細胞分離方法

專利名稱：細胞分離方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞分離方法。更具體而言，本發明涉及一種通過使用籠鎖化合物來僅從細胞群分離具有預定特性的靶細胞的細胞分離方法。
背景技術：
從細胞群中分離具有預定特性的靶細胞的細胞分離技術被廣泛用于血細胞辨別、 基因重組細胞的純化、細胞表型變化的分析等。迄今沿用的細胞分離技術的例子包括熒光激活細胞分選(FACS)和使用磁性微珠的方法。例如，在使用FACS來分離表達預定的細胞表面抗原的靶細胞時，使包含經與該抗原特異性結合的熒光標記抗體標記的靶細胞的細胞群流過流動池，接著進行激光束照射。 此后，檢測從每個細胞照射的熒光以判定細胞的光學特性，由此僅將具有源自經標記熒光物質的光學特性的靶細胞加以物理分離。專利文獻1(圖7)披露了 FACS，其包括流體系統 (其將用熒光標記試劑等染色的細胞在流動池中成行排布，并作為液滴釋放到流動池外)、 光學系統(其用激光束照射細胞以檢測散射光和熒光)、和分選系統(其控制所釋放的液滴的運動方向)。例如，在使用磁性微珠來分離表達預定細胞表面抗原的靶細胞時，用與該抗原特異性結合的磁性標記抗體來標記靶細胞。此后，使用磁體來捕捉結合有足夠量的磁性標記抗體的靶細胞，使其與未結合磁性標記抗體的細胞(或結合量少的細胞)分離。專利文獻 2披露了一種用于磁性分離細胞的方法和裝置。現有技術文獻專利文獻[PTL l]JP-A-2007-46947[PTL 2]JP-T-2002-515319發明概述依照FACS，有可能通過以每秒數千 數萬個細胞的高速度判定細胞特性來分離靶細胞。然而，另一方面，為了實施高速度分離，需要使細胞在高壓下流過流動池(flow cell)，因此由于形成液滴的噴嘴部分的突然壓力變化等而對細胞造成物理損傷。此外， FACS的流體系統和分選系統的結構復雜，是非常昂貴的裝置。依照使用磁性微珠的方法，可以集中處理大量細胞，并且與FACS相比，可以降低對細胞的物理損傷。然而，在此方法中，由于無法對每個細胞檢測的光學特性來進行定量分析，從而進行靶細胞的判定，所以例如不可能僅分離以等于或高于一定的基準值表達預定的表面抗原的細胞。此外，在此方法中，因為不能組合分析表面抗原的多種表達狀態，所以不可能使用多項參數來分析細胞，也不能通過設門(gating)來分離細胞。另外，在使用磁性微珠的方法中，因為針對細胞表面抗原，使用磁性標記抗體來實施細胞的標記和分離，所以無法基于不能借助抗體標記的細胞特性來分離細胞。不能借助抗體標記的細胞特性的具體例子包括使用Hoechst試劑的核酸熒光染色，和使用Fluo-3試劑的胞內鈣的熒光染色。 就Hoechst試劑而言顯示高排出能力的細胞稱作“側群細胞(SP細胞)”，據說SP細胞具有干細胞特性。使用經Hoechst試劑染色的細胞的熒光強度作為指標進行的SP細胞分離在干細胞研究領域中被廣泛實施，但是SP細胞分離不能通過使用磁性微珠的方法來實施。因此，本發明的主要目的是提供一種細胞分離方法，其不使用具有復雜結構的裝置，抑制對細胞的物理損傷，而且使得通過定量分析和多參數分析來實施細胞分離，以及使用Hoechst染色等作為指標來實施細胞分離等成為可能。為了解決上述問題，本發明提供了一種細胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物 (caged compound)標記的細胞的特性的步驟；通過僅向具有預定特性的靶細胞照射光來激活標記于靶細胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細胞與對所述激活的籠鎖化合物有親和力的物質進行接觸，并基于所述物質與所述激活的籠鎖化合物之間的相互作用來僅從所述細胞中分離出所述靶細胞的步驟。