專利名稱：腫瘤標記物及其利用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤標記物及其利用，更詳細來說，涉及一種適于甲狀腺乳頭癌診斷的腫瘤標記物的檢測方法及此方法中所使用的工具。
背景技術：
甲狀腺乳頭癌是甲狀腺癌中發生率最高的惡性腫瘤，且在轉移到肺或頸部淋巴結時可能會預后不良。因此，甲狀腺乳頭癌的確診非常重要。對于甲狀腺乳頭癌的確診而言， 病理組織學的研究是不可欠缺的。然而，除了甲狀腺乳頭癌以外，也存在很多其它呈現為乳頭狀構造物的惡性腫瘤，因此不僅很難判斷病灶是否為原發性，而且也很難判定淋巴結轉移的腫瘤性病變。甲狀腺乳頭癌的病理組織的特征是根據在甲狀腺組織中進行特異性表達的分子的表達方式來評價的。作為已知的甲狀腺標記物，已知有甲狀腺球蛋白或甲狀腺轉錄因子 1 (thyroid transcription factor 1 :TTF_1)等。已知甲狀腺球蛋白是由甲狀腺組織分泌的為二聚體的糖蛋白。在甲狀腺疾病下，甲狀腺球蛋白在細胞中或血液中的濃度會提高。[現有技術文獻]專利文獻1 :W02006/133361 ；2006年12月14日國際公開。專利文獻2 國際專利申請日本國公表，“特表2008-500033號”;2008年1月10日公表。1 =Otsuki, T et al. ， SNX5, a New Member of the Sorting Nexin Family,Binds to the Fanconi Anemia Complementation Group A Protein. Biochemical and Biophysical Research Communications 265:630-635(1999)非專利文獻 2 :Teasdale, R. D. et al. , A large family of endosome-localized proteins related to sorting nexin 1. Biochem. J. 358 :7-16 (2001)
發明內容
血液中的甲狀腺球蛋白量的測定被用于觀察甲狀腺癌手術后的病情變化(尤其是用于判斷轉移的可能性)。然而，甲狀腺球蛋白的測定無法判斷甲狀腺癌是良性還是惡性。另外，在目前所報告的在甲狀腺組織中作特異性表達的分子當中，存有在其它器官中也表達的分子。因此，人們熱切期望一種對甲狀腺乳頭癌具有特異性且優異的腫瘤標記物。本發明是鑒于所述問題而完成的，其目的在于提供一種對甲狀腺乳頭癌具有特異性的腫瘤標記物、及使用此腫瘤標記物的甲狀腺乳頭癌判斷技術。本發明的發明人等制作了針對人類SNX5蛋白質的抗體，并使用此抗人類SNX5抗體實施了針對各種人類正常組織及腫瘤性病變的免疫組織化學染色，結果發現SNX5對甲狀腺的濾泡上皮表現出了特異的反應，尤其是對作為來源于甲狀腺的惡性腫瘤的甲狀腺乳頭癌表現出了強烈的反應性；而在呈其它組織型的甲狀腺癌、來源于胃腸道的乳頭狀腺癌、 來源于肺的乳頭狀腺癌中幾乎未發現SNX5的表達。根據該發現結果，本發明的發明人完成了本發明。也就是說，本發明的方法是檢測腫瘤標記物的方法，其特征在于包括檢測檢體樣本中的SNX5的步驟。在本發明的方法中，所述檢體樣本優選是從檢體采集的組織或該組織的培養物或該組織的切片，也可以是由從檢體采集的組織或該組織的培養物所制備的細胞溶解物。另外，所述組織優選是甲狀腺組織，也可以是血液等體液。在本發明的方法中，所述檢體優選是有可能患有甲狀腺疾病的患者，也可以是甲狀腺乳頭癌已發病的患者。所述SNX5優選是SNX5蛋白質或其片段。在此情況時，檢測所述SNX5的步驟優選是使用抗SNX5抗體的免疫分析。所使用的抗SNX5抗體優選是抗人類SNX5抗體，更優選是抗人類SNX5單克隆抗體，尤其優選是由融合瘤48C2產生的小鼠抗人類SNX5單克隆抗體， 或是與該小鼠抗人類SNX5單克隆抗體具有同等的結合活性的單克隆抗體。另外，所述SNX5也可以是SNX5基因或其片段。在此情況時，檢測所述SNX5的步驟優選是使核酸探針與SNX5基因或其片段進行雜交的步驟。