擴增富含gc的dna模板的方法

專利名稱：擴增富含gc的dna模板的方法
擴增富含GC的DNA模板的方法本發(fā)明在DNA合成的領(lǐng)域中，具體地涉及牽涉富含GC的模板和產(chǎn)物的合成。從第一次分離DNA聚合酶并確定可以在體外合成DNA的條件起，DNA合成反應已經(jīng)廣泛用于生物技術(shù)、醫(yī)學、和研究應用中的制備和分析目的。聚合酶鏈式反應或PCR是一類可以快速且指數(shù)性擴增DNA序列的DNA合成反應。與其它循環(huán)的合成反應一樣，它牽涉以循環(huán)方式重復復制目標序列。PCR的典型的執(zhí)行牽涉提供與期望的序列的末端互補的引物、合適的緩沖液、鎂鹽、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、和嗜熱性DNA聚合酶。將在例如基因組 DNA樣品內(nèi)含有的模板或目標DNA暴露于水溶液中的這些組分。經(jīng)由不同溫度的步驟來使混合物循環(huán)，所述溫度促進模板的變性、引物與模板的退火、然后通過聚合酶延伸引物，產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。因為每輪循環(huán)的產(chǎn)物可用作后續(xù)反應中的模板，產(chǎn)物的量大致以指數(shù)增加， 直至耗盡其它反應組分(最初過量存在)。參見例如美國專利4，683，202 ；M. J. McPherson 和 S. G. Moller, PCR :The Basics (第 2 版，Taylor 和 Francis) (2006)。PCR及循環(huán)核酸合成反應的其它形式是在分子生物學、生物技術(shù)中以及日益在醫(yī)學中的一項標準工具。PCR及相關(guān)技術(shù)的關(guān)鍵優(yōu)點是快速、低成本、靈敏性、對高通量分析的適應性、和通用性。擴增僅需要幾小時或更少，小的個別反應可能花費價值完全不到1美元的試劑，所需要的模板量通常在毫微克范圍中，自動化可以導致每臺自動儀器每天運行數(shù)千次反應，并且引物可以設計為擴增幾乎任何序列。對分析和制備應用兩者廣泛采用PCR及相關(guān)技術(shù)。PCR的典型制備應用是擴增序列，使得它可以在異源載體中克隆。此應用的特殊化變型是誘變PCR，其中有意降低反應的保真性以生成含有突變的目標序列的拷貝。然后，可以在下游研究或?qū)嶒炛惺褂每寺〉耐蛔凅w拷貝。誘變PCR可以通過使用有偏向的dNTP集合來實現(xiàn)，其中dATP、dCTP、 dGTP、和dTTP不以等摩爾比率存在。這可以提高PCR循環(huán)的延伸步驟期間摻入錯配的頻率，產(chǎn)生突變體產(chǎn)物。參見例如PCR Methods增刊2 :28-33(1992) ；Anal Biochem 224 347-353(1995)。雖然已經(jīng)在上文所描述的有意地易錯PCR中使用不平衡的dNTP集合，但是此類不平衡的誘變效果在其它應用中得不到贊同。誘變一般在分析應用中以及在突變體產(chǎn)物不是目標的制備應用中是不利的。實際上，突變體產(chǎn)物一般不合需要已經(jīng)激發(fā)通過修飾聚合酶或其它反應組分來表征和提高反應諸如PCR的保真性的努力。參見例如Nucleic Acids Research, 24 :3546-3551 (1996)；美國專利 7，030，220 ；美國專利 6，881，559。此外，預期與不平衡的dNTP集合有關(guān)的錯誤率增加會限制反應產(chǎn)率，這是因為錯配降低DNA聚合酶的持續(xù)合成能力(processivity)和摻入率兩者。PCR的顯著的分析應用是在診斷疾病或確定涉及具有大小多態(tài)性的遺傳基因座的基因型。展現(xiàn)出醫(yī)學相關(guān)大小多態(tài)性的基因座的例子是X染色體上的人FMRl基因的5’非翻譯區(qū)(UTR)。正常的個體在此區(qū)域中通常具有5-44個CGG重復。相反，含有200至2000 或更多個CGG重復的此基因座的等位基因指示脆性X綜合征(Fragile X syndrome,FXS) 0 此類等位基因稱為全突變等位基因。這些等位基因是遺傳不穩(wěn)定的?；加蠪XS的個體可以
4具有諸如共濟失調(diào)、卵巢功能早衰、學習無能、和其它認知/行為狀況(包括孤獨癥樣癥狀) 等綜合征的多種組合。PCR通用性的一個不幸例外是，難以長期擴增高度富含GC的序列，包括FMRl 5’UTR的全突變等位基因。優(yōu)化FMRl PCR的嘗試已經(jīng)包括對常規(guī)的PCR測定條件的修飾。參見 Genome Res. 1996 年 7 月；6 (7) :633-8 ；Nucleic Acids Res. 1997 年 10 月 1 日；25 (19) 3957-8 J. Mol. Diagn. 2006 年 11 月 1 日 8 :544-550 ；Am J Med Genet. 1994 年 7 月 15 日； 51(4) :527-34。然而，F(xiàn)MRl PCR測定法開發(fā)超過15年后，近至2008年(Genet Med. 2008 年10月；10(10) :714-9)，一項檢測新生兒中的脆性X的發(fā)表的試驗性篩選研究報告了，“測定女性中的FMRl重復數(shù)目的內(nèi)部確認方法中使用的定量聚合酶鏈式反應(PCR)分析的兩種方法...不能產(chǎn)生可靠的且可再現(xiàn)的結(jié)果，，，以及此外“來自第一或二級分離物的第二次 [PCR]失敗高度提示了異常的FMRl CGG重復大小”(添加的重點)。如此，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍將全突變脆性X等位基因的可再現(xiàn)PCR擴增視為未解決的問題。據(jù)報道，用PCR能精確評估的三聯(lián)體重復的長度最多為約100個CGG重復，遠低于全突變等位基因(Full Mutation alleles)的大小。此外，自約100個重復開始，對任何條帶的檢測變得越來越模糊。J Mol Diagn 7:605-12 2005)。此項困難，與FXS綜合征的異質(zhì)性質(zhì)一起，導致應用諸如Southern印跡等方法來檢測全突變等位基因。同前。Southern 印跡比PCR更費時且昂貴，而且很不適應于高通量執(zhí)行。本發(fā)明部分基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即提供有偏向的dNTP集合，導致在DNA聚合酶對富含GC之模板的持續(xù)合成能力方面，比本領(lǐng)域已知方法有顯著改善。