此細胞分離方法包括例如判定用籠鎖生物素標記的細胞的特性的步驟；通過僅向具有預定特性的靶細胞照射光來激活標記于靶細胞的所述籠鎖生物素的步驟；及使細胞與鏈霉抗生物素蛋白進行接觸，并基于所述鏈霉抗生物素蛋白與所述激活的籠鎖生物素間的相互作用來僅從所述細胞中分離出所述靶細胞的步驟。或者，此細胞分離方法包括例如判定用籠鎖熒光素標記的細胞的特性的步驟； 通過僅向具有預定特性的靶細胞照射光來激活標記于靶細胞的所述籠鎖熒光素的步驟；及使細胞與抗熒光素抗體進行接觸，并基于所述抗體與所述激活的籠鎖熒光素間的相互作用來僅從所述細胞中分離出所述靶細胞的步驟。作為上述細胞分離方法的一個變形的例子，本發明還提供了一種細胞分離方法， 其包括判定用籠鎖化合物標記的細胞的特性的步驟；通過僅向沒有預定特性的非靶細胞照射光來激活標記于非靶細胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細胞與對所述激活的籠鎖化合物有親和力的物質進行接觸，并基于所述物質與所述激活的籠鎖化合物之間的相互作用，來僅從所述細胞中分離除去所述非靶細胞，從而獲得靶細胞的步驟。在這些方法中，作為所述對激活的籠鎖化合物有親和力的物質，使用具有如下所述的親和力的物質，所述親和力在光解離性保護基從所述籠鎖化合物解離時表現出來。作為上述兩種細胞分離方法的一個變形的例子，本發明還提供了一種細胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標記的細胞的特性的步驟；通過僅向具有預定特性的非靶細胞照射光來激活標記于非靶細胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細胞與對非激活的籠鎖化合物有親和力的物質進行接觸，并基于所述物質與所述非激活的籠鎖化合物之間的相互作用來僅從所述細胞中分離靶細胞的步驟。或者，本發明提供了一種細胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標記的細胞的特性的步驟；通過僅向具有預定特性的靶細胞照射光來激活標記于靶細胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細胞與對非激活的籠鎖化合物有親和力的物質進行接觸，并基于所述物質與所述非激活的籠鎖化合物之間的相互作用來僅從所述細胞中分離除去所述非靶細胞，從而獲得靶細胞的步驟。在這些方法中，作為所述對非激活的籠鎖化合物有親和力的物質，使用具有如下所述的親和力的物質，所述親和力在所述籠鎖化合物從光解離性保護基解離時喪失。依照本發明的細胞分離方法可以進一步包括用籠鎖化合物標記細胞的步驟。在本發明中，“籠鎖化合物”指其活性位點受到光解離性(光降解性)保護基保護、當光解離性保護基通過光照射從活性位點解離時由無活性狀態轉換成活性狀態的化合物。 另外，在本發明中，“籠鎖型化合物”指其活性位點被光解離性保護基保護的無活性籠鎖化合物，而“解籠鎖(uncaged)型化合物”指光解離性保護基由于光照射而解離從而變成了活性狀態的籠鎖化合物。此外，在本發明中，籠鎖化合物的“活性狀態”指籠鎖化合物可以與“對激活的籠鎖化合物具有親和力的物質”相互作用的狀態。