用于檢測脫氧核糖核酸酶活性的方法和制品的制作方法

專利名稱：用于檢測脫氧核糖核酸酶活性的方法和制品的制作方法
用于檢測脫氧核糖核酸酶活性的方法和制品相關專利申請的交叉引用本申請要求于2009年2月沈日提交的美國臨時專利申請No. 61/155，666的權利， 將該臨時專利申請以引用方式并入本文。
背景技術：
DNA核酸酶(DNA酶)在生物細胞中普遍存在，參與許多細胞功能，包括例如DNA 復制和修復。某些微生物(例如粘膜炎布蘭漢球菌(Branhamella catarrhalis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、化月農鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、爺病鍵刀菌(Fusarium solani)能產生分泌出細胞的DNA酶。DNA核酸酶(DNA酶)被用于許多研究和診斷應用中。已開發(fā)出DNA酶活性測定法來監(jiān)測該酶。在研究應用中，DNA酶測定法常常采用放射性標記的DNA底物，并需要將反應的產物與未反應的底物分離開來，然后才對酶活性進行定量。Tolim和Myers開發(fā)了基于 DNA染料配體的差異熒光輸出的連續(xù)DNA酶測定法(Nuc. Acid Res. 31 :elll，2003)。他們的測定法需要分光熒光計來檢測DNA酶活性。DNA核酸酶已被用于檢測會將該酶分泌到細胞或細胞集落周圍環(huán)境中的微生物， 如金黃色葡萄球菌。包含營養(yǎng)物、瓊脂和如下指示劑系統(tǒng)的培養(yǎng)基已被用于檢測金黃色葡萄球菌，所述指示劑系統(tǒng)包含DNA (通常為高分子量的DNA或大的寡核苷酸)以及100 μ g/ mL甲苯胺藍0或50μ g/mL甲基綠。培養(yǎng)方法通常需要費力的程序來制備瓊脂，而瓊脂一旦制備必須在相對較短時間內使用。因此對于用來檢測DNA酶活性和檢測能產生DNA酶的微生物的穩(wěn)定制品及簡單低廉的方法存在著需求。

發(fā)明內容
鑒于當前用來檢測DNA酶活性的一般方法需要復雜的技術和/或昂貴的設備，本發(fā)明包括可用低成本的成像系統(tǒng)來執(zhí)行的簡單方法。在一些實施例中，本發(fā)明方法提供DNA 酶活性的定量或半定量測定。在一些實施例中，本發(fā)明方法提供微生物的定量或半定量測定。另外，本發(fā)明包括用來檢測產DNA酶微生物的簡單廉價的制品和方法。本發(fā)明人已觀察到，在本領域通常使用的甲基綠濃度下，一些產DNA酶微生物的生長會被顯著抑制。 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了使用出乎意料地低的濃度的甲基綠來檢測產DNA酶微生物的方法。較低濃度的染料使得產DNA酶微生物可更好地生長，和/或使得產DNA酶微生物可從環(huán)境脅迫或代謝脅迫中更好地恢復過來，從而使得可更快地檢測產DNA酶微生物。另外，通過使用成像系統(tǒng)和通過對用來采集、分析和/或顯示圖像的光的波長進行偏置，本發(fā)明方法提供更簡單、更早期和更一致的DNA酶活性檢測。
因此，在一個方面，本發(fā)明提供檢測微生物的方法。該方法可包括提供干組合物和懷疑含有微生物的樣品。該干組合物可包含冷水可溶性膠凝劑及包括甲基綠和DNA的DNA 酶指示劑系統(tǒng)。該方法可進一步包括使預定體積的包含樣品的水性液體與該干組合物接觸以形成水凝膠，將該再水化的水凝膠溫育一段時間，然后檢測微生物。在一些實施例中，該干組合物可進一步包含營養(yǎng)物、選擇劑或指示劑。在一些實施例中，該方法可進一步包括提供營養(yǎng)物、選擇劑、指示劑或者前述兩者或更多者的任意組合的步驟；其中該包含該樣品的水性液體進一步包含該營養(yǎng)物、該選擇劑、該指示劑或者前述兩者或更多者的任意組合。在一些實施例中，選擇劑可包含抗生素。在一些實施例中，抗生素選自頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳頭孢、頭孢尼西、頭孢替坦、頭孢雷特、 頭孢噻肟、頭孢泊肟普塞酯、頭孢唑肟、頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、拉氧頭孢 (moxlactam)、頭孢吡肟(cefipime)、頭孢匹羅和苯唑西林。在一些實施例中，該方法可進一步包括提供成像系統(tǒng)和用該成像系統(tǒng)獲取該水凝膠的圖像。在這些實施例中，檢測微生物可包括顯示(例如在計算機顯示器上)、打印或分析該水凝膠的圖像。在一些實施例中，該方法可進一步包括對一種或多種類型的微生物進行計數(shù)。在另一個方面，本發(fā)明提供檢測脫氧核糖核酸酶活性的方法。該方法可包括提供包含DNA酶指示劑系統(tǒng)(其包括甲基綠和DNA)的水凝膠以及懷疑含有脫氧核糖核酸酶活性的離散來源(discrete source)的樣品。甲基綠在該水凝膠中可占至少約5 μ g/mL至不超過49 μ g/mL。該方法還可包括使該樣品與該水凝膠接觸預定的時間段，然后檢測脫氧核糖核酸酶活性。