在一些實施方案中，本申請?zhí)峁┝颂岣咭环N或多種DNA聚合酶在至少一種富含GC 的DNA模板上的持續(xù)合成能力的方法，該方法包括在包含GC/AT比率大于1的dNTP的水溶液中進行DNA擴增反應。在其它實施方案中，本申請?zhí)峁┝税ㄍㄟ^在水溶液中進行PCR，來擴增富含GC 的模板的方法，所述水溶液包含(a)GC/AT比率2-10且總濃度0. 7-0. 9mM的dNTP ； (b)至少一種增強劑，選自甜菜堿、DMS0、和TWEEN-20 ；和(c)總濃度1. 5_2mM的鎂；其中至少一種富含GC的模板包含F(xiàn)MRl的5’ UTR的CGG重復。而在其它實施方案中，本申請?zhí)峁┝藱z測與富含GC型三核苷酸重復病癥諸如脆性X綜合征、脆性X相關(guān)震顫共濟失調(diào)綜合征(Fragile X-associated tremor ataxia syndrome)、和/或脆性X相關(guān)原發(fā)性卵巢功能不全(Fragile X-associated primary ovarian insufficiency)有關(guān)的基因型的方法，包括對至少一種與富含GC的DNA模板進行DNA擴增反應，其中通過提供包含GC/AT比率大于1的dNTP的水溶液來提高一種或多種 DNA聚合酶的持續(xù)合成能力。附圖簡述

圖1是經(jīng)STOR-金染色的凝膠的照片。第4道和第四道是大小標志物，所選條帶的大小在第四道的右側(cè)標示。所有PCR反應使用含有多個等位基因的多個模板的混合物， 它們在FMRl 5’ UTR中有20、28-29、118、198、和約330個CGG重復。第1道-第3道和第 5道-第觀道顯示了用多個水平的GC/AT比率、甜菜堿濃度、和總dNTP濃度進行的反應的產(chǎn)物。圖2是經(jīng)STOR-金染色的凝膠的照片。第1道和第20道是大小標志物，所選條帶的大小在第1道的左側(cè)標示。第2道含有使用GC/AT比率1 1的dNTP進行PCR反應的產(chǎn)物。第3道-第18道顯示了用逐漸偏向于增加G和C的GC/AT比率的dNTP進行PCR反應的產(chǎn)物。第19道含有使用GC/AT比率1 1的dNTP進行無模板對照PCR反應的產(chǎn)物。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在水溶液中合成DNA的方法，其中模板具有高水平的GC豐度，并且 dNTP以大于1的GC/AT比率提供。更具體地，本發(fā)明涉及通過改變反應中的dNTP的GC/AT 比率來改善聚合酶持續(xù)合成能力。本發(fā)明的方法特別與合成反應諸如PCR有關(guān)，所述合成反應可以在牽涉可以是高度富含GC的基因座，諸如接近脆性X綜合征相關(guān)FMRl基因的基因座的診斷應用中使用?！霸鰪妱敝父纳艱NA聚合酶和/或DNA合成反應的一個或多個方面的性能，諸如持續(xù)合成能力的化學品或組合物。"GC/AT比率”意為給定溶液或混合物中的dCTP、dGTP、及其所有核苷酸類似物的總和的濃度與dATP、dTTP、dUTP、及其所有核苷酸類似物的總和的濃度的比率?！癲NTP”代表三磷酸脫氧核苷酸，并且指dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、及其類似物。“核苷酸類似物”指包含與天然堿基腺嘌呤㈧、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶 (T)、或尿嘧啶(U)不同的堿基模塊、與脫氧核糖相同或相似的糖模塊、和至少一個磷酸根或多個磷酸根(例如，二磷酸根或三磷酸根)模板的分子或離子。核苷酸類似物是特定核苷酸，具體地dATP、dCTP、dGTP、dTTP、或dUTP的類似物，此時它包含三磷酸根和糖模塊(這兩者的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型適合于通過聚合酶摻入核酸雙螺旋中)和堿基，其在核酸雙螺旋和通過 DNA聚合酶在核酸雙螺旋中摻入的基因座中的堿基配對特性與5種先前所列的核苷酸之一最相似，只是dTTP的類似物一般也會是dUTP的類似物，并且反之亦然。與包括但不限于“核苷”、“堿基”、“核堿基”、或“殘基”等術(shù)語結(jié)合使用的術(shù)語“類似物”應當以與其結(jié)合“核苷酸”使用時相同的方式解釋?！癙CR”是一種DNA合成反應，其中反應混合物進行至少兩輪完整的反應循環(huán)，每輪反應循環(huán)包括變性期和至少一個退火和/或延伸期，結(jié)果是如果至少在初始循環(huán)中成功合成核酸模板的拷貝，并且至少在后來的循環(huán)中合成拷貝的拷貝，那么一般導致模板的幾何級擴增?！癉NA”指脫氧核糖核酸，即一般由磷酸二酯鍵連接的主要為脫氧核糖核苷酸殘基的生物聚合鏈?！疤鸩藟A”指N，N, N-三甲基甘氨酸?！疤鸩藟A類似物”指具有不攜帶氫原子的帶正電荷的陽離子官能團，例如銨離子或磷離子，及具有可以不接近陽離子位置的帶負電荷的官能團諸如羧酸根基團的任何中性化學化合物。本發(fā)明可以涉及具有小于或等于600Da ；小于或等于300Da ；75和600Da之間； 或75和300Da之間的分子量的甜菜堿類似物的使用。另外/或者，本發(fā)明可以涉及包含銨模塊和/或羧酸根模塊的甜菜堿類似物的使用?！癟m”是給定溶液中的50% (按質(zhì)量計)的給定DNA樣品或引物-模板復合物是單鏈，而50% (按質(zhì)量計)是雙鏈的溫度。“TWEEN-20”是聚乙二醇山梨聚糖單月桂酸酯，即以CAS號9005_64_5指派的化學
O
“GC豐度”是核酸中作為鳥嘌呤殘基、胞嘧啶殘基、或其類似物的總核堿基殘基的分數(shù)或百分比。例如，含有精確地30個胞嘧啶、精確地30個鳥嘌呤、精確地1個胞嘧啶類似物、和精確地1個鳥嘌呤類似物的IOOnt核酸具有62%的GC豐度。在一些實施方案中， 富含GC 的模板可以含有至少 51、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、或99. 5%鳥嘌呤殘基、胞嘧啶殘基、或其類似物。“持續(xù)合成能力(processivity)，，是DNA聚合酶在給定反應中合成完整拷貝的模板的能力。持續(xù)合成能力升高可以導致產(chǎn)物產(chǎn)率升高和/或產(chǎn)物大小增加，后一種對于牽涉持續(xù)合成能力水平較低導致完整拷貝的低水平合成的模板的反應是特別相關(guān)的。A. DNA 模板DNA模板是作為由DNA聚合酶催化的反應中的合成靶物的存在于樣品中的DNA 序列。