與此相反，“無活性狀態”指籠鎖化合物不能與該物質相互作用的狀態。即，“對激活的籠鎖化合物具有親和力的物質”僅對“解籠鎖型化合物”具有親和力，而對“籠鎖型化合物”不展現出親和力。另一方面，“對非激活的籠鎖化合物具有親和力的物質”僅對“籠鎖型化合物”具有親和力，而對“解籠鎖型化合物”不展現出親和力。依照本發明，提供了一種細胞分離方法，其在不使用具有復雜結構的裝置的情況下抑制對細胞的物理損傷，而且使細胞分離能夠通過定量分析和多參數分析來實施及使細胞分離能夠使用Hoechst染色等作為指標來實施。附圖簡述

圖1是顯示依照本發明的細胞分離方法的程序的流程圖。圖2是顯示依照本發明的第一個實施方案的細胞分離方法的程序的示意圖。圖3是顯示依照本發明的第一個實施方案的細胞分離方法的程序的示意圖。圖4是顯示依照本發明的第二個實施方案的細胞分離方法的程序的示意圖。圖5是顯示依照本發明的第二個實施方案的細胞分離方法的程序的示意圖。符號說明3 抗體4 柱5 對解籠鎖型化合物22有親和力的物質(鏈霉抗生物素蛋白、抗熒光素抗體)6 磁性物質7 磁體11 靶細胞12 非靶細胞21 籠鎖型化合物(籠鎖型生物素、籠鎖型熒光素)
22 解籠鎖型化合物(解籠鎖型生物素、解籠鎖型熒光素)D 容器F1、F2:激光束發明詳述在下文中將參照附圖來描述本發明的優選實施方案。雖然如下描述的實施方案例示了本發明的代表性實施方案的例子，但是本發明的范圍不受實施方案狹窄地解釋。將以下列次序進行描述。1.使用籠鎖生物素的細胞分離(1)籠鎖化合物的標記(步驟Si)(2)熒光物質標記(步驟S》和特性判定(步驟S3)(3)解籠鎖(步驟S4)
(4)分離(步驟 S5)2.使用籠鎖熒光素的細胞分離(1)籠鎖化合物的標記(步驟Si)(2)熒光物質標記(步驟S》和特性判定(步驟S3)(3)解籠鎖(步驟S4)(4)分離(步驟 S5)1.使用籠鎖生物素的細胞分離圖1是顯示依照本發明的細胞分離方法的程序的流程圖。圖2和圖3是顯示依照本發明的第一個實施方案的細胞分離方法的程序的示意圖。在下文中，參照圖1至3來描述依照第一個實施方案的細胞分離方法的程序。(1)籠鎖化合物標記(步驟Si)在圖1中，以符號Sl標示的“籠鎖化合物標記步驟”是用籠鎖化合物標記細胞的步驟(參見圖2(A))。在此步驟中，用籠鎖化合物標記包含要分離的靶細胞的所有細胞。可以通過使用例如結合籠鎖化合物的抗體來用籠鎖化合物標記細胞。在此情形中，使用這樣的抗體其以存在于包括靶細胞在內的所有細胞的表面上的物質作為抗原。存在于所有細胞表面上的物質的例子包括細胞表面上普遍表達的細胞膜蛋白、和細胞表面上普遍存在的糖鏈及脂質等。可以通過使用例如結合籠鎖化合物的凝集素來用籠鎖化合物標記細胞。在此情況中，使用這樣的凝集素，其能結合普遍存在于包括靶細胞在內的所有細胞的表面上的糖鏈。 另外，用籠鎖化合物標記細胞的方法沒有特別限制，可以使用任何方法，只要所述方法使細胞能夠直接或間接地結合籠鎖化合物即可。作為標記細胞的籠鎖化合物，例如可以使用籠鎖生物素或籠鎖熒光素等。作為籠鎖化合物，籠鎖核苷酸、籠鎖肽、籠鎖鈣螯合劑等是可用的，并且已經有人報告了包括核酸、蛋白質、脂質等籠鎖化合物(參見“Biologically active molecules with a "light switch”· ”Angew Chem Int Ed Engl. 2006 年 7 月 24 日；45(30) :4900-21)。在本發明中， 可以使用任何上述籠鎖化合物，沒有任何特定限制，只要可以實現本發明的目的。