在另一個方面，本發(fā)明提供檢測脫氧核糖核酸酶活性的方法。該方法可包括提供包含DNA酶指示劑系統(tǒng)(其包括甲基綠和DNA)的水凝膠、懷疑含有脫氧核糖核酸酶活性的離散來源的樣品以及成像系統(tǒng)。該方法還可包括使該樣品與該水凝膠接觸預定的時間段。 該方法還可包括用該成像系統(tǒng)獲取該水凝膠的圖像和檢測脫氧核糖核酸酶活性的離散來源，其中檢測脫氧核糖核酸酶活性包括顯示、打印或分析該水凝膠的圖像。在任何上述實施例中，該水凝膠可進一步包括營養(yǎng)物、選擇劑、抗生素和/或指示劑。在任何上述實施例中，該方法可進一步包括提供營養(yǎng)物、選擇劑、指示劑或者前述兩者或更多者的任意組合的步驟；其中接觸預定的時間段包括使該樣品和該水凝膠與該營養(yǎng)物、該選擇劑、該指示劑或者前述兩者或更多者的任意組合接觸。在任何上述實施例中，選擇劑可包含抗生素。在任何上述實施例中，抗生素選自頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳頭孢、頭孢尼西、頭孢替坦、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢泊肟普塞酯、頭孢唑肟、頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、拉氧頭孢、頭孢吡肟、頭孢匹羅和苯唑西林。在任何上述的包括成像系統(tǒng)的實施例中，該成像系統(tǒng)可包括照明源，該獲取該水凝膠的圖像的步驟可包括照明該水凝膠。在任何上述的包括成像系統(tǒng)的實施例中，照明該水凝膠可包括用有限波段的可見光波長照明該水凝膠。在任何上述的包括成像系統(tǒng)的實施例中，該水凝膠可用選自約625nm至約740nm范圍內的波長的可見光波長進行照明。在任何上述的包括成像系統(tǒng)的實施例中，獲取該制品的圖像可包括使用偏置濾波器來照明該水凝膠或者來采集該圖像。在任何上述的包括成像系統(tǒng)的實施例中，分析該圖像可包括分析選定波長的該圖像。在另一個方面，本發(fā)明提供檢測制品。該檢測制品可包括主體構件，該主體構件包括具有上表面和下表面的自支撐防水基材。包含冷水可溶性膠凝劑和DNA酶指示劑系統(tǒng)的干涂層可均勻地粘附至該主體構件的至少一個表面的一部分上。該DNA酶指示劑系統(tǒng)可包含DNA和甲基綠。在一些實施例中，在與預定體積的液體接觸后，該膠凝劑可形成水凝膠， 在該水凝膠中甲基綠的濃度為至少約5 μ g/mL至約100 μ g/mL。在一些實施例中，該涂層還可包含營養(yǎng)培養(yǎng)基、指示劑、選擇劑或前述兩者或更多者的任意組合。在一些實施例中，該選擇劑可對金黃色葡萄球菌的生長具有選擇作用。在一些實施例中，該選擇劑可包含抗生素。在一些實施例中，抗生素選自頭孢噻吩、頭孢唑啉、 頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳頭孢、頭孢尼西、頭孢替坦、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢泊肟普塞酯、頭孢唑肟、 頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、拉氧頭孢、頭孢吡肟、頭孢匹羅和苯唑西林。在另一個方面，本發(fā)明提供試劑盒。該試劑盒可包括檢測制品，該檢測制品包含干涂層，該干涂層包含冷水可溶性膠凝劑、DNA和甲基綠。在一些實施例中，該檢測制品可進一步包含營養(yǎng)物、選擇劑、指示劑或前述兩者或更多者的任意組合。在一些實施例中，該試劑盒可進一步包含抗生素。詞語“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”指在某些情況下，可提供某些有益效果的本發(fā)明實施例。然而，在相同的情況或其它情況下，其它實施例也可能是優(yōu)選的。此外，對一個或多個優(yōu)選實施例的表述并不暗示其它實施例是不可用的，且并非意圖將其它實施例排除在本發(fā)明范圍之外。本文所用的“一種(個)”、“所述(該)”、“至少一種(個)”以及“一種(個)或
多種(個)”可互換使用。因此，例如，懷疑含有“一種”微生物的樣品可被解釋為意指該液體可包含“一種或多種”微生物。術語“和/或”意指所列要素的一個或全部，或所列要素的任何兩個或更多個的組
I=I O本文通過端點表述的數(shù)值范圍包括該范圍內的所有數(shù)值(比如，1-5包含1、1.5、 2,2.75,3,3. 80、4、5 等)。本發(fā)明的上述發(fā)明內容并非意圖描述本發(fā)明的每個公開的實施例或每種實施方式。以下具體實施方式
更具體地舉例說明了示例性實施例。在本專利申請全文的幾處，通過例子列表提供指導，可以不同組合使用這些例子。在每一種情況下，所引用的列表均僅用作一個代表性的組，不應被理解為是排他性列表。


本發(fā)明將結合下面所列的附圖進行進一步的闡述，其中在幾個視圖中相同的結構由相同的數(shù)字指代。圖1是包括隔離物的薄膜培養(yǎng)裝置的一個實施例的頂部透視圖(局部剖視)。圖2是包括網格圖案的自支撐基材的一個實施例的頂視圖。圖3是薄膜培養(yǎng)裝置的一個實施例的頂部透視圖(局部剖視)。