所述核酸探針優選是雜交探針，也可以是PCR(Polymerase Chain Reaction 聚合酶鏈式反應)引物。本發明的方法更優選既包括檢測SNX5蛋白質或其片段的步驟，又包括檢測SNX5 基因或其片段的步驟。所述方法能夠是提供甲狀腺乳頭癌的診斷標準的方法，也能夠是提供乳頭狀形態的惡性腫瘤的鑒別判斷標準的方法。另外，所述方法也能夠是提供甲狀腺乳頭癌的病變是否為原發病灶的判定標準的方法。所述方法也能夠是提供頸部淋巴結轉移的腫瘤是否是來源于甲狀腺的判斷標準的方法。本發明的試劑盒是用以檢測腫瘤標記物的試劑盒，其特征在于具有抗SNX5抗體。 本發明的試劑盒優選是還具有用以檢測所述抗體的試劑。所述抗體優選是抗人類SNX5抗體，更優選是抗人類SNX5單克隆抗體，尤其優選是由融合瘤48C2產生的小鼠抗人類SNX5 單克隆抗體或是與該小鼠抗人類SNX5單克隆抗體具有同等的結合活性的單克隆抗體。本發明的試劑盒是用以檢測腫瘤標記物的試劑盒，其特征在于具有能與SM5基因或其片段雜交的寡核苷酸。本發明的試劑盒優選還具有用以檢測所述寡核苷酸的試劑。 所述寡核苷酸優選針是對SNX5基因或其片段的雜交探針，但也可以是PCR引物。所述試劑盒優選是用以提供甲狀腺乳頭癌的診斷標準的試劑盒，也能夠是用以提供乳頭狀形態的惡性腫瘤的鑒別判斷標準的試劑盒。另外，所述試劑盒也能夠是提供甲狀腺乳頭癌的病變是否為原發病灶的判定標準的試劑盒。進而，所述試劑盒也能夠是用以提供頸部淋巴結轉移的腫瘤是否是來源于甲狀腺的判斷標準的試劑盒。本發明的其他目的、特征和優越點在以下的記述中將會十分明了。另外，本發明的益處將通過以下的說明和附圖而變得明確。[發明的效果]通過運用本發明，能夠對適于診斷是否為甲狀腺乳頭癌的腫瘤標記物進行檢測。
圖1是利用抗人類SNX5單克隆抗體，對導入了 PCMV-SNX5的人類293細胞的細胞可溶性組分實施了蛋白質印跡(Western blot)的結果圖；在對照中，使用了導入有pCMV、 pCMV-mutant AIRE#1 或 pCMV_mutant AIRE#2 的人類 293 細胞。圖2是利用抗人類SNX5單克隆抗體，對導入了 pCMV_SNX5的人類293細胞實施了免疫組織化學染色的結果圖；在對照中，使用了導入PCMV的人類293細胞，任何細胞均是由多聚甲醛來固定的。圖3是利用抗人類SNX5單克隆抗體，對人類腺癌組織的福爾馬林固定石蠟包埋切片實施了免疫組織化學染色的結果圖；圖3的(a)表示甲狀腺乳頭癌中的免疫組織化學染色結果，圖3的(b)表示肺腺癌中的免疫組織化學染色結果，圖3(c)表示乳腺癌中的免疫組織化學染色結果。圖4是利用抗人類SNX5多克隆抗體，對人類腺癌組織的福爾馬林固定石蠟包埋切片實施了免疫組織化學染色的結果圖。圖5是對甲狀腺的正常組織及癌組織中的人類SNX5基因實施了定量RT-PCR的結果圖。
具體實施例方式如上所述，本發明人等發現SNX5雖然在作為來源于甲狀腺的惡性腫瘤的甲狀腺乳頭癌中高度表達，但在呈其它組織型的甲狀腺癌、來源于胃腸道的乳頭狀腺癌、來源于肺的乳頭狀腺癌中幾乎未發現表達。現有技術中已啟示了人類sorting nexin-5 (SNX^是與細胞內的內質網輸送相關的分子，且與細胞的游走密切相關(例如參照非專利文獻1及2)。另外，在專利文獻1中列舉了多個與多發性骨髓瘤相關的基因的候補，其中1個候補就是SNX5。在專利文獻2中列舉了多個與腫瘤相關的結合MHC(major histocompatibility complex 主要組織相容性復合體)分子的肽(抗原肽)的候補，其中1個候補是SN)(5蛋白質的部分斷片(氨基酸 292 300 專利文獻2的序列號524)。然而，甲狀腺乳頭癌中的SNX5的特異性在任何一個文獻中都沒有啟示或揭示。對此，本發明提供一種關于甲狀腺乳頭癌的優異的腫瘤標記物。〔1.腫瘤標記物〕本發明提供關于甲狀腺乳頭癌的優異的腫瘤標記物。在一個實施方式中，本發明的腫瘤標記物為SNX5蛋白質或其片段。在其它實施方式中，本發明的腫瘤標記物為SNX5 基因或其片段。