圖2 (A)顯示了在籠鎖化合物標記步驟Sl中使用抗體3用籠鎖型化合物21標記靶細胞11和非靶細胞12的情況。下面，在本實施方案中，以使用籠鎖生物素作為籠鎖型化合物21的情況為例加以說明。作為籠鎖生物素，有可能使用MeNPOC-生物素、氫醌-生物素等。下面，在本實施方案中，籠鎖型化合物21指“籠鎖型生物素21”。(2)熒光物質標記(步驟S》和特性判定(步驟S3)在圖1中，以符號S3標示的“特性判定步驟”是判定已經用籠鎖化合物標記的細胞的特性的步驟(參見圖2(B))。在此步驟中，實施已經用籠鎖型生物素21標記的細胞的光學特性的檢測和判定。可以使用例如公知的流式細胞儀來檢測細胞的光學特性。具體地，使包含靶細胞 11和非靶細胞12的樣品溶液流過流動池，接著進行激光束Fl照射，由此檢測從細胞產生的要測量的光。作為要測量的光，可以使用前散射光、側散射光、瑞利散射、米氏散射等散射光，以及熒光等。將要測量的檢測光轉化成電信號，并基于電信號來判定每個細胞的特性。在通過檢測從細胞照射的熒光來判定細胞的光學特性時，可以用熒光標記抗體來標記靶細胞11 (或非靶細胞12)，之后進行特性判定步驟S3。在圖1中，以符號S2標示的 “熒光物質標記步驟”是在分離表達預定細胞表面抗原的靶細胞11的情形中，用與該抗原特異性結合的熒光標記抗體來對靶細胞11進行標記的步驟。可以使用與常規的FACS的細胞分離方法相同的步驟實施熒光物質標記步驟S2。此外，可以與籠鎖化合物標記步驟Sl同時或在籠鎖化合物標記步驟Sl前實施熒光物質標記步驟S2。在本實施方案中，對細胞特性是進行光學檢測并判定；然而，可以使用例如電學或磁學檢測手段來實施細胞特性的檢測和判定。在電學或磁學檢測細胞特性時，將微電極布置于流動池中，從而測量流過流動池的細胞電阻值、電容值、電感值、阻抗、電極間電場的變化值、或者磁化、磁界變化、磁場變化等。在此情況下，基于細胞的電學或磁學特性來分離細胞。(3)解籠鎖(步驟S4)在圖1中，以符號S4標示的“解籠鎖步驟”是通過僅向具有預定特性的靶細胞照射光來激活標記靶細胞的籠鎖化合物的步驟(參見圖2(C))。在此步驟中，將激光束F2照射到在特性判定步驟S3中已經被判定為具有預定特性的靶細胞11，由此激活標記的籠鎖型生物素21。作為用于激活籠鎖化合物的激光束F2，使用具有適合于解離保護籠鎖化合物的活性位點的光解離性保護基的波長和強度的激光束。作為激光光源，例如可以使用與公知的流式細胞儀中提供的上述激光束Fl的同樣的光源，諸如汞燈、氙氣燈和各種激光光源(固相激光、氣體激光、和半導體激光)。作為激光光源，可以合適地使用小型但是能高輸出的巨脈沖激光。用于檢測細胞的光學特性的激光束Fl和用于激活籠鎖化合物的激光束F2由不同光學系統或相同光學系統構成。另外，可以在不同時機或在基本上相同的時間將激光束Fl 和F2照射到靶細胞11。在本文中，“基本上相同的時間，，意為在流動池中的相同位置處實施激光束Fl向靶細胞11和非靶細胞12的照射及激光束F2向已經判定為具有預定特性的靶細胞11的照射。通過根據判定細胞特性所需要的時間來適當地調節流動池中的細胞流速，有可能在基本上相同的時間實施激光束Fl和激光束F2的照射。在照射激光束F2時，由于光解離性保護基從活性位點解離，標記于靶細胞11的籠鎖型生物素21從無活性狀態轉換成活性狀態。S卩，如圖2(C)中所顯示的，籠鎖型生物素21 變成“解籠鎖型生物素22”。另一方面，因為激光束F2不照射到非靶細胞12，所以標記非靶細胞12的籠鎖型生物素21不被激活，而且不發生變化。