圖4是包括隔離物的薄膜培養(yǎng)裝置的一個實施例的頂部透視圖(局部剖視)。圖5是根據本發(fā)明的具有隔離物的檢測制品的一個實施例的頂部透視圖(局部分解圖)。圖6是根據本發(fā)明的檢測系統(tǒng)的一個實施例的框圖。圖7a是用綠色發(fā)光二極管照明的PETRIFILM板的黑白圖像的示圖，其中所關注的選定區(qū)域由線條A表示。圖7b是位于圖7a的線條A上的像素的像素強度數(shù)據的曲線圖。圖8a是用紅色發(fā)光二極管照明的PETRIFILM平板的黑白圖像的示圖，其中所關注的選定區(qū)域由線條A表示。圖8b是位于圖8a的線條A上的像素的像素強度數(shù)據的曲線圖。
具體實施例方式在詳細說明本發(fā)明的任何實施例之前，應當理解，本發(fā)明并不將其應用局限于以下描述所提及的或附圖所示出的具體構造和組件布置方式。本發(fā)明能有其他的實施例，并且能夠以多種方式進行實踐或實施。另外應該理解的是，本文中所用的用語和術語的目的是為了進行說明，不應被認為是限制性的。本文的“包括”、“包含”、“含有”或“具有”及其變型的使用旨在涵蓋隨后所列的項及其等同物以及附加項。除非指明或另外限定，否則術語“支承”和“連結”及其變型按廣義使用，均涵蓋直接和間接的支承和連結。應理解，其他的實施例也可采用，且可在不偏離本發(fā)明范圍的情況下作出結構變化或邏輯變化。另外，諸如“前部”、“后部”、“頂部”和“底部”等之類的術語僅用于描述相對于彼此的元件，而絕非旨在細述設備的特定取向、指示或暗示必需或必要的設備的取向或者指定在使用中將要如何使用、安裝、顯示或布置本文描述的本發(fā)明。本發(fā)明整體涉及用于檢測和區(qū)分樣品中的微生物的方法和制品。具體而言，本發(fā)明涉及產DNA酶微生物的檢測和區(qū)分。在一些實施例中，本發(fā)明公開的方法和制品可用于檢測能產生被稱為耐熱核酸酶(TNA酶)的熱穩(wěn)定性DNA酶的微生物。在一些實施例中，產 DNA酶微生物的檢測包括對樣品中的產DNA酶微生物進行計數(shù)。合適的樣品可獲自或源自多種來源。術語“來源”通常用來指需要測試微生物的食物或非食物。來源可以是固體、液體、 半固體、凝膠狀材料及其組合。在一些實施例中，來源可由捕集元件提供，該捕集元件用于例如從所關注的表面或者從空氣采集該來源。在一些實施例中，液體組合物可包括捕集元件，該捕集元件可進一步被破碎分開(例如在攪動或溶解過程中)以增強該來源和任何所關注的微生物的回收。所關注的表面可包括多個表面的至少一部分，所述表面包括但不限于墻壁(包括門在內)、地板、天花板、排水溝、冷卻系統(tǒng)、導管(例如空氣導管)、通風孔、盥洗室座位、把手、門把手、欄桿、床欄桿(例如在醫(yī)院中)、工作臺面、桌面、用餐表面(例如盤子、碟子等)、工作表面、設備表面、服裝等，以及它們的組合。該來源的全部或一部分可用于該方法中。當使用該來源的一部分時，這有時可以稱作該來源的“樣品”。但是，術語“樣品”在本文中一般用來指從該來源獲取并被引入到培養(yǎng)板裝置中以進行微生物檢測的那部分材料體積或質量。術語“食物”通常用于指固體、液體(例如，包括但不限于溶液、分散體、乳狀液、懸浮液等以及它們的組合)和/或半固體可食用組合物。食物的例子可包括(但不限于)肉類、家禽、蛋、魚、海鮮、蔬菜、水果、預加工食品(如湯、調味汁、糊)、谷物產品(如面粉、谷類食物、面包)、罐裝食物、奶、其他乳制品(如奶酪、酸奶、酸奶油)、脂肪、油類、甜點、調味品、 香料、面食、飲料、水、動物飼料、其他合適的可食用材料以及它們的組合。術語“非食物”通常用于表示不在“食物”定義之內且通常認為不可食用的所關注的源。非食物來源的例子可包括但不限于臨床樣品、細胞裂解物、全血或其部分(例如血清)、其他體液或分泌物(例如唾液、汗液、皮脂、尿液)、糞便、細胞、組織、器官、活組織切片、植物材料、非飲用水、木材、土壤、沉淀物、藥品、化妝品、膳食補充劑(例如人參膠囊)、 醫(yī)藥品、傳染體、其他合適的非可吃材料以及它們的組合?！皹悠帆@取裝置”在本文中以最廣義的含義使用，指用來收集液體、半固體或固體樣品材料的器具。樣品獲取裝置的非限制性例子包括拭子、擦拭物、海綿、勺子、刮刀、壓舌板、過濾器、移液管、移液管頭和虹吸管。術語“傳染體”通常用于指能夠攜帶和/或傳播傳染性有機體的無生命物體或基質。傳染體可包括(但不限于)布、拖把頭、毛巾、海綿、抹布、餐具、硬幣、紙幣、手機、衣物 (包括鞋子)、門把手、女性用品、尿布等以及它們的部分或它們的組合。術語“微生物”通常用來指任何能夠在培養(yǎng)基中生長和繁殖的用顯微鏡可見的原核或真核生物體，包括但不限于細菌(例如運動型細菌、細菌營養(yǎng)體、革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌)、細菌孢子或內生孢子、真菌(例如酵母、絲狀真菌、真菌孢子)中的一者或多者。在一些情況下，特別要關注的微生物是病原性的那些，術語“病原體”用于指任何病原微生物。