DNA模板的GC豐度可以大于或等于60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、或 99. 5% C和G殘基。DNA模板可以包含含有C和G殘基的二、三、或四核苷酸重復。DNA模板可以在疾病相關(guān)基因座內(nèi)或附近。DNA模板可以至少包含F(xiàn)MRl基因的5’UTR的一部分。 DNA模板可以包含F(xiàn)MRl基因的5，UTR的CGG重復。DNA模板的大小可以是約50、100、200、 300、500、或 700bp、或 1,1. 5、2、2· 5、3、4、5、7、或 IOkb0 DNA 模板的大小可以是 50bp_10kb、 100bp-10kb、200bp-10kb、300bp-10kb、500bp-10kb、700bp-10kb、lkb-10kb、l. 5bp_10kb、 2bp-10kb、3bp-10kb、50bp-7kb、50bp-5kb、50bp-4kb、50bp-3kb、50bp-2kb、50bp-l.5kb、 100bp-7kb、200bp-5kb、或 300bp_4kb。B. dNTP的GC/AT比率和濃度本發(fā)明涉及如下的方法，包括提供GC/AT比率大于1且有助于使用富含GC的模板來合成DNA的總dNTP濃度的dNTP。GC/AT比率可以是約1. 1、1. 2、1. 4、1. 6、2、2. 5、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、或更高。GC/AT 比率可以是 1. 1-20, 1. 1-15,1. 1-10,1. 1-8,1-15,1.1-7,1.1-6,1. 1-5,1. 2-25,1. 4-25,1.6-25、2_25、3_25、 4-25、5-25、2-15、2· 5-10,或 4-10?？?dNTP 濃度可以是約 0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、 1,1. 2,1. 5、2、或 3mM。dNTP 濃度可以是 0. 4_3mM、0· 5_3mM、0· 6_3mM、0· 7_3mM、0· 8_3mM、 0. 9-3mM、l-3mM、0. 4_2mM、0. 4-1. 5mM、0. 4-1. 2mM、0. 4_lmM、0. 4-0. 9mM、0. 4-0. 8mM、 0. 4-0. 7mM、0. 5-2mM、0. 5_lmM、或 0. 6-0. 9mM。C.持續(xù)合成能力、產(chǎn)率和產(chǎn)物大小在一些實施方案中，相對于本領(lǐng)域中已知的方法，本發(fā)明提供了給定聚合酶在給定的富含GC的模板的情況中的改善的持續(xù)合成能力。經(jīng)由包括提供GC/AT比率大于1的 dNTP的步驟來獲得改善。與本領(lǐng)域中已知的方法相比，改善的程度可以使得改善的反應可以能夠生成包含約 25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000 或更多個 CGG重復的可檢測產(chǎn)物。D. DNA 聚合酶本發(fā)明涉及如下的方法，包括提供至少一種DNA聚合酶以便以模板依賴性方式自dNTP合成DNA。DNA聚合酶可以包含野生型、經(jīng)修飾的、嗜熱性、嵌合的、經(jīng)工程化改造的聚合酶、和/或超過一種聚合酶的混合物。DNA聚合酶可以包含精確聚合酶(5PRIME GmbH)、AccuSure DNA 聚合酶(Bioline)、Phusion AccuPrime Pfx(Invitrogen)、 Platinum Taq DNA聚合酶高保真性(Invitrogen)、Phire 熱啟動DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)、Phusiona 熱啟動高保真性 DNA 聚合酶(New England Biolabs)、JumpStart REDTaq DNA 聚合酶(Sigma-Aldrich)、PfuUltra 熱啟動 DNA 聚合酶(Stratagene)、 PfuTurbo Cx 熱啟動 DNA 聚合酶(Stratagene)、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(Takara)、 Extensor Hi-保真性 PCR 酶(ABgene)、ACCUZYME DNA 聚合酶(Bioline)、SAHARA DNA 聚合酶(Bioline)、VELOCITY DNA 聚合酶(Bioline)、GeneChoice AccuPOL DNA 聚合酶(GeneChoice，Inc.)、GeneChoice UniPOL DNA 聚合酶(GeneChoice，he·)、延長酶酶混合物(Invitrogen)、Pfx50 DNA 聚合酶(Invitrogen)、Phusion DNA 聚合酶(New England Biolabs)、KOD HiFi DNA 聚合酶(Novagen)、KOD XL DNA 聚合酶(Novagen)、 Expand 20kb PLUS熱穩(wěn)定性DNA聚合酶混合物(Roche Applied Science)、延伸高保真性PLUS熱穩(wěn)定性DNA聚合酶混合物(Roche Applied Science)、延伸高保真性熱穩(wěn)定性DNA聚合酶混合物(Roche Applied Science)、延伸長模板熱穩(wěn)定性DNA聚合酶混合物(Roche Applied Science)、Easy-A 高保真性 PCR 克隆酶(Stratagene)、EXL DNA 聚合酶(Stratagene)、Herculase 增強型 DNA 聚合酶(Stratagene)、Herculase Π 融合 DNA 聚合酶(Stratagene)、Kapa LongRange DNA 聚合酶(Kapa Biosystems)、Kapa HiFi DNA 聚合酶(Kapa Biosystems)、Kapa2G 魯棒性 DNA 聚合酶(Kapa Biosystems)、 Kapa2G 魯棒性熱啟動DNA聚合酶(Kapa Biosystems)、Kapa2G 快速DNA聚合酶(Kapa Biosystems)、Kapa2G 快速熱啟動 DNA 聚合酶(Kapa Biosystems)、LA TAQ DNA 聚合酶 (Takara) >Optimase DNA聚合醇(Transgenomic, Inc.)