圖2(D)是示意性顯示在解籠鎖步驟S4后已經從流動池收集的靶細胞11和非靶細胞12的視圖。如該圖中所顯示的，解籠鎖型生物素22已經標記于靶細胞11，并且籠鎖型生物素21已經標記于非靶細胞12。(4)分離(步驟 S5)在圖1中，以符號S5標示的“分離步驟”是使細胞與對激活的籠鎖化合物有親和力的物質接觸，并基于該物質與激活的籠鎖化合物之間的相互作用來僅從細胞中分離靶細胞的步驟(參見圖幻。在此步驟中，使經解籠鎖型生物素22標記的靶細胞11與對解籠鎖型生物素22具有親和力的鏈霉抗生物素蛋白5接觸。此后，基于解籠鎖型生物素22與鏈霉抗生物素蛋白5之間的相互作用來分離靶細胞11。
具體地，首先，如圖3(A)中所顯示的，使從流動池收集的靶細胞11和非靶細胞12 流過固相化(made into a solid phase)有鏈霉抗生物素蛋白5的柱4。由于解籠鎖型生物素22與鏈霉抗生物素蛋白5之間的相互作用，經解籠鎖型生物素22標記的靶細胞11被保留在柱4中，如圖3(B)中所顯示的。另一方面，經籠鎖型生物素21標記的非靶細胞12 不保留在柱4中而通過柱4。由此，能夠分離靶細胞11與非靶細胞12。靶細胞11不必通過解籠鎖型生物素22與鏈霉抗生物素蛋白5之間的相互作用而完全捕獲并保留在柱4中， 只要通過與鏈霉抗生物素蛋白5之間的相互作用，使靶細胞11和不與鏈霉抗生物素蛋白5 發生相互作用而通過的非靶細胞12之間，在通過柱4的時間上有差異即可。這里，已經描述了在解籠鎖步驟S4中，將激光束F2照射到靶細胞11，將靶細胞11 保留在柱4中從而被分離的情形。然而，在依照本實施方案的細胞分離方法中，在解籠鎖步驟S4中將激光束F2照射到非靶細胞12也是可以的。在此情況中，由于激活的解籠鎖型生物素22與鏈霉抗生物素蛋白5之間的相互作用，非靶細胞12被保留在柱4中，從而被分離。 這樣，被籠鎖型生物素21標記的靶細胞11照原樣通過柱4，并被收集。本在實施方案中，作為柱4，使用的是已經固相化了鏈霉抗生物素蛋白的柱。然而， 可以使用任何物質作為固相化到柱4中的物質，只要該物質對解籠鎖型生物素22具有親和力即可。此類物質的例子包括抗生物素抗體。在使用其他化合物例如籠鎖熒光素等作為籠鎖化合物時，將對解籠鎖型化合物具有親和力的物質例如抗熒光素抗體固相化到柱4中。如上文所描述的，依照本實施方案的細胞分離方法，通過使用常規的流式細胞手段來實施特性判定步驟S3，可以定量、多參數地分析細胞的光學特性。作為分析的結果，可以僅激活已經判定為具有預定特性的靶細胞的籠鎖化合物，并從而分離靶細胞。依照本實施方案的細胞分離方法，可以無需使用具有流體系統和分選系統的結構復雜的FACS而分離靶細胞。在依照本實施方案的細胞分離方法中，通過在從流動池收集細胞后使用柱4來實施分離步驟S5，有可能防止伴隨液滴形成的對細胞的物理損傷，而這是使用FACS進行分離的問題之一。此外，在通過FACS分離有風險(諸如有感染之虞)的細胞時，液滴形成過程中產生的氣溶膠會引起污染問題，然而在依照本實施方案的細胞分離方法中，沒有關于污染的擔憂。2.使用籠鎖熒光素的細胞分離圖4和圖5是顯示依照本發明的第二個實施方案的細胞分離方法的順序的示意圖。在依照第一個實施方案的方法中，在流動池中實施特性判定步驟S3和解籠鎖步驟S4。 與此相反，依照本實施方案的細胞分離方法的特征在于依靠使用顯微鏡的成像技術來實施特性判定步驟S3和解籠鎖步驟S4。(1)籠鎖化合物標記(步驟Si)圖4(A)示意性顯示了籠鎖化合物標記步驟Si，其中用籠鎖化合物標記容納于容器D諸如培養皿(Petri dish)中的靶細胞11和非靶細胞12。