病原體的例子可包括但不限于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的成員，或者微球菌科(Micrococcaceae)的成員，或者以下各屬葡萄球菌屬Staphylococcus spp.)、鏈球菌屬(Streptococcus spp. )、{段單胞桿菌屬(Pseudomonas spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、夕少門氏菌屬(Salmonella spp.)、軍團菌屬(Legionella spp.)、志賀氏菌屬 (Shigella spp.)、耳口爾森氏菌屬(Yersinia spp.)、腸桿菌屬(Enterobacter spp.)、埃希氏菌屬(Escherichia spp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)、李斯特菌屬(Listeria spp.)、 彎曲桿菌屬(Campylobacter spp·)、不動桿菌屬(Acinetobacter spp·)、弧菌屬(Vibrio spp·)、梭菌屬(Clostridium spp.)和棒桿菌屬(Corynebacteria spp·)。病原體的具體例子可包括(但不限于)大腸桿菌，其包括腸出血性大腸桿菌例如血清型0157:H7、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、賭狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)、粘膜炎布蘭漢球菌(Branhamella catarrhalis)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、小腸結腸炎耳口爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、艱難梭菌(Clostridium difficile、耐萬古霉素腸球菌 (Enterococcus)、化膿性鏈球菌、粘質沙雷氏菌和阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)。 可能影響微生物生長的環(huán)境因素可包括營養(yǎng)物質存在與否、PH值、含水量、氧化-還原電位、抗微生物化合物、溫度、大氣氣體組成和生物結構或屏障。DNA酶指示劑系統(tǒng)
本發(fā)明的制品和方法包括DNA酶指示劑系統(tǒng)。該DNA酶指示劑系統(tǒng)包含DNA和甲基綠。任選地，該指示劑系統(tǒng)可進一步包含粘合劑如λ-角叉菜膠和/或緩沖劑。在使用時，將該DNA酶指示劑系統(tǒng)與膠凝劑如瓊脂或冷水可溶性膠凝劑(例如瓜耳膠、黃原膠、刺槐豆膠以及它們的組合)進行混合。在一些實施例中，將與膠凝劑混合的該DNA酶指示劑系統(tǒng)如本文所述涂覆在基材上。甲基綠與DNA分子形成穩(wěn)定的復合物。當甲基綠復合的DNA解聚(例如通過酶促水解)時，甲基綠變成無色的。Smith等人(1969. Appl. Microbiol. ,18 991)證明產DNA酶細菌可在含有DNA和甲基綠的微生物培養(yǎng)基中檢測到。該指示劑系統(tǒng)中的DNA通常容易商購獲得(例如，鮭精DNA可獲自 Sigma-Aldrich, St. Louis，M0)，且可以是任何具有足夠分子量的DNA，使得它能夠與甲基綠形成綠色的復合物。甲基綠的鹽形式(例如甲基綠氯化鋅鹽)可用于該指示劑系統(tǒng)，且可獲自例如 Sigma-Aldrich (St. Louis)。培養(yǎng)裝置本發(fā)明包括用于DNA酶活性的檢測的制品。該檢測制品包括用于生長和檢測微生物的培養(yǎng)裝置。本發(fā)明的培養(yǎng)裝置包括例如薄膜培養(yǎng)板裝置。薄膜培養(yǎng)板裝置通常比傳統(tǒng)的瓊脂平皿更加緊湊，且通常含有干燥的可再水化的培養(yǎng)基以支持某些微生物的生長。薄膜培養(yǎng)板裝置的非限制性例子包括美國專利No. 4，565，783、No. 5，089，413和 No. 5，681，712中公開的帶涂層基材裝置；將所述專利中每一個都以引用方式全文并入本文。圖1示出根據本發(fā)明的薄膜培養(yǎng)裝置的一個實施例。培養(yǎng)裝置110包括主體構件， 該主體構件包括具有上下表面(分別為11 和112b)的自支撐防水基材112。基材112 可為相對堅硬的膜(例如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯)，該膜不會吸水或者以別的方式被水影響?；?12可為透明的或不透明的，這取決于是否想要透過該基材觀察細菌菌落。為有利于細菌菌落的計數(shù)，基材212可在其上印刷有網格圖案(例如方格)，如圖2中所示。參見圖1，基材112可在其上表面11 上涂覆有一層粘合劑114，該粘合劑的作用是將干膠凝劑、DNA酶指示劑系統(tǒng)和/或營養(yǎng)物以均勻單層的形式保持以便容易水化。粘合劑114應以優(yōu)選小于粉末化膠凝劑和/或營養(yǎng)物的粒子直徑的厚度涂覆到基材112上。