本說明書中敘述的SNX5蛋白質為包含序列號1所示的氨基酸序列的多肽；或， 包含序列號1所示氨基酸序列的1個或多個氨基酸經缺失、取代或附加后的氨基酸序列的、 具有SNX5活性的多肽。另外，SM5蛋白質可以是由包含序列號2所示的核苷酸序列的多核苷酸來編碼的多肽；也可以是，由包含序列號2所示核苷酸序列的1個或多個堿基經缺失、 取代或附加后的核苷酸序列的多核苷酸來編碼，且具有SNX5活性的多肽；也可以是由可與包含序列號2所示核苷酸序列的多核苷酸在嚴格的條件下雜交的多核苷酸來編碼，且具有 SM5活性的多肽；或者也可以是由與包含序列號2所示的核苷酸序列的多核苷酸具有80% 以上的同源性的多核苷酸來編碼，且具有SNX5活性的多肽。從使用多肽(氨基酸)的觀點而言，所述“1個或多個”優選是在1 30個的范圍內，更優選是在1 20個的范圍內，進而優選是在1 10個的范圍內，最優選是在1 5個的范圍內。另外，本技術領域人員可以根據目標多肽的長度，而容易地理解到所述的“ 1 個或多個”所表示的氨基酸個數范圍是何程度。從使用多核苷酸(堿基)的觀點而言，所述“1個或多個”優選是在1 100個的范圍內，更優選是在1 50個的范圍內，進而優選是在1 30個的范圍內，最優選是在1 15個的范圍內。另外，本技術領域人員可以根據目標多核苷酸的長度，而容易地理解到所述“1個或多個”所表示的堿基個數范圍是何程度。例如，在涉及后述的寡核苷酸時，“1個或多個”優選是在1 10個的范圍內，更優選是在1 7個的范圍內，進而優選是在1 5 個的范圍內，最優選是在1 3個的范圍內。本說明書中，與目標多肽或目標多核苷酸的同源性優選是80%以上，更優選是 85%以上，進而優選是90%以上，最優選是95%以上。在本說明書中，術語“SNX5活性”是指與使用包含序列號1所示的氨基酸序列的多肽作為抗原而產生的抗SNX抗體之間的結合能力。所述SNX抗體只要是后述的抗SNX5 抗體即可，優選是后述的48C2抗體。另外，所述多肽既可以是重組人類SNX5蛋白質，也可以是分離純化的天然人類SNX5蛋白質。在本說明書中，SNX5基因是對包含序列號1所示的氨基酸序列的多肽進行編碼的多核苷酸；或是，對包含序列號1所示氨基酸序列的1個或多個氨基酸經缺失、取代或附加后的氨基酸序列的、具有SM5活性的多肽，進行編碼的多核苷酸。另外，SM5基因可以是包含序列號2所示的核苷酸序列的多核苷酸；也可以是，對包含序列號2所示核苷酸序列的 1個或多個堿基經缺失、取代或附加后的核苷酸序列的、具有SNX5活性的多肽，進行編碼的多核苷酸；也可以是，對可與包含序列號2所示核苷酸序列的多核苷酸在嚴格的條件下雜交且具有SM5活性的多肽，進行編碼的多核苷酸；或者也可以是，對與包含序列號2所示核苷酸序列的多核苷酸具有80%以上的同源性且具有SNX5活性的多肽，進行編碼的多核苷酸。序列號1為登錄在GenBank(寄存編號AF121855)中的SNX5的氨基酸序列。序列號2為對序列號1所示的氨基酸序列進行編碼的核苷酸序列序列號2對應于登錄在 GenBank (寄存編號AF121855)中的SNX5的核苷酸序列(序列號3)的開放閱讀框(第181 位 第I395位)。本說明書中的術語“多肽”可以與“肽”或“蛋白質”交換使用，指的是氨基酸的聚合物。另外，多肽的“片段”是指此多肽的部分斷片。本發明的多肽可以重組形成，也可以化學合成，也可以從天然供給源分離出來。本說明書中的術語“多核苷酸”可以與“基因”、“核酸”或“核酸分子”交換使用，指的是核苷酸的聚合物。另外，多核苷酸的“片段”是指此多核苷酸的部分斷片。在本說明書中，術語“核苷酸序列”可以與“核酸序列”或“堿基序列”交換使用。本發明的多核苷酸能以RNA (例如mRNA)的形態或DNA的形態(例如cDNA或基因組DNA)存在。DNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(作為義鏈而周知)， 或者可以是非編碼鏈(作為反義鏈而周知)。在本說明書，術語“寡核苷酸，，是指多個乃至數十個核苷酸結合而成的物質，可以與“多核苷酸”交換使用。