在籠鎖化合物標記步驟Sl 中，用籠鎖化合物標記包括要分離的靶細胞在內的所有細胞。如第一個實施方案中所描述的，用籠鎖化合物標記細胞可以通過使用例如結合籠鎖化合物的抗體，或結合籠鎖化合物的凝集素來進行。細胞可以是懸浮細胞或貼壁細胞。通過向已經培養了這些細胞的容器D中的培養基中添加抗體等，或者將培養基替換成合適的緩沖溶液后添加抗體溶液，籠鎖化合物直接或間接地結合細胞。圖4 (A)顯示了通過在籠鎖化合物標記步驟Sl中使用抗體3來用籠鎖型化合物21 標記靶細胞11和非靶細胞12的情況。在下文中，在本實施方案中，以使用籠鎖熒光素作為籠鎖型化合物21的情況為例子來進行說明。作為籠鎖熒光素，例如，可以使用通過將5-羧基甲氧基-2-硝基芐基(CMNB)添加到熒光素而獲得的籠鎖熒光素。在下文中，在本實施方案中，籠鎖型化合物21指“籠鎖型熒光素21”。(2)熒光物質標記(步驟S》和特性判定(步驟S3)圖4(B)示意性顯示了特性判定步驟S3，其中檢測并判定用籠鎖型熒光素21標記的細胞的光學特性。在本實施方案中，通過例如使用顯微鏡的成像技術來檢測細胞的光學特性。具體地，例如通過使用作為照射機構的激光束Fl和作為成像機構的顯微鏡(其包括區域成像裝置諸如CCD或CMOS裝置)，檢測由于激光束Fl的照射而從細胞產生的熒光，并將檢測到的熒光轉化成電信號。基于電信號來判定每個細胞的特性。在此情況中，在特性判定步驟S3 之前，可以以與上文所描述(參見熒光物質標記步驟幻)的那樣，先用熒光標記抗體來標記靶細胞11 (或非靶細胞12)。在本文中是通過檢測熒光來判定細胞的特性。然而，例如也可以基于通過上述成像機構獲得的細胞形狀來檢測并判定細胞的特性。(3)解籠鎖(步驟S4)圖4 (C)示意性顯示了解籠鎖步驟S4，其中將激光束F2照射到在特性判定步驟S3 中已經判定為具有預定特性的靶細胞11，由此激活標記的籠鎖型熒光素21。激光束F2的照射機構在顯微鏡中作為不同或相同的光學系統提供。作為用于激活籠鎖化合物的激光束F2，使用具有適合于解離保護籠鎖化合物的活性位點的光解離性保護基的波長和強度的激光束。另外，可以在不同時間或在基本上相同的時間將激光束Fl和 F2照射到靶細胞11。在照射激光束F2時，由于光解離性保護基從活性位點解離，標記于靶細胞11的籠鎖型熒光素21從無活性狀態變換成活性狀態。S卩，如圖4(C)中所顯示的，籠鎖型熒光素21 變成“解籠鎖型熒光素22”。另一方面，因為激光束F2不照射到非靶細胞12，所以標記非靶細胞12的籠鎖型熒光素21不被激活，而不發生改變。圖4(D)是示意性顯示解籠鎖步驟S4后的靶細胞11和非靶細胞12的視圖。如該圖中所顯示的，解籠鎖型熒光素22已經標記于靶細胞11，而籠鎖型熒光素21已經標記于非靶細胞12。(4)分離(步驟 S5)圖5示意性顯示了分離步驟S5，其中使細胞與對所述激活的籠鎖化合物有親和力的物質進行接觸，并基于所述物質與所述激活的籠鎖化合物之間的相互作用來僅從所述細胞中分離出所述靶細胞。在此步驟中，使經解籠鎖型熒光素22標記的靶細胞11與對解籠鎖型熒光素22有親和力的抗熒光素抗體5進行接觸。基于解籠鎖型熒光素22與抗熒光素抗體5之間的相互作用，分離靶細胞11。具體地，首先，將結合磁性物質6的抗熒光素抗體5添加至已經從容器D諸如培養皿收集的靶細胞11和非靶細胞12。抗熒光素抗體5特異性結合標記靶細胞11的解籠鎖型熒光素22，由此用磁性物質6磁性標記靶細胞11 (參見圖5(A))。