、夕卜一Pfu DNA聚合醇(Stratagene)、 HotMaster Taq DNA 聚合酶(5PRIME GmbH)、HotTaq DNA 聚合酶(Abnova Corporation)、 AmpliTaqGold DNA聚合酶(Applied Biosystems)、Bst DNA聚合酶Lg Frag (New England Biolabs)、MasterAmp Tfl DNA 聚合酶(EPICENTRE Biotechnologies)、紅熱 DNA 聚合酶 (ABgene)、Thermoprime Plus DNA 聚合酶(ABgene) Jaq-紅 DNA 聚合酶(AppliChem GmbH)、 BI0-X-ACT 長 DNA 聚合酶(Bioline)、BI0-X-ACT 短 DNA 聚合酶(Bioline)、Bioline HybriPol DNA 聚合酶(Bioline)、BioTherm Taq DNA 聚合酶(eEnzyme LLC)、EU-Taq DNA 聚合酶(eEnzyme LLC)、Synergy Taq DNA 聚合酶(eEnzyme LLC)、GeneChoice RedPOL DNA聚合酶(GeneChoice，Inc.)、AccuPrime GC-Rich DNA聚合酶(Invitrogen)、 PyroPhage 3173DNA 聚合酶、Exo Minus(Lucigen)、9Degrees North (Modified) DNA 聚合 Sl (New England Biolabs)、Therminator DNA(New England Biolabs)、Pwo DNA
聚合酶(Roche Applied Science)、Paq5000 DNA 聚合酶(Stratagene)、YieldAce DNA 聚合酶(Stratagene)、e2TAK DNA 聚合酶(Takara)、或來自 P. kodakaraensis、激烈火球菌(P. furiosus)、Τ. gorgonarius、Τ. zilligii、附岸熱球菌(Τ. litoralis) "VentTM，，、 P. GB-D "Deep Vent，，、Τ. 9N-7、T. aggregans、T. barossii、T. fumicolans、T. celer、火球菌菌株 ST700> Τ. pacificus> P. abysii、T. profundus> T. siculi、T. hydrothermalis> 熱球菌(Thermococcus sp.)菌株 GE8、Τ. thioreducens、P. horikoshii 或 Τ. onnurineus ΝΑΙ、熱球菌9 ° Ν-7、熱球菌GI-J、熱球菌MAR-13、vGB_C、熱球菌GI-H、水生棲熱菌 (Thermus aquaticus) >^|if (Thermus thermophilus) > Thermus caldophilus、絲狀棲熱菌(Thermus filiformis)、黃棲熱菌(Thermus flavus)、海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、或熱堅芽孢桿菌 (Bacillus caldotenax)的天然存在的DNA聚合酶。
E.核酸擴增，PCR本發(fā)明涉及擴增核酸的反應。擴增反應的例子包括但不限于PCR、NASBA(基于核酸序列的擴增)、SDA(鏈置換擴增)、LAMP(環(huán)介導的等位擴增)、和RCA(滾環(huán)擴增)。參見例如美國專利 4，683，202 (PCR)；美國專利 6，326，173 和 Journal of Virological Methods 151 :283-293(2008) (NASBA)；美國專利 5，648，211 (SDA)；美國專利 6，410，278 (LAMP)；和美國專利6，觀7，824(RCA)。通過提及而將所有前述文獻收入本文。熟練技術(shù)人員應當了解何種試劑適合于提供。這些方法之每種牽涉DNA合成，并且因此牽涉在有助于DNA聚合和存在模板的溶液中使用DNA聚合酶、核苷酸、和二價陽離子(以鹽形式提供)，特別是鎂。該方法就提供額外的催化活性、使用熱循環(huán)或等溫溫育、及引物的使用和結(jié)構(gòu)而言有所變化。 通常還提供合適pH諸如7-8、6. 5-8. 5、6-9、或約7. 4或7. 5的緩沖液。在PCR中，提供一對引物，其在相反鏈上的目標區(qū)域的每個末端結(jié)合，使得它們各自引發(fā)朝向另一引物的合成。反應是熱循環(huán)的，從而在高溫步驟中驅(qū)動底物變性、在較低溫度步驟使引物退火、及在可以但是不必比退火步驟的溫度高的溫度延伸。因為一輪循環(huán)的產(chǎn)物可以充當下一輪循環(huán)中的模板而發(fā)生擴增。在NASBA中，在DNA聚合酶外，還提供RNA聚合酶(RNAP)，所述DNA聚合酶也可以是逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)(例如，一種可以使用RNA或DNA模板來催化DNA合成的酶)。提供如下的引物，其與那些在PCR中使用的引物相似，只是至少一條引物另外包含由RNAP識別的啟動子序列。如此，RT的產(chǎn)物充當RNAP的模板，所述RNAP合成充當RT模板的RNA，導致擴增。 在NASBA的一些形式中，提供RNA酶H以在通過RT合成RNA-DNA雜合物后生成單鏈DNA。 在沒有重復的熱變性的情況中經(jīng)由RT和RNAP的組合作用來發(fā)生擴增。SDA是一種以等溫且異步的方式擴增DNA的技術(shù)，這意味著不使用循環(huán)熱變性來分離鏈；取而代之，經(jīng)由自身DNA合成來發(fā)生鏈置換，其中3’ OH的延伸引起下游鏈的置換。 最初通過外部引物，隨后通過產(chǎn)生切口反應來提供3’ 0H。提供兩對引物。一個“內(nèi)部”對在擴增子周圍結(jié)合，而且另外包含含有限制性位點的5’瓣(flap)。另一“外部”對位于遠端，即距目標區(qū)域更遠。內(nèi)部引物可以結(jié)合模板，得到延伸，然后通過從相應的外部引物合成來置換。隨后，通過例如第二條鏈合成來使置換的DNA成為雙鏈。下一步是切割雙鏈分子的一條鏈，這可以通過使用經(jīng)修飾的核苷酸和限制性位點來完成，其中通過經(jīng)修飾的核苷酸在一條鏈(而不是另一條)上使切割位點失活。與此位點對應的限制酶在反應中提供， 并產(chǎn)生切口。然后，通過DNA聚合酶來延伸在所得的切口處的3’ 0H，置換一條鏈(其可以再次充當模板O，并且再生的雙鏈分子再次是產(chǎn)生切口的底物，接著為延伸和置換，導致擴增。重復的熱變性不是必要的。1注意由于產(chǎn)生切口，一些被置換的鏈最初不會是全長，而是會缺乏內(nèi)部引物瓣 (flap)的遠端部分的互補鏈。這不損害引物結(jié)合(回想引物的非瓣部分具有足以穩(wěn)定地進行退火的長度)，并且在引物結(jié)合后，生成5’突出端，使聚合酶能夠進行填充)。LAMP是一種設計為高度特異性的擴增方法，即它可以區(qū)別僅相差單核苷酸多態(tài)性 (SNP)的模板，因為一個等位基因是擴增的底物，而另一個不是。它也是等溫的。與在SDA 中一樣，提供兩對引物，即內(nèi)部的和外部的；內(nèi)部引物也具有5’瓣。然而，在LAMP中，每個內(nèi)部引物的5’瓣含有與其結(jié)合的模板鏈內(nèi)的在與引物的3’部分結(jié)合的位點內(nèi)部的序列匹配的序列。例如，若引物與模板分子的(+)鏈(其含有下游序列A)退火，則引物瓣也可以