在本說明書中，術語“嚴格的(雜交)條件”是指在雜交溶液(含有50%甲酰氨、5XSSC(150mM的NaCl、15mM的檸檬酸三鈉)、50mM的磷酸鈉(pH7. 6)、5X鄧哈特溶液 (Denhard' s solution)、10 %硫酸葡聚糖、20 μ g/ml的改性斷裂鮭魚精DNA)中于42°C 下培養一晚后，于約65°C下，在0. IXSSC中洗滌濾膜。但根據所要雜交的多核苷酸的不同，可以適當地改變高嚴格度下的洗滌條件，例如在使用來源于哺乳類的DNA的情況下，優選在含有 0. 1% SDS (sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸鈉)的 0. 5 X SSC (standard saline citrate 標準檸檬酸鹽)溶液中，于65°C下進行洗滌(優選15分鐘X2次)；在使用來源于E.大腸桿菌(Escherichia coli)的DNA的情況下，優選在含有0. 1% SDS的 0. 1 X SSC中于68°C下進行洗滌(優選15分鐘X 2次)；在使用RNA的情況下，優選在含有 0. 1% SDS的0. IXSSC中于68°C下進行洗滌(優選15分鐘X2次)；在使用寡核苷酸的情況下，優選在含有0. 1 % SDS的0. 1 X SSC中于雜交溫度下進行洗滌(優選15分鐘X 2次)。通過使用本發明的腫瘤標記物，可以提供呈現乳頭狀形態的惡性腫瘤的判斷標準，因此，是否為甲狀腺乳頭癌變得容易判斷。另外，本發明在判定病變是否為原發病灶時非常有效。進而，只要使用本發明，便可更加明確地判斷頸部淋巴結轉移腫瘤是來源于甲狀腺，還是來源于其它組織(肺、乳腺等)。〔2.腫瘤標記物的檢測方法〕本發明提供腫瘤標記物的檢測方法。本發明的腫瘤標記物的檢測方法的特征在于包括檢測檢體樣本中的SNX5的步驟。在一個實施方式中，本發明的檢測方法包括檢測SNX5 蛋白質或其片段的步驟。在其它實施方式中，本發明的檢測方法包括檢測SM5基因或其片段的步驟。在本說明書中，“檢體樣本”是指從檢體采集的任意組織(包括血液等體液)或細胞，由這些組織或細胞所制備的組織切片或細胞溶解物也可以是包含在檢體樣本中。作為本發明中優選使用的檢體樣本，可列舉腫瘤組織及血清，但并不限定于是這些。另外，作為取得樣本的第一階段來將組織或細胞直接從檢體上取下的步驟是由醫生實施的，這屬于本發明的范圍之外。另外，利用根據本發明的方法所獲得的結果來判定是否患病的步驟也是由醫生實施的，這也屬于本發明的范圍之外。作為本發明的對象的檢體優選是有可能患有甲狀腺疾病的患者，更優選是甲狀腺乳頭癌已發病的患者，也可以是無發病的人。在本發明的方法中，所述檢體樣本優選是從有可能患有甲狀腺疾病的患者采集的甲狀腺組織或其培養物、或者是由這些組織或其培養物所制備的組織切片或細胞溶解物，但不限定于此。本領域技術人員可容易地理解到樣本的取得順序可以根據所需的組織或細胞來適當選擇。在檢測SNX5蛋白質的實施方式中，檢測SNX5的步驟可以是使用了抗SNX5抗體的免疫分析。在本說明書中，術語“免疫分析”是指利用基于抗原抗體反應的免疫學結合反應來進行的分析。利用免疫學結合反應的分析例如有免疫組織化學、免疫電子顯微鏡法、蛋白質印跡、免疫沉淀法、三明治酶聯免疫分析(ELISA :sandwich enzyme-linked immunosorbent assay)、放射性免疫分析、抗體分析(例如免疫擴散分析)以及親和層析等。這些技術在此領域中眾所周知，技術人員可容易地實行本發明。作為抗SNX5抗體，優選抗人類SNX5抗體，更優選單克隆抗體，尤其優選由融合瘤 (hybridoma)48C2產生的小鼠抗人類SNX5單克隆抗體(也稱作48C2抗體)。本發明人等發現48C2抗體能識別人類SNX5蛋白質的N末端側(序列號1的1 177位序列號10) (不示出結果)。也就是說，“SM5蛋白質的片段”是包含序列號1所示的氨基酸序列的部分序列的多肽，優選是含有序列號10所示的氨基酸序列、或有連續8個以上氨基酸的氨基酸序列的多肽。