目的是施加足夠的粘合劑以將粒子粘附到基材，但又不太多而造成粒子完全嵌在粘合劑中。 冷水可溶性粉末的均勻單層116是所期望的，其表面積充分暴露以便水化。圖1中還示出了可任選的在覆蓋片122上的粘合劑層114'和冷水可溶性粉末層116'。當用水溶液(例如該樣品和/或含水助懸介質，如水或緩沖液)進行水化時，膠凝劑形成水凝膠。在一些實施例中，粘合劑114可包含水基粘合劑組合物。優(yōu)選地，水基粘合劑層 114當被含水測試樣品濕潤時充分透明，以使得能夠觀察微生物菌落。該水基粘合劑組合物可摻入一種或多種親水劑，包括營養(yǎng)物、選擇劑、指示劑(例如DNA酶指示劑系統(tǒng)、酶底物、 染料)或者它們的組合。本領域技術人員參考本說明書，根據所要培養(yǎng)和/或選擇性檢測 (例如染色)或抑制的具體微生物，將顯而易見地知道水基粘合劑組合物中使用的具體營養(yǎng)物和/或選擇劑。示例性的一類有用的選擇劑包括這樣的染料，其可被生長中的微生物代謝或者以其他方式與生長中的微生物反應，由此造成微生物菌落被著色或者發(fā)熒光，以易于由技術人員或由自動讀數(shù)器檢測和/或定量。這種染料的非限制性例子包括氯化三苯基四唑、對甲苯基四唑紅、四唑紫、藜蘆基四唑藍、中性紅、酚紅、氯酚紅和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸二鈉鹽。但是應認識到，取決于所要鑒定的具體生物體，也可使用其他合適的染料。本領域普通技術人員會認識到，任何根據本發(fā)明使用的指示劑、染料、選擇劑、酶底物或營養(yǎng)物不應實質上抑制DNA酶活性，也不應實質上干擾本文所述的DNA酶指示劑系統(tǒng)的觀察和成像。可采用緩沖試劑如碳酸鈉來提供顯示中性pH的培養(yǎng)基，并可采用“Cab-0-Sil M-5”作為加工助劑，如美國專利No. 4，565，783中所描述，將該專利以引用方式全文并入本文。當然，可根據所要培養(yǎng)的微生物的類型，對用于粉末116的具體涂層混合物(例如營養(yǎng)物、指示劑和/或膠凝劑)加以調整。設想到，本發(fā)明的制品可包括區(qū)分性指示劑。本文所用的“區(qū)分性指示劑”指添加到培養(yǎng)基中的會指示某些微生物的存在而不會指示其他微生物的存在的試劑。區(qū)分性指示劑的非限制性例子包括染料(例如著色劑、PH指示劑、氧化還原指示劑)、酶底物(例如磷酸酶、糖苷酶、肽酶、核酸酶、脂肪酶等的發(fā)色底物或熒光底物)以及當被某些微生物代謝時會產生可檢測的反應(例如與菌落相關的PH變化)的特定營養(yǎng)物(例如發(fā)酵性碳水化合物、氨基酸)。在一些實施例中，可將一種或多種區(qū)分性指示劑在涂覆到基材上的水基組合物中添加至薄膜培養(yǎng)裝置。在一些實施例中，可將一種或多種區(qū)分性指示劑添加至液體樣品，然后液體樣品加到培養(yǎng)裝置。在一些實施例中，可在培養(yǎng)裝置進行水化后，將一種或多種區(qū)分性指示劑加至培養(yǎng)裝置。涉及到使用加至水化后的培養(yǎng)裝置的區(qū)分性指示劑的方法的一個例子是其中將用于檢測耐熱核酸酶的制品加到溫育后的培養(yǎng)裝置的方法，如美國專利 No. 6，022，682中所述，將該專利以引用方式全文并入本文。在本發(fā)明范圍內還設想到，粉末116可任選包括為執(zhí)行某些用于微生物鑒定的生化測試所必需的試劑。這種在特定類型的微生物存在下發(fā)生顏色變化的試劑(例如酶底物)可包括在粉末116或粘合劑114中。在本發(fā)明的另一個實施例中，粉末116可包含這樣的涂層，其包括膠凝劑和營養(yǎng)物的混合物、選擇劑和/或指示劑，其已被溶解或懸浮于溶液中，涂覆并干燥到基材112上。 在這個實施例中，涂層實質上是無水的(即涂層一旦被允許與周圍環(huán)境平衡，其水分含量不超過大約脫水涂層的水分含量)。如圖1所示，主體構件可包括施加到基材112的上表面的隔離物118，該隔離物 118包括在中部切穿以暴露基材112上的粉末116的圓形孔120。孔120的壁提供預定大小和形狀的槽以限定水化后的培養(yǎng)基。隔離物118應足夠厚以形成所需體積的槽，例如1、 2或3毫升。聚乙烯閉孔泡沫塑料是隔離物118的優(yōu)選材料，但也可使用任何疏水性(非濕潤性)、對微生物惰性且能夠承受滅菌的材料。在一些實施例中(未顯示)，隔離物118可包括多個孔20(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20個孔)，每個孔可接種上不同的液體樣品。隔離物118可包括相對較厚的設計，如美國專利No. 5，681，712中所述的那些設計，將該專利以引用方式全文并入本文。較厚的帶孔隔離物118的一個目的是對布置在隔離物118的孔120中的膜(例如微孔過濾膜)(未顯示)進行定位和保護。較厚的隔離物 118的另一個目的是為了減少或防止覆蓋片122與生長中的微生物集落的接觸(即提供生長表面和覆蓋片122之間的“頂部空間”，這還可使得對生長中的微生物菌落的通氣增加)。