9含有序列A。值得注意地，要通過此反應區(qū)別的SNP基因座位于以瓣為界的區(qū)域的邊緣，其對應于瓣的5’端的最后一個堿基。反向內(nèi)部引物瓣的5’端的最后一個堿基也對應于SNP 基因座。與在SDA中一樣，延伸內(nèi)部引物，然后通過延伸外部引物來置換。在這發(fā)生時，5’ 瓣通過結(jié)合其互補物(其現(xiàn)在是同一分子的一部分；繼續(xù)上述例子，置換鏈含有序列A的反向互補物，稱作序列T，并且瓣中的序列A在分子內(nèi)結(jié)合序列T)而形成環(huán)。反向內(nèi)部引物與在其3’端(其對應于反向外部引物)內(nèi)部的環(huán)形置換鏈退火，并引發(fā)合成，這置換環(huán)，并形成部分雙鏈的、部分單鏈的DNA。然后，反向外部引物與單鏈部分退火，并引發(fā)合成，引起鏈置換?，F(xiàn)在，置換鏈可以形成環(huán)，其中其3’端與分子的內(nèi)部部分配對。若僅SNP基因座與 3’端(其源自外源供應的內(nèi)部引物瓣)匹配，則發(fā)生延伸。上文所引用的參考文獻中所描述的進一步的引物退火、環(huán)化、和延伸/置換事件導致具有與引物瓣匹配的SNP等位基因的模板的選擇性擴增。在RCA中，使用環(huán)形DNA模板。引物與環(huán)退火，并繼續(xù)延伸，其中聚合酶在其行進時置換先前旋轉(zhuǎn)過程中合成的DNA。此反應以線性動力學進行，并且生成長的、連環(huán)化的產(chǎn)物。在雙引發(fā)RCA中，提供第二引物，其與上述反應的連環(huán)化產(chǎn)物退火。此型式的反應容許使用產(chǎn)物作為模板，因此導致指數(shù)動力學。與在其它等溫反應中一樣，使產(chǎn)物適合于在雙引發(fā)RCA中與引物退火，其經(jīng)由由上游引物的延伸所致的鏈置換進行；在此情況中，引物結(jié)合模板鏈中上游更遠的其它多聯(lián)體。例如，本發(fā)明的一個實施方案是通過以GC/AT比率大于1提供dNTP的PCR來擴增富含GC的模板DNA。在循環(huán)擴增反應諸如例如PCR中，反應循環(huán)的數(shù)目可以是20-40，例如約20、25、30、35、或40輪循環(huán)。另外，本發(fā)明涉及其它擴增反應，其中在以GC/AT比率大于 1提供dNTP的反應中擴增富含GC的模板；反應可以例如是NASBA、SDA、LAMP、或RCA。F. PCR 引物本發(fā)明涉及包括提供正向和反向引物的方法。引物可以設計為與模板序列的每個末端的約15-30、15-25、15-20、20-30、或20-25個核苷酸退火。引物可以與在FMRl 5’ UTR中的CGG重復區(qū)側(cè)翼的序列退火。此類正向引物的例子包括 CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C (SEQ ID NO 1), CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG GTT T (SEQ ID NO: 2)，CAG TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC G(SEQ ID NO :3)，TCC GGT GGA GGG CCG CCT CTG AGC(SEQ ID NO :4)，GGT TCG GCC TCA GTC AGG CGC TCA GCT CCG TTT CG(SEQ ID NO :5)，GGG TTC GGC CTC AGT CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG(SEQ ID NO :6)， GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC AGT CA(SEQ ID NO :7)，CAG CGG GCC GGG GGT TCG GCC TCA G(SEQ ID NO :8)，GCA GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC A(SEQ ID NO :9)，GGG CCG GGG GTT CGG CCT CAG TCA G (SEQ ID NO :10)，GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CA (SEQ ID NO 11)，GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CAG (SEQ ID NO : 12)，GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACT TCC(SEQ ID NO 13),TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A (SEQ ID NO 14)，CAC TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GA (SEQ ID NO: 15)，和 TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C(SEQ ID NO :16)。