另外，閱讀了本說明書的本領域技術人員可容易地理解到具有與48C2抗體同等的結合特性的單克隆抗體也包含在適用于本發明的抗體的范圍內。在檢體樣本是從檢體采集的組織或其培養物或切片時，所述免疫分析可以是指免疫組織化學染色。在檢體樣本是由從檢體采集的組織或其培養物所制備的細胞溶解物時， 所述免疫分析也可以是指蛋白質印跡。另外，在檢體樣本是從檢體采集的血液時，所述免疫分析可以是指ELISA。這些免疫分析優選用于手術前的鑒別診斷，也可以在檢查手術后有無轉移時使用。由融合瘤48C2產生的小鼠抗人類SM5單克隆抗體不僅適于利用蛋白質印跡來檢測SM5蛋白質、福爾馬林固定石蠟切片中的SM5蛋白質，也使多聚甲醛固定組織中的SNX5 蛋白質的鑒定成為了可能。以前曾報告有SM5在細胞質中的功能，使用此小鼠抗人類SNX5 單克隆抗體的結果也表明SM5僅局限在細胞質內。這一結果支持了該小鼠抗人類SM5單克隆抗體的特異性。另外，該融合瘤48C2現由北海道公立大學法人札幌醫科大學知識產權管理室(電話060-8556 ；住址札幌市中央區南1條西17 丁目)管理保存，必要時可分開出讓。在進行惡性腫瘤的病理組織診斷時，免疫組織化學上的探討非常重要。只要使用對特定器官或組織具有特異性的腫瘤標記物，那么還未能確定原發病灶的轉移性病變的確診就會變得容易，并且可以快速地確定診斷或治療的方針。以前雖然發現了各種器官的特異的分子標記物，但實際用于病理組織診斷的抗體仍受到限制。尤其是仍未發現適于鑒別甲狀腺乳頭癌的合適的抗體。對通常的病理組織檢測中所使用的福爾馬林固定石蠟切片，使用小鼠抗人類SNX5 單克隆抗體進行免疫組織化學染色，結果是在來源于甲狀腺的乳頭癌中發現了 SNX5的強表達，而在作為其它腺癌的代表例的來源于肺癌或乳癌的癌組織中完全沒有發現表達。為了驗證這一結果，使用了市售的兔子抗人類SNX5多克隆抗體進行了免疫組織化學染色，結果同樣發現腫瘤細胞中的SM5的高表達。如此，SM5作為甲狀腺乳頭癌的腫瘤標記物非常優異。另外，所述小鼠抗人類SNX5單克隆抗體使多聚甲醛固定組織的免疫組織分析成為可能，是非常優異的檢測工具。在檢測SNX5基因的實施方式中，檢測SNX5的步驟可以是使核酸探針與SNX5基因或其片段雜交的步驟。在本說明書中，“核酸探針”只要能與目標核酸進行雜交便可，其無特別限定，既可以是所謂的雜交探針，也可以是PCR引物。雜交技術及PCR技術在此領域中眾所周知，技術人員可容易地實行本發明。若檢體樣本是從檢體采集的組織樣本，可以采用在此領域中公知的各種手法，例如可以采用in situ雜交技術、in situ PCR技術等。另外， 若檢體樣本是從檢體采集的血液，例如可以采用慣用的PCR技術。核酸探針只要是含有SN)(5基因(或其互補鏈)的一部分序列的寡核苷酸便可，其無特別限定，既可以是包含序列號4或5所示的核苷酸序列或其互補序列的寡核苷酸，也可以是包含序列號6 9所示的核苷酸序列或其互補序列的寡核苷酸。另外，由于48C2抗體能識別人類SN)(5蛋白質的N末端側，因此核酸探針也可以是編碼所述“SN)(5蛋白質的片段”的寡核苷酸。在situ雜交的情況時，核酸探針優選是包含序列號1所示核苷酸序列中的 15 50個連續堿基或該核苷酸序列的互補序列中的15 50個連續堿基的寡核苷酸，更優選包含20 50個所述連續堿基，進而優選包含20 45個所述連續堿基，最優選包含25 40個所述連續堿基。另外，在運用PCR(含有in situ PCR)的情況時，核酸探針優選是包含序列號1所示核苷酸序列中的15 50個連續堿基或該核苷酸序列的互補序列中的15 50個連續堿基的寡核苷酸，更優選包含15 40個所述連續堿基，進而優選包含15 35個所述連續堿基，最優選包含25 35個所述連續堿基。另外，本實施方式的檢測方法的特征在于包括檢測SNX5基因的步驟，優選還包括檢測所述SNX5蛋白質的步驟。如此，通過使用本發明的腫瘤標記物的檢測方法，可以提供乳頭狀形態的惡性腫瘤的判斷標準，因此便能夠容易地判斷是否為甲狀腺乳頭癌。