另一方面，因為抗熒光素抗體5不結合用籠鎖型熒光素21標記的非靶細胞12，所以未磁性標記非靶細胞12。在下文中，如圖5(B)中所顯示的，使靶細胞11和非靶細胞12流過設置有磁體7 的柱4。由于磁性物質6與磁體7之間的磁性吸引力而將經磁性標記的靶細胞11保留在柱 4中(參見圖5(C))。另一方面，未經磁性標記的非靶細胞不被保留在柱4中而通過。由此可以分離靶細胞11與非靶細胞12。靶細胞11通過磁性物質6與磁體7之間的磁性吸引力吸附到柱4的內壁上而完全保留在其中不是必要的，只要在該磁性吸引力的作用下靶細胞 11與非靶細胞12通過柱的時間產生差異即可。這里，已經描述了在解籠鎖步驟S4中，將激光束F2照射到靶細胞11，并將靶細胞 11保留在柱4中，從而加以分離的情況。然而，在依照本實施方案的細胞分離方法中，還有可能在解籠鎖步驟S4中將激光束F2照射到非靶細胞12。在此情況中，由于激活的解籠鎖型熒光素22結合抗熒光素抗體5，非靶細胞12被磁性標記，非靶細胞12保留在柱4中，從而被分離。這樣，未被磁性標記的靶細胞11通過柱4，從而被分離。在本實施方案中使用的是籠鎖熒光素作為籠鎖化合物，但是籠鎖化合物不限于籠鎖熒光素。在使用與籠鎖熒光素不同的籠鎖化合物時，使用特異性結合解籠鎖型化合物的抗體代替抗熒光素抗體5來磁性標記靶細胞11。如上文所描述的，依照本實施方案的細胞分離方法，通過使用成像技術來實施特性判定步驟S3，可以定量、多參數地分析細胞的光學特性。作為該分析的結果，可以僅激活已經判定為具有預定特性的靶細胞的籠鎖化合物，并分離靶細胞。另外，依照本實施方案的細胞分離方法，可以無需使用具有流體系統和分選系統的結構復雜的FACS而分離靶細胞。在依照本實施方案的細胞分離方法中，通過在從容器D諸如培養皿收集細胞后使用柱4來實施分離步驟S5，有可能防止伴隨液滴形成的對細胞的物理損傷，而這是使用 FACS進行分離的問題之一。此外，在通過FACS分離具有風險(諸如關于感染的擔憂)的細胞時，此外，在通過FACS分離有風險(諸如有感染之虞)的細胞時，液滴形成過程中產生的氣溶膠會引起污染問題，然而，依照本實施方案的細胞分離方法沒有關于污染的擔憂。在如上文所描述的依照第一個和第二個實施方案的細胞分離方法中，已經描述了通過使用僅對解籠鎖型化合物而不對籠鎖型化合物有特異性親和力的物質(鏈霉抗生物素蛋白5或抗熒光素抗體幻來分離靶細胞或非靶細胞的例子。然而，在依照本發明的細胞分離方法中當然還可能通過使用僅對籠鎖型化合物而不對解籠鎖型化合物有特異性親和力的物質來分離靶細胞或非靶細胞。例如，作為抗熒光素抗體，制備不結合解籠鎖型熒光素，但僅結合籠鎖型熒光素的抗體。隨后，在解籠鎖步驟S4中激活標記于非靶細胞的籠鎖型熒光素，而靶細胞保持被解籠鎖型熒光素標記。這樣，可以僅將靶細胞保留在固相化有抗熒光素抗體的柱中，并分離靶細胞。工業實用性依照本發明的細胞分離方法可以廣泛用于血細胞辨別、基因重組細胞的純化、對細胞表型變化的分析等。依照本發明的細胞分離方法可以抑制對細胞的物理損傷，而且使得借助定量或多參數地分析的細胞分離成為可能。因此，該方法特別可用于血液學或干細胞研究領域。
權利要求
1.一種細胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標記的細胞的特性的步驟；通過僅向具有預定特性的靶細胞照射光來激活標記于靶細胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細胞與對所述激活的籠鎖化合物有親和力的物質進行接觸，并基于所述物質與所述激活的籠鎖化合物之間的相互作用來僅從所述細胞中分離出靶細胞的步驟。