此類反向引物的例子包括CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC A (SEQ ID NO :17)，GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG(SEQ ID NO :18)，GGG AGC CCG CCC CCG AGA GGT(SEQ ID NO 19),CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC AT (SEQ ID NO :20)，CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG(SEQ ID NO :21),CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT (SEQ IDNO 22)，CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG(SEQ ID NO 23)，CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG (SEQ ID NO: 24)，GCG CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT(SEQ ID NO 25),CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG T (SEQ ID NO :26)，GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC A (SEQ ID NO :27)，GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC A (SEQ ID NO :28)，AGC GCC ATT GGA GCC CCG CAC TTC C (SEQ ID NO :29)，CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA C (SEQ ID NO 30),TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC A (SEQ ID NO :31)，AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT C (SEQ ID NO :3 ，GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC T(SEQ ID NO 33),CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA G(SEQ ID NO :34)，CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT CCA TCT (SEQ ID NO 35), TAG AAA GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC (SEQ ID NO: 36)，和 AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CC (SEQ ID NO :37)。G.增強劑在一些實施方案中，可以提供增強劑。增強劑促成生成富含GC的產(chǎn)物的反應的成功。一般可以在PCR反應中包括多種增強劑以提高產(chǎn)率、特異性、和一致性，而且可以通過降低模板DNA的Tm來運行。增強劑可以經(jīng)由螺旋去穩(wěn)定化、中和反應抑制劑、或其它機制 (包括未知的機制)來發(fā)揮功能。增強劑包括但不限于甜菜堿、甜菜堿類似物、甘油、牛血清清蛋白(BSA)、聚乙二醇、氯化四甲銨、7-脫氮-GTP、中性去污劑、二甲亞砜(DMS0)、甲醇、乙醇、異丙醇、甲酰胺、丙酮、乙酰胺、N-甲基酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙酰胺、N-甲基乙酰胺、N, N- 二甲基乙酰胺、2-吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、丙酰胺、和異丁酰胺。中性去污劑包括但不限于TWEEN-20、β -辛基-葡糖苷、辛基- β -硫代-吡喃葡萄糖苷、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween-80、Pluronic F-68、Pluronic F-127、Deoxy Big CHAP、CHAPS、CHES、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(Tergitol 型 NP-40)、和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Ig印al CA-630)。甜菜堿類似物包括但不限于高丹醇甜菜堿 (homodeanol betaine)、丹酉享舌甘菜喊(deanol betaine)、丙舌甘菜喊(propio betaine)、高甘油甜菜堿(homoglycerol betaine)、二乙醇高甜菜堿、三乙醇高甜菜堿、羥丙基高甜菜堿、 N-甲基-N-(2-羧乙基)嗎啉憤內(nèi)鹽，N-甲基-N-(2-羧乙基)哌啶內(nèi)鹽、N-甲基-N-(2-羧乙基)吡咯烷綃內(nèi)鹽、N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)-N-(2-磺乙基)銨內(nèi)鹽、N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)-N-(3-磺丙基)銨內(nèi)鹽、N，N-二羥乙基-N-甲基-N-(3-磺丙基)銨內(nèi)鹽、N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)-N-(4-磺丁基)銨內(nèi)鹽、N-甲基-N-(3-磺丙基)嗎啉綃1 內(nèi)鹽、和N-甲基-N-(3-磺丙基)哌啶內(nèi)鹽?？梢砸?. 01-5Μ、0· 01_4Μ、0· 01_3Μ、0· 01-2. 5Μ、0· 02_5Μ、0· 03_5Μ、0· 04-5Μ、 0. 05-5Μ、0· 07-5Μ、0· 1_5Μ、0· 2_5Μ、0· 3_5Μ、0· 4_5Μ、0· 5_5Μ、0· 7_5Μ、1_5Μ、1. 5_5Μ、0· 1-4Μ、
0.5-3Μ、1-2. 5Μ、或 1. 5-2. 5Μ,例如約 0. 01,0. 02,0. 05,0. 1、0. 2、0. 5、0. 75、1、1. 25,1. 5、
1.6、1· 7、1· 8、1· 9、2· 0、2· 1、2· 2、2· 3、2· 4、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、或 5Μ 的摩爾濃度提供甜菜堿、甜菜堿類似物和/或其它增強劑。或者，可以以0. 1-50%,0. 2-50%,0. 5-50%, 1-50%, 2-50%,5-50%,0. 1-40%,0. 1-30%,0. 1-20%,0. 5-40%、1_30%、或 2_20%，例如約 0. 1、 0. 2,0. 5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或 50% (按體積計)的 w/v 或 ν/ν 百分比濃度提供增強劑?？梢砸?0. 0001-10% (按體積計)、0· 0002-10%,0. 0005-10%,0. 001-10%, 0. 002-10 %,0. 005-10 %,0. 01-10 %,0. 02-10 %,0. 05-10 %,0. 0001-5 %,0. 0001-2