另外，本發明在判定病變是否為原發病灶時非常有效。進而，只要使用本發明，可更加明確地判斷頸部淋巴結轉移腫瘤是來源于甲狀腺，還是來源于其它組織(肺、乳腺等)。也就是說，本發明的方法可以是甲狀腺乳頭癌診斷標準的提供方法(例如，用以診斷甲狀腺乳頭癌的數據的取得方法)，也可以是乳頭狀形態的惡性腫瘤的鑒別判斷標準的提供方法(例如，用以鑒別乳頭狀形態的惡性腫瘤的數據的取得方法)。另外，本發明的方法也可以是甲狀腺乳頭癌的病變是否為原發病灶的判定標準的提供方法(例如，用以判定甲狀腺乳頭癌的病變是否為原發病灶的數據的取得方法)。進而，本發明的方法也可以是頸部淋巴結轉移腫瘤是否來源于甲狀腺的判斷標準的提供方法(例如，用以判定頸部淋巴結轉移腫瘤是否來源于甲狀腺的數據的取得方法)。〔3.腫瘤標記物的檢測工具〕本發明提供用以檢測腫瘤標記物的試劑盒。本發明的試劑盒的特征在于具有用以檢測檢體樣本中的SNX5的工具。在本說明書中，術語“試劑盒”是指具有內包了特定材料的容器(例如瓶、板、管、 盤等)的包裝體，材料包含在包裝體組合物的其中一種物質中的這一形態也在術語“試劑盒”的概念范圍內。試劑盒優選具有各種材料的使用指示書。在本說明書中，涉及試劑盒的場合，所述“具有”是指內包在構成試劑盒的各容器的任意一方中的這一狀態。另外，本發明的試劑盒可以是將多個不同的組合物捆綁成1個的包裝體，在本發明的試劑盒為溶液形態時，其也可以內包在容器中。本發明的試劑盒既可以在同一容器中混合具有物質A和物質B，也可以在不同容器中具有物質A和物質B。“指示書”既可以在紙或其它介質上書寫或印刷，或者也可以刻錄在磁帶、計算機可讀取的磁盤或磁帶、CD-ROM等電子介質上。本發明的試劑盒能夠具有內包稀釋劑、溶劑、洗滌液或其它試劑的容器。進而，本發明的試劑盒也可以具有采集檢體樣本時所需的器具和試劑。另外，本發明的試劑盒也可以具有從檢體樣本制備切片或細胞溶解物時所需的器具及試劑。在一個實施方式中，本發明的試劑盒具有用以檢測SNX5蛋白質或其片段的抗體。 所述抗體優選是抗人類SNX5抗體，更優選是抗人類SNX5單克隆抗體，尤其優選是由融合瘤 48C2產生的小鼠抗人類SNX5單克隆抗體或與該小鼠抗人類SNX5單克隆抗體具有同等的結合活性的單克隆抗體。另外，本發明的試劑盒優選還具有用以檢測所述抗體的試劑，也可以將含有用以檢測SNX5蛋白質或其片段的抗體作為上述組合物來提供。
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在其它實施方式中，本發明的檢測試劑盒具有用以檢測SM5基因或其片段的寡核苷酸。所述寡核苷酸優選是能與SM5基因或其片段雜交的寡核苷酸。所述寡核苷酸優選是針對SNX5基因或其片段的雜交探針或PCR引物。另外，本發明的試劑盒優選還具有用以檢測所述寡核苷酸的試劑，也可以將含有用以檢測SN)(5基因或其片段的寡核苷酸作為上述組合物來提供。本發明的試劑盒優選是用以提供甲狀腺乳頭癌的診斷標準的試劑盒，也能夠是用以提供乳頭狀形態的惡性腫瘤的鑒別判斷標準的試劑盒。另外，本發明的試劑盒也能夠是用以提供甲狀腺乳頭癌的病變是否為原發病灶的判定標準的試劑盒。進而，本發明的試劑盒也能夠是用以提供頸部淋巴結轉移腫瘤是否是來源于甲狀腺的判斷標準的試劑盒。如此，本發明的目的在于提供腫瘤標記物，并提供通過檢測該腫瘤標記物而獲得甲狀腺乳頭癌的診斷標準。閱讀了本說明書的本領域技術人員根據本說明書中的記載和技術常識，可容易地理解能夠以各種形態實行本發明。[實施例]〔1.人類 SNX5CDNA 的取得〕將從人類HacaT細胞提取的總RNA作為模板，使用正向引物(pCMV-HA-SNX5 Fff 5 ‘ -CAGGCCCGAATTCGGATGGCCGCGGTTCCCGAG-3 ‘(序列號 4))和反向引物(pCMV-HA_SNX5 RV 5 ‘ -GATCTCGGTCGACCGTGAAGGCATATCAGTTAT-3 ‘(序列號 5))來進行 RT-PCR， 由此獲得了人類SNX5cDNA。