2.一種細胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標記的細胞的特性的步驟；通過僅向沒有預定特性的非靶細胞照射光來激活標記于非靶細胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細胞與對所述激活的籠鎖化合物有親和力的物質進行接觸，并經由基于所述物質與所述激活的籠鎖化合物之間的相互作用來僅從所述細胞中分離除去所述非靶細胞，從而獲得靶細胞的步驟。
3.依照權利要求1或2的細胞分離方法，其中，使用在光解離性保護基從所述籠鎖化合物解離時表現出所述親和力的物質，作為所述對激活的籠鎖化合物有親和力的物質。
4.一種細胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標記的細胞的特性的步驟；通過僅向具有預定特性的非靶細胞照射光來激活標記于非靶細胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細胞與對非激活的籠鎖化合物有親和力的物質進行接觸，并基于所述物質與所述非激活的籠鎖化合物之間的相互作用來僅從所述細胞中分離出靶細胞的步驟。
5.一種細胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標記的細胞的特性的步驟；通過僅向具有預定特性的靶細胞照射光來激活標記于靶細胞的所述籠鎖化合物的步驟；及使細胞與對非激活的籠鎖化合物有親和力的物質進行接觸，并基于所述物質與所述非激活的籠鎖化合物之間的相互作用來僅從所述細胞分離除去所述非靶細胞，從而獲得靶細胞的步驟。
6.依照權利要求4或5的細胞分離方法，其中，使用在光解離性保護基從所述籠鎖化合物解離時所述親和力喪失的物質，作為所述對非激活的籠鎖化合物有親和力的物質。
7.依照權利要求3或6的細胞分離方法，其進一步包括用籠鎖化合物標記細胞的步馬聚ο
8.依照權利要求1的細胞分離方法，其包括 判定用籠鎖生物素標記的細胞的特性的步驟；通過僅向具有預定特性的靶細胞照射光來激活標記靶細胞的所述籠鎖生物素的步驟；及使細胞與鏈霉抗生物素蛋白進行接觸，并基于所述鏈霉抗生物素蛋白與所述激活的籠鎖生物素間的相互作用來僅從所述細胞中分離出所述靶細胞的步驟。
9.依照權利要求1的細胞分離方法，其包括判定用籠鎖熒光素標記的細胞的特性的步驟；通過僅向具有預定特性的靶細胞照射光來激活標記于靶細胞的所述籠鎖熒光素的步驟；及使細胞與抗熒光素抗體進行接觸，并基于所述抗體與所述激活的籠鎖熒光素間的相互作用來僅從所述細胞中分離出所述靶細胞的步驟。
全文摘要
本發明提供了一種細胞分離方法，其在不使用具有復雜結構的裝置的條件下抑制對細胞的物理損傷，而且使借助定量分析和多參數分析的細胞分離、以及利用Hoechst染色等作為指標的細胞分離成為可能。本發明提供了一種細胞分離方法，其包括判定用籠鎖化合物標記的細胞的特性的步驟(S3)；通過僅向具有預定特性的靶細胞照射光來激活標記靶細胞的籠鎖化合物的步驟(S4)；及使細胞與對激活的籠鎖化合物有親和力的物質進行接觸，并基于該物質與激活的籠鎖化合物之間的相互作用來僅從細胞中分離靶細胞的步驟(S5)。
文檔編號C12N1/00GK102341504SQ20108001017
公開日2012年2月1日 申請日期2010年3月1日 優先權日2009年3月10日
發明者新田尚 申請人:索尼公司