隔離物118的厚度應足以圍住在對培養(yǎng)裝置接種時加到該裝置的液體體積。取決于膜(當使用時)的厚度，隔離物可為至少約0. 5mm厚、約Imm厚、約1.5mm厚和約2mm厚。圖3示出了薄膜培養(yǎng)裝置310的另一個實施例。該實施例包括基材312、粘合劑 314、冷水可溶性粉末316和覆蓋片322，如圖1中所述。DNA酶指示劑系統(tǒng)可被包括在冷水可溶性粉末316中。與圖1的培養(yǎng)裝置110相反，圖3的裝置310不包括用于在接種過程中限定該樣品的隔離物?？蓪⒛０謇缂又丨h(huán)(未顯示)暫時施加到覆蓋片322的外面， 該模板在閉合后用以在冷水可溶性粉末316形成凝膠的時候將樣品限定到特定區(qū)域。在一些實施例中，裝置310可接種上多份(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20份)不同的液體樣品，使用適當?shù)母綦x物和模板來將各樣品限定到培養(yǎng)裝置310的粉末316的不同部分。當用水溶液(例如該樣品和/或含水助懸介質，如水或緩沖液)進行水化時，包含膠凝劑的冷水可溶性粉末形成水凝膠。圖4示出了根據本發(fā)明的薄膜培養(yǎng)裝置的另一個實施例410。培養(yǎng)裝置410包括主體構件411，該主體構件包括具有上下表面41 和412b的自支撐基材412。基材412在其上表面41 上涂覆有一層粘合劑414。包含一種或多種膠凝劑的冷水可溶性粉末416以薄的相對均勻的層粘附到粘合劑414。一旦接種上含水測試樣品(未顯示)，該層冷水可溶性粉末416 (其可包括DNA酶指示劑系統(tǒng))快速水化形成復水的培養(yǎng)基(未顯示)，而該培養(yǎng)基繼而能夠長出在液體接種物中或在膜(如測試樣品微生物過濾器(未顯示))的表面上存在的微生物。隔離物418部分地覆蓋基材412和覆蓋粉末416的表面，具有孔420。另外，薄膜培養(yǎng)裝置410任選包括覆蓋片422，以覆蓋在加入含水測試樣品后形成的復水培養(yǎng)基。圖4還示出了膜似6和生長在其上的微生物菌落428。在圖示的實施例中，膜似6是微孔膜，液體樣品已被濾過該膜以使樣品中的任何細菌(如果存在的話)截留在膜上。合適的微孔膜不會實質上干擾DNA酶活性或者干擾DNA酶活性與DNA酶指示劑系統(tǒng)之間的相互作用。另外，合適的微孔膜當與水凝膠接觸時是實質上透明的。如美國專利No. 5，232，838中所述，有可能在本發(fā)明的裝置中使用透氣膜層，前提條件是該透氣膜不會實質上干擾DNA酶活性或者對DNA酶活性的觀察和成像。透氣層可 “夾”在基材和冷水可溶性粉末之間，在透氣膜層的兩面上均有粘合劑涂層(未顯示)。在一個實施例中，可根據例如美國專利No. 4，565，783中所述的方法，如下制備薄膜培養(yǎng)板裝置產生液體涂覆混合物，將該液體涂覆混合物涂覆到基材上，干燥該經涂覆的基材并任選地附接覆蓋片。這個實施例的示例性裝置在圖4中示出。圖4示出了適合與本發(fā)明的培養(yǎng)基一起使用的薄膜培養(yǎng)裝置410的一個實施例。 制備該裝置的方法在美國專利No. 4，565，783中描述，將該專利以引用方式全文并入本文。薄膜培養(yǎng)裝置410包括具有自支撐防水基材412的主體構件?；?12優(yōu)選為由不會吸水的防水材料(如聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯)制成的相對剛性的材料。其他合適的防水材料包括含有防水聚乙烯涂層的基材如紙張。基材412的上表面用液體組合物涂覆， 然后進行干燥以在基材412上提供干涂層417。干涂層417包含本文所述的冷水可溶性膠凝劑，且還可包括營養(yǎng)物、選擇劑、指示劑或前述兩者或更多者的任意組合。用于產生干涂層417的液體組合物可容易地如下進行干燥將液體組合物在約220 T的烘箱中加熱，直到組合物中基本上所有水分都被蒸發(fā)掉。然而，如果在水分已蒸發(fā)后加熱組合物，則組合物的某些組分(例如營養(yǎng)物、指示劑)可能開始降解。在基材412上可涂覆一層粘合劑(未顯示)。該粘合劑可起到將干涂層417保持到基材412的作用。粘合劑當水化時應充分透明，以使得可查看在經涂覆的基材412的表面上生長的細菌菌落。該粘合劑還應以這樣的厚度涂覆在基材412上，該厚度讓該基材均勻地涂覆有干涂層417，而又不完全使涂層嵌在粘合劑中。在泡沫中具有圓形開口的泡沫隔離物418被粘附到基材412的涂覆有培養(yǎng)基的表面。覆蓋基材412的周邊的該泡沫隔離物限定出樣品要接種的區(qū)域，并起到防止樣品從基材泄漏的作用。在一個替代實施例中，裝置可不包括容納樣品的泡沫層。在這個裝置中，樣品的量只通過培養(yǎng)基的各組分被容納在基材上。覆蓋片422附接到泡沫隔離物418的上表面的邊緣。覆蓋片422優(yōu)選由透明的薄膜或片材制成，以便于計數(shù)基材上存在的細菌菌落。另外，覆蓋片422優(yōu)選對細菌和水蒸汽具有不透性，以避免各組分受污染和變質的風險。用作覆蓋片422的優(yōu)選材料是雙軸向拉伸聚丙烯。