將所獲得的人類SNX5cDNA插入到大腸桿菌用表達載體 pET3c (Novagen)和哺乳動物用表達載體pCMV_HA(BD Bioscience)中，由此分別制作了 pET3c-SNX5 和 pCMV-HA-SNX5。在此，pCMV-HA_SNX5 Fff 是在人類 SNX5cDNA 的 5'區域的序列(ATGGCCGCGGTTCCCGAG(序列號6))中連結了限制性酶部位等的引物，pCMV-HA_SNX5 RV 是在人類SNX5cDNA的3'區域的序列(ataactgatatgccttcac (序列號7))的互補序列中連結了限制性酶部位等的引物。〔2.抗人類SNX5單克隆抗體的制作〕培養導入了 pET3c_SNX5的大腸桿菌BL21，利用異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG :isopropyl β -D-thiogalactopyranoside)誘導蛋白質合成。接著,將人類 SNX5 蛋白質從菌體成分中分離/濃縮。將所獲得的蛋白質作為免疫原，使用完全佐劑(僅初次免疫時)或不完全佐劑O次或其以后的免疫時)作為佐劑，對6 8周齡的Balb/c小鼠實施腹腔內免疫(10(^8/個體)。每隔一周進行一次追加免疫，進行2個月，在采集脾細胞的3天前進行最終免疫。使用聚乙二醇使采集的脾細胞與NSO小鼠骨髓瘤細胞融合，在96 孔板中，在含有HAT (Hypoxathine-aminopterin-thymidine 次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脫氧核苷)、10% FBS (fatal bovine serun 胎牛血清)的RPMI1640培養基中將此融合細胞培養2 3周。使用培養上清液進行蛋白質印跡法，由此篩出了抗人類SNX5單克隆抗體。〔3.對哺乳動物細胞的基因導入〕向用含有10% 85、青霉素/鏈霉素的01^] 培養基(01^]\1:011讓6(^0' s Modified Eagle Medium)培養而得的人類四3細胞，用LF2000 (Invitrogen公司)依照制造商的操作說明書導入了 PCMV-SNX5。在此，將從轉化體提取的總RNA作為模板，使用正向引物 (SNX5 AMP FW:5' -ccggttaaagagcaaagacg-3‘(序列號 8))和反向引物(SNX5 AMP RV 5' -agctctgcaaaagggagaca-3 ‘(序列號9))進行了 RT-PCR，從而確認到了轉化體中的 SNX5的表達。〔4.蛋白質印跡分析〕將導入了 pCMV-SNX5的人類293細胞培養3天后，用含有0. 5 % NP-40的溶解用緩沖液對其施以可溶化。使用5 20%的梯度凝膠來進行SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis 十二燒基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)，把被施以了可溶化的組分中含有的蛋白質分離。將分離的蛋白質轉印至尼龍膜上，利用抗人類SM5單克隆抗體進行了 1小時的一次抗體反應，利用過氧化酶復合物化山羊抗小鼠IgG抗體進行了 1小時的二次抗體反應。使用ECL試劑盒(Amersham公司制造)，使信號可視化。如圖1所示，雖然在50kDa的位置檢測到了非特異性的條帶，但是對SNX5 (分子量 47kDa)具有特異性的信號僅在導入了 PCMV-SNX5的細胞中檢測到。而同樣的信號未從基因被導入了陰性對照(CMV、pCMV-mutant AIRE#U pCMV-mutant AIRE#2)的細胞中發現。〔5.免疫組織化學染色〕將導入了 pCMV-SNX5的人類293細胞培養3天后，用多聚甲醛固定，使用抗人類 SM5單克隆抗體作為一次抗體，使用將Alexa596復合物化的山羊抗小鼠IgG抗體作為二次抗體，在室溫下使其分別反應1小時，由此進行了免疫組織化學染色。使用1X71熒光顯微鏡(Olympus公司制造)檢測了信號。