)