任選地，覆蓋片422可涂覆有一層粘合劑，該粘合劑可涂覆上包含膠凝劑、營養(yǎng)物、選擇劑和指示劑(例如DNA酶指示劑系統(tǒng))或前述兩者或更多者的任意組合的干燥組合物(例如粉末)(未顯示)。在使用時，將預定量的接種物(通常為約1毫升的液體接種物)加到圖4所示的裝置，加入方式是將覆蓋片向后拉，然后將含水測試樣品或水分配到干涂層417上。接種物可任選包含營養(yǎng)物、選擇劑、指示劑或前述兩者或更多者的任意組合。然后再將覆蓋片422 放回涂層417上，接種物均勻地散布在泡沫隔離物418的圓形開口內。用于此操作的簡便工具是加重的圓形模板。隨著接種物接觸涂層417并分散在該涂層上，涂層發(fā)生水化而形成凝膠。凝膠中存在的營養(yǎng)物可支持微生物的生長。接著將接種了的裝置溫育預定的時間， 然后可透過透明的覆蓋片422計數(shù)生長在基材上的細菌菌落的數(shù)目。用于形成裝置410的干涂層417的涂層混合物可包含DNA酶指示劑系統(tǒng)，且任選包含培養(yǎng)基、指示試劑、選擇劑或者前述兩者或更多者的任意組合。優(yōu)選的涂層混合物，當進行涂覆、干燥和用適當體積的樣品再水化時，包含營養(yǎng)培養(yǎng)基和DNA酶指示劑系統(tǒng)，如表 1所示。^l.示鋼卜件的營吝養(yǎng)基的組成
權利要求
1.一種檢測微生物的方法，包括提供干組合物和懷疑含有微生物的樣品；其中所述干組合物包含冷水可溶性膠凝劑和DNA酶指示劑系統(tǒng)，該DNA酶指示劑系統(tǒng)包括甲基綠和DNA ；使預定體積的包含所述樣品的水性液體與所述干組合物接觸以形成水凝膠； 將所述水凝膠溫育一段時間；以及檢測微生物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中在與所述預定體積的水性液體接觸后，在所述水凝膠中甲基綠的濃度為約5 μ g/mL至約100 μ g/mL。
3.根據權利要求1所述的方法，其中在與所述預定體積的水性液體接觸后，在所述水凝膠中甲基綠的濃度為約5 μ g/mL至約60 μ g/mL。
4.根據權利要求1所述的方法，其中在與所述預定體積的水性液體接觸后，在所述水凝膠中甲基綠的濃度為約5 μ g/mL至約20 μ g/mL。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述干組合物還包含營養(yǎng)物、選擇劑或指示劑。
6.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其還包括提供營養(yǎng)物、選擇劑、指示劑或者前述兩者或更多者的任意組合的步驟；其中所述包含所述樣品的水性液體還包含所述營養(yǎng)物、所述選擇劑、所述指示劑或者前述兩者或更多者的任意組合。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其中所述選擇劑包含抗生素。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述抗生素選自頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢拉定、 頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳頭孢、頭孢尼西、頭孢替坦、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢泊肟普塞酯、頭孢唑肟、頭孢克肟、 頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、拉氧頭孢、頭孢吡肟、頭孢匹羅和苯唑西林。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，還包括 提供成像系統(tǒng)；以及用所述成像系統(tǒng)獲取所述水凝膠的圖像；其中檢測微生物包括顯示、打印或分析所述水凝膠的圖像。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，還包括對一種或多種類型的微生物進行計數(shù)。
11.一種檢測脫氧核糖核酸酶活性的方法，包括 提供包含DNA酶指示劑系統(tǒng)的水凝膠，所述DNA酶指示劑系統(tǒng)包括甲基綠和DNA，其中在所述水凝膠中甲基綠的濃度為至少約5 μ g/mL且小于49 μ g/mL ；和懷疑含有脫氧核糖核酸酶活性的離散來源的樣品； 使所述樣品與所述水凝膠接觸預定的時間段；以及檢測脫氧核糖核酸酶活性的離散來源。
12.—種檢測脫氧核糖核酸酶活性的方法，包括 提供包含DNA酶指示劑系統(tǒng)的水凝膠，所述DNA酶指示劑系統(tǒng)包括甲基綠和DNA ；懷疑含有脫氧核糖核酸酶活性的離散來源的樣品；和成像系統(tǒng)；使所述樣品與所述水凝膠接觸預定的時間段；用所述成像系統(tǒng)獲取所述水凝膠的圖像；以及檢測脫氧核糖核酸酶活性的離散來源，其中檢測脫氧核糖核酸酶活性包括顯示、打印或分析所述水凝膠的圖像。
13.根據權利要求12所述的方法，其中在所述水凝膠中甲基綠的濃度為至少約5μ g/ mL 至約 100μ g/mL。