0. 0001-1 %,0. 0005-1 %、或 0. 001-1 %，例如約 0. 0001,0. 0002,0. 0003,0. 0004,0. 0005、0.0006,0.0007,0.0008,0.0009,0.001,0.002,0.003,0.004,0.005,0.006,0.007,0.008、 0. 009、0. 0U0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06,0. 07,0. 08,0. 09,0. U0. 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、 0. 7,0. 8,0. 9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10% (按體積計)提供中性去污劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認可適合于多種增強劑的濃度。H.鎂鹽本發(fā)明涉及包括提供鎂鹽的方法。鎂鹽是一種含有鎂和酸的共軛堿的化學化合物。鎂鹽可以包含例如但不限于氯化鎂、乙酸鎂、磷酸鎂、溴化鎂、或碘化鎂。以如下的數(shù)量提供鎂鹽，使得鎂的終濃度可以是 l-5mM、l-4. 5mM、l-4mM、l-3. 5mM、l-3mM、l. 5-5mM、2-5mM、 2. 5-5mM、3-5mM、l. 5-4. 5mM、或 2_4mM。例如，鎂的終濃度可以是約 1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5、4、 4. 5、或 5mM。I.緩沖液本發(fā)明涉及包括提供緩沖液的方法。緩沖液可以包括例如但不限于三(羥甲基) 氨基甲烷(Tris)、二 -Tris丙烷、碳酸氫鹽、磷酸鹽、甘氨酸、組氨酸、4-(2-羥乙基)_1_哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、和多種共軛堿/酸及其鹽。J.數(shù)據(jù)、產(chǎn)物、和用途在一些實施方案中，通過本發(fā)明的方法生成的產(chǎn)物可以包含約5、10、20、30、40、 50、70、100、150、200、250、300、400、500、700、800、900、1000、2000 或更多個 CGG 重復。在一
些實施方案中，本發(fā)明的擴增反應牽涉擴增含有比Coriell FMRl 5’ UTR標準品更多的重復的等位基因，所述標準品含有20、28-四、118、198、或約330個CGG重復。通過本發(fā)明的方法生成的產(chǎn)物可以包含 5-2000、10-2000、20-2000、30-2000、40-2000、50-2000、70-2000、 100-2000、150-2000、200-2000、250-2000、300-2000、5-1000、5-700、5-500、5-400、5-300、 10-1000、10-700、20-500、30-400、或100-300的CGG重復的數(shù)目?？梢允褂媒?jīng)由本發(fā)明獲得的數(shù)據(jù)，即測試的結(jié)果來診斷狀況或疾病的存在或缺失?？梢栽趥€體基因型的確定上使用經(jīng)由使用本發(fā)明獲得的數(shù)據(jù)?？梢允褂媒?jīng)由本發(fā)明獲得的數(shù)據(jù)來檢測與脆性X綜合征、 脆性X相關(guān)震顫共濟失調(diào)綜合征、和脆性X相關(guān)原發(fā)性卵巢功能不全有關(guān)的基因型。與這些狀況有關(guān)的遺傳基因座是本領(lǐng)域中已知的，并且包括但不限于FMR1、FMR2、FMRl的5’ UTR、 FMR2的5，UTR、FMRl 5，UTR內(nèi)的CGG重復、和FMR2的5，UTR內(nèi)的CGG重復。在別的實施方案中，可以使用經(jīng)由本發(fā)明獲得的數(shù)據(jù)來檢測與富含GC的三核苷酸重復病癥，諸如脆性 X綜合征、脆性X相關(guān)震顫共濟失調(diào)綜合征、和脆性X相關(guān)原發(fā)性卵巢功能不全、強直性肌營養(yǎng)不良、亨延頓氏病、脊延髓肌萎縮癥、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮、和/或脊髓小腦性共濟失調(diào)有關(guān)的基因型。與這些狀況有關(guān)的遺傳基因座是本領(lǐng)域中已知的，并且包括但不限于 FMR1、FMR2、DMPK, ZNF9、HTT、AR、ATN1、ATXN1-3、ATXN7、ATXNlO、CACNA1A、SCA8、 PPP2R2B、和 TBP。參見例如 Nat Genet. 1996 年 5 月；13 (1) :105-8 ;Nat Genet. 1996 年 5 月；13(1) :109-13。實施例1通過運行一系列反應來測量不同GC/AT比率、總dNTP濃度、和甜菜堿濃度的效果， 所述反應具有1、5、或10的GC/AT比率；0. 75,1. 0、或1. 25mM的總dNTP (Roche, GMP級產(chǎn)品目錄編號 G 04631129103、C 04631072103、A 04631056103、T 04631137103)濃度；和 1. 7、 2. 0、或2. 2M的甜菜堿(Sigma產(chǎn)品目錄編號B0300-1VL)濃度。模板是表1所示多種基因組DNA各IOng的混合物。每次反應利用擴增長模板PCR系統(tǒng)緩沖液2 (Roche產(chǎn)品目錄編 ^ 11681834001)以及1. 125個單位的重組Taq聚合酶(Roche，產(chǎn)品目錄編號03734935001) 一起。引物與在&iluto等，J Mol Diagn 7:605-12(2005)中一樣，每種ΙμΜ。除循環(huán)的數(shù)目外，PCR循環(huán)概況與在Mluto等中一樣，如下簡要概述98°C變性10分鐘；按照97°C 35 秒、64°C 35秒、68°C 4分鐘進行10輪循環(huán)；按照97°C 35秒、64°C 35秒、68°C 4分鐘，加上每輪循環(huán)20秒的增量進行15輪循環(huán)；最終于68°C延伸10分鐘。將6微升PCR產(chǎn)物以5V/ cm在具有IX Bionic緩沖液的1. 75% NuSieve瓊脂糖凝膠上電泳45分鐘，接著進行STOR 金染色及通過UV光顯現(xiàn)。表1 所測試的Coriell基因組DNA對照的基因型