圖2中表示有導入了 pCMV_SNX5的細胞(左)、導入了 pCMV作為陰性對照的細胞(右)。可知抗人類SNX5單克隆抗體與SNX5特異性地反應。另外，使用腺癌組織的福爾馬林固定石蠟包埋切片，利用抗人類SNX5單克隆抗體進行了免疫組織化學染色。使用自動免疫染色裝置(DAK0公司制造)檢測了信號(圖3)。 如圖3的(a)所示，在甲狀腺乳頭癌中發現了 SNX5的強表達。然而，在肺腺癌(圖3的(b)) 及乳腺癌(圖3的(C))中卻沒有發現SNX5的表達(圖3的(b))。此外，使用市售的兔子抗人類SNX5多克隆抗體(H40 ；Santa Cruz Biotechnology)，對使用所建立的抗人類SNX5單克隆抗體進行調查而得的、腫瘤組織中的 SM5表達分布(圖4)進行了驗證。如圖4所示，在使用甲狀腺乳頭癌的福爾馬林固定石蠟切片來進行的免疫組織化學染色中，從腫瘤細胞中發現了 SNX5的強表達。此外，使用小鼠抗人類SNX5單克隆抗體，分析了呈現乳頭狀增殖的各種惡性腫瘤中的SM5的表達。其結果示于表1。如表1所示，在甲狀腺以外的20例的上皮性惡性腫瘤 (包括胃癌、結腸癌及胰腺癌)以及5例的肉瘤·非上皮性惡性腫瘤的各例中，均完全沒有發現SNX5的表達。[表 1]
權利要求
1.一種用于檢測甲狀腺乳頭癌的腫瘤標記物的方法，其特征在于 包括檢測檢體樣本中的SNX5蛋白質或其片段的步驟。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟是通過使用抗SNX5抗體的免疫分析來進行的。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述抗SNX5抗體是由融合瘤48C2產生的小鼠抗人類SNX5單克隆抗體，或是與該小鼠抗人類SNX5單克隆抗體具有同等的結合活性的單克隆抗體。
4.一種用于檢測甲狀腺乳頭癌的腫瘤標記物的方法，其特征在于 包括檢測檢體樣本中的SNX5基因或其片段的步驟。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟是通過使核酸探針與SNX5基因或其片段雜交來進行的。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述核酸探針是包含序列號4 9中任意序列號所示的核苷酸序列或其互補序列的寡核苷酸。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于所述檢體樣本是由采自檢體的組織或該組織的細胞所制備的切片或細胞溶解物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述組織為甲狀腺組織。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其特征在于 所述檢體是有可能患有甲狀腺疾病的患者。
10.一種用以檢測甲狀腺乳頭癌的腫瘤標記物的試劑盒，其特征在于 具有抗SNX5抗體。
11.根據權利要求10所述的試劑盒，其特征在于所述抗SNX5抗體是由融合瘤48C2產生的小鼠抗人類SNX5單克隆抗體，或是與該小鼠抗人類SNX5單克隆抗體具有同等的結合活性的單克隆抗體。
12.—種用以檢測甲狀腺乳頭癌的腫瘤標記物的試劑盒，其特征在于 具有能與SNX5基因或其片段雜交的寡核苷酸。
13.根據權利要求12所述的試劑盒，其特征在于所述寡核苷酸包含序列號4 9中任意序列號所示的核苷酸序列或其互補序列。
全文摘要
本發明用于檢測檢體樣本中的SNX5，通過將本發明用作對甲狀腺乳頭癌具有特異性的腫瘤標記物，能使甲狀腺乳頭癌的診斷變容易。另外，本發明提供一種運用此腫瘤標記物的甲狀腺乳頭癌判斷技術。
文檔編號C12N15/09GK102365551SQ20108001411
公開日2012年2月29日 申請日期2010年4月7日 優先權日2009年4月10日
發明者一宮慎吾, 佐藤昇志, 外岡曉子, 菊地智樹 申請人:Lsip基金運營聯合公司