14.根據權利要求11-13中任一項所述的方法，其中所述脫氧核糖核酸酶活性的離散來源是微生物。
15.根據權利要求11-14中任一項所述的方法，其中所述水凝膠還包含營養(yǎng)物、選擇劑、抗生素或指示劑。
16.根據權利要求11-14中任一項所述的方法，還包括提供營養(yǎng)物、選擇劑、指示劑或者前述兩者或更多者的任意組合的步驟；其中接觸預定的時間段包括使所述樣品和所述水凝膠與所述營養(yǎng)物、所述選擇劑、所述指示劑或者前述兩者或更多者的任意組合接觸。
17.根據權利要求15或權利要求16所述的方法，其中所述選擇劑包含抗生素。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述抗生素選自頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳頭孢、頭孢尼西、頭孢替坦、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢泊肟普塞酯、頭孢唑肟、頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、拉氧頭孢、頭孢吡肟、頭孢匹羅和苯唑西林。
19.根據權利要求9至18中任一項所述的方法，其中所述成像系統(tǒng)包括照明源，且其中獲取所述水凝膠的圖像包括對所述水凝膠進行照明。
20.根據權利要求19所述的方法，其中對所述水凝膠進行照明包括用有限波段的可見光波長對所述水凝膠進行照明。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述有限波段的可見光波長選自約625nm至約 740nm范圍內的波長。
22.根據權利要求20所述的方法，其中所述有限波段的可見光波長選自約630nm至約 650nm范圍內的波長。
23.根據權利要求19所述的方法，其中對所述水凝膠進行照明包括使用偏置濾波器來照明所述水凝膠或者來采集所述水凝膠的圖像。
24.根據權利要求9至23中任一項所述的方法，還包括提供圖像分析系統(tǒng)的步驟；其中分析所述圖像包括用所述圖像分析系統(tǒng)分析所述圖像。
25.根據權利要求M所述的方法，其中分析所述圖像包括分析所述圖像的選定波長。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述選定波長在約625nm至約740nm的范圍內選擇。
27.根據權利要求25所述的方法，其中所述選定波長在約630nm至約650nm的范圍內選擇。
28.一種檢測制品，包括一種主體構件，包括具有上表面和下表面的自支撐防水基材；其中包含冷水可溶性膠凝劑和指示劑系統(tǒng)的干涂層均勻地粘附至所述主體構件的至少一個表面的一部分上，其中所述指示劑系統(tǒng)包含DNA和甲基綠。
29.根據權利要求觀所述的制品，其中在與預定體積的液體接觸后，所述膠凝劑形成水凝膠，且在所述水凝膠中甲基綠的濃度為約5 μ g/mL至約100 μ g/mL。
30.根據權利要求四所述的制品，其中在與預定體積的液體接觸后，所述膠凝劑形成水凝膠，且在所述水凝膠中甲基綠的濃度為約5 μ g/mL至約60 μ g/mL。
31.根據權利要求四所述的制品，其中在與預定體積的液體接觸后，所述膠凝劑形成水凝膠，且在所述水凝膠中甲基綠的濃度為約5 μ g/mL至約20 μ g/mL。
32.根據權利要求觀-31中任一項所述的制品，其中所述涂層還包含營養(yǎng)培養(yǎng)基、指示劑、選擇劑或者前述兩者或更多者的任意組合。
33.根據權利要求32所述的制品，其中所述選擇劑對金黃色葡萄球菌的生長具有選擇作用。
34.根據權利要求33所述的制品，其中所述選擇劑選自頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢呋辛乙酰氧乙酯、氯碳頭孢、頭孢尼西、頭孢替坦、頭孢雷特、頭孢噻肟、頭孢泊肟普塞酯、頭孢唑肟、頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、拉氧頭孢、頭孢吡肟、頭孢匹羅和苯唑西林。
35.一種試劑盒，包括具有干涂層的檢測制品，所述干涂層包含冷水可溶性膠凝劑、DNA 和甲基綠。
36.根據權利要求35所述的試劑盒，其中所述檢測制品還包含營養(yǎng)物、選擇劑、指示劑或者前述兩者或更多者的任意組合。
37.根據權利要求35或36所述的試劑盒，還包含抗生素。
全文摘要
本發(fā)明提供可用于檢測DNA酶活性的離散來源的制品和方法。可檢測出產DNA酶微生物。所述裝置還可包括用于區(qū)分微生物群體或種類的選擇劑和/或指示劑。使用方法包括檢測或計數(shù)產DNA酶微生物。
文檔編號C12Q1/14GK102333884SQ201080009588
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月22日 優(yōu)先權日2009年2月26日
發(fā)明者帕特里克·A·瑪奇, 米歇勒·L·羅索爾, 邁克爾·E·休斯 申請人:3M創(chuàng)新有限公司