權(quán)利要求
1.提高一種或多種DNA聚合酶在至少一種富含GC的DNA模板上的持續(xù)合成能力的方法，該方法包括，在含有GC/AT比率大于1的dNTP的水溶液中進行DNA擴增。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述GC/AT比率是1.1-25。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述GC/AT比率是2.5-10。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板具有至少65%的GC豐度。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板具有至少90%的GC豐度。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板包含由G和C殘基組成的二、三、或四核苷酸的至少五個連續(xù)重復。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板至少包含F(xiàn)MRl的5’UTR的一部分。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板包含F(xiàn)MRl的5’UTR的CGG重復。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板至少包含F(xiàn)MR2的5’UTR的一部分。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述富含GC的DNA模板包含F(xiàn)MR2的5，UTR的CGG重復。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述水溶液進一步包含至少一種增強劑。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一種增強劑包含甜菜堿、甜菜堿類似物、DMS0、 或中性去污劑之至少一種。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一種增強劑包含a.甜菜堿或甜菜堿類似物；和b.至少一種選自下組的化合物DMS0、中性去污劑、和7-脫氮-GTP。
14.權(quán)利要求1的方法，包括在水溶液中擴增所述富含GC的模板，所述水溶液包含a.至少一種富含GC的DNA模板；b.至少一種鎂鹽；c.至少一種DNA聚合酶；d.至少一種緩沖液；和e.GC/AT比率大于1的dNTP，并使所述溶液經(jīng)歷至少一個溫育期，該期間發(fā)生擴增。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述水溶液進一步包含至少一種增強劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述至少一種增強劑包含甜菜堿、甜菜堿類似物、7-脫氮-GTP、DMS0、和中性去污劑之至少一種。
17.權(quán)利要求1的方法，其中通過選自SDA、NASBA,LAMP、RCA、或LCR之至少一種的方法來擴增所述至少一種富含GC的模板。
18.權(quán)利要求1的方法，進一步包括提供與所述至少一種富含GC的模板退火的至少一種引物。
19.提高一種或多種DNA聚合酶在至少一種富含GC的DNA模板上的持續(xù)合成能力的方法，該方法包括，在水溶液中經(jīng)PCR擴增所述模板，所述水溶液包含a.GC/AT 比率為 2-10 的 dNTP ；b.至少一種增強劑，選自甜菜堿、DMS0、和中性去污劑；c.至少一種DNA聚合酶；d.1. 5-2mM的總鎂濃度；和e.0. 7-0. 9mM 的總 dNTP 濃度；其中所述至少一種富含GC的模板包含F(xiàn)MRl的5’ UTR的CGG重復。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述中性去污劑包含TWEEN-20。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述PCR生成包含至少200個CGG重復的產(chǎn)物。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述PCR生成包含至少300個CGG重復的產(chǎn)物。
23.一種檢測與富含GC的三核苷酸重復病癥有關(guān)的基因型的方法，包括對至少一種與富含GC的重復有關(guān)的基因型進行DNA擴增反應，其中通過提供包含GC/AT比率大于1的 dNTP的水溶液來提高一種或多種DNA聚合酶的持續(xù)合成能力。
24.一種檢測與脆性X綜合征、脆性X相關(guān)震顫共濟失調(diào)綜合征、和/或脆性X相關(guān)原發(fā)性卵巢功能不全有關(guān)的基因型的方法，包括對至少一種富含GC的DNA模板進行DNA擴增反應，其中通過提供包含GC/AT比率大于1的dNTP的水溶液來提高一種或多種DNA聚合酶的持續(xù)合成能力。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述模板包含F(xiàn)MRl或FMR2的5’UTR的CGG重復。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述GC/AT比率是1.1-25。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述GC/AT比率是2_10。
全文摘要
提供了用于提高DNA聚合酶在富含GC的模板上的持續(xù)合成能力的方法。該方法涉及提供增強劑和有偏比率的dNTP，并且可以在DNA擴增反應中使用。該方法可用于檢測與富含GC的重復有關(guān)的基因型，包括脆性X綜合征。
文檔編號C12Q1/68GK102395686SQ201080016469
公開日2012年3月28日 申請日期2010年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月13日
發(fā)明者G.J.拉薩姆 申請人:奧斯瑞根公司