專利名稱：綴合物分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及兩個或多個基團與一個或多個標記綴合的化合物，所述的基團能夠充當具有過氧化物酶活性的酶的底物。使用很多用于檢測和顯影此類靶的實驗方法，例如免疫組織化學(IHC)、原位雜交(ISH)、ELISA、DNA印跡、RNA印跡和蛋白質印跡等，本發明的綴合物分子可用于檢測樣品中的分子靶，例如生物分子或化學分子、分子結構等。本發明也涉及包含綴合物分子的組合物。
背景技術：
使用可檢測標記物檢測樣品中的生物或化學靶標是作為許多生物學檢測方法，包括醫學診斷方法核心的方法。在某些情況下，所述靶標可以是特定的多核苷酸序列或基因、 基因突變、基因表達模式，在原位或提取或分離后，在DNA或RNA水平被檢測。在其他情況下，該靶可以是肽，蛋白質，抗原，或其他物質，再次在原位或在分離或實驗室操作后被檢測。所述靶也可以是有機來源的顆粒或殘片。許多標準的檢測方法，例如IHC、ISH、ELISA、印跡法等，使用標記方法來檢測想要的靶。通常，這些方法包括孵育潛在含有可檢測靶的實驗樣品與探針，隨后用可以產生例如顏色、熒光信號或放射性的可檢測標記物檢測結合劑與靶之間的結合。一個或多個結合劑分子可以與各個靶結合，取決于所采用方法的具體情況。在一些情況下，尤其當靶以低濃度存在時，通過添加一個或多個放大層至該系統放大來自靶-結合劑復合物的信號是必須的。例如，如果結合劑是識別靶的第一抗體，則可以添加識別第一抗體的第二抗體，從而許多個第二抗體與每個第一抗體結合。如果第二抗體與可檢測標記物如熒光團或生色團連接，則通過放大作用，樣品中的每個靶分子可以有效地與多個熒光團或生色團，而不是僅一個或幾個熒光團或生色團結合。因此，該靶會在放大后產生更強的檢測信號。然而，一些檢測實驗具有產生相對類似彌散信號的傾向，尤其如果允許樣品在分析之前停留一段時間。例如，與一個靶結合的一個或多個結合劑和/或可檢測標記物可以隨時間緩慢地彌散脫離靶或彼此脫離。在一些情況下，影響靶、結合劑和放大層的結合親和力的緩沖液變化也可以造成信號彌散。許多可檢測的標記物通過非共價性相互作用，如蛋白-配體結合作用或多核苷酸雜交，與靶結合。標記后的緩沖液變化可以降低靶、結合劑與可檢測標記物之間的親和力，造成多種組分解離。經歷一段時間如幾日的簡單彌散也可以造成靶、結合劑與可檢測標記物之間的解離，使得信號彌散。與現有可用的檢測方法、尤其免疫檢測相關的其他問題是時間消耗。處理樣品通常至少花費1至3小時，從標記靶至檢測該標記物的步驟。現有技術僅描述了能夠克服上述問題的極少技術，但仍只是部分地克服。此類技術的一個例子是在 US 5，863，748 ；5，688，966 ；5，767，287 ；5，731，158 ；5，583，001 ； 5，196，306 ；6, 372，937或6，593，100中描述的催化綴合物沉淀(CARD)法。該方法利用所謂的“分析物依賴性酶活化系統，，(ADEAQ來催化可檢測標記物沉積到分析平臺的固相上。 在此分析模式下，由ADEAS所包含的酶與綴合物反應，所述的綴合物包含對該酶特異的可檢測標記的底物。當酶和綴合物反應時，形成活化的綴合物，其在針對活化綴合物的特異性受體被固定的位點處共價地沉積。故而，因為綴合物包含標記物，故該綴合物發揮了指示靶在位點存在的綴合物的作用。可以直接或間接地檢測酶促沉積的標記物。該方法導致信號放大和改善的檢測限。CARD方法可以在這樣的分析模式中使用，其中待檢測的靶是固定在固體支持物， 例如膜上的受體。這樣的分析模式包括夾心免疫測定法和基于膜的核酸雜交測定法。CARD 方法也適用于例如通過免疫組織化學法(IHC)檢測生物學靶，如US 6，593，100中所述。US 6，593，100中所述的方法利用了辣根過氧化物酶(HRP)與包含HRP底物的標記綴合物在增強物存在下的反應。HRP底物和增強物均是酚的衍生物。一旦與HRP反應，HRP底物被活化并且與樣品的受體位點結合，其中所述的受體位點一般由蛋白質的低豐度芳族氨基酸殘基代表。盡管與許多其他目前可用的方法，尤其免疫組織化學檢測靶的方法相比較，CARD 方法具有檢測樣品中靶分子相對良好的靈敏度，但是CARD方法沒有完全解決其他方法的問題，例如強烈的背景染色、靈敏度仍然不夠和耗時，這在染色前未正確處理組織標本或靶標表達低水平的情況下，影響該方法。近來，已經描述另一種允許檢測IHC樣品中低豐度靶分子的基于HRP的放大方法 (W02009036760)。該方法不利用DAB作為HRP的生色底物，而利用其作為其他HRP底物的交聯劑。根據W02009036760，DAB介導了 HRP介導的其它HRP底物的沉積，其本身不是沉積的DAB，即在所述沉積條件下，沒有特征性可見的褐色沉積物形成。其他HRP底物的沉積物是可檢測的，原因是它們包含與HRP底物分子結合的可檢測標記物，例如可以在沉積步驟后的步驟中檢測到它們。該方法提供了沉積的HRP底物的信號的強烈放大，這使該方法的靈敏度與CSA方法可比較，但是與后一種方法相比較，新方法有益地不產生背景標記。在這種新方法的其他優勢當中，值得指出的是該檢測方法的速度比傳統的DAB或生物素-酪氨酰胺檢測方法快得多。發明簡述本發明涉及可以有益地改善對靶分子，尤其包含過氧化物酶活性的靶分子檢測的化合物和組合物。尤其，本發明的化合物和組合物改善了通過W02009036760中所述的方法進行的檢測，從而獲得了更快、更靈敏和更精確的靶分子檢測。在一個方面，本發明涉及包含水溶性聚合物的水溶性綴合物分子，所述的水溶性聚合物包含至少30個互連原子的直鏈，其中所述聚合物以至少一個可檢測標記物和至少兩個能夠充當過氧化物酶底物的基團綴合，其中所述至少一個可檢測標記物和所述至少兩個基團以相應于至少30個互連原子的鏈間距彼此隔開，其中過氧化物酶底物的任意兩個基團之間的距離少于具有30個互連原子的鏈。在一個方面，本發明涉及水溶性綴合物分子，其包含(i) 一種或多種可檢測物質，(ii)至少2種物質，每種均能夠充當具有過氧化物酶活性的酶的底物，其中標記物(i)和過氧化物酶底物基團(ii)不是相同的化學物質；其中標記物(i)和過氧化物酶底物基團(ii)通過接頭連接在一起，其中所述的接頭是包含至少一條具有至少30個連續連接原子的直鏈的化合物，其中所述原子直鏈含有至少2 個以至少30個連續連接原子的間距分開的分枝點；其中標記物(i)和過氧化物酶底物基團(ii)在綴合物分子中被至少30個連續連接的原子分隔，并且其中2個相鄰的過氧化物酶底物基團被少于30個連續互連的原子彼此分開。在一個實施方式中，能夠充當具有過氧化物酶活性的酶底物的基團具有以下通式
權利要求
1.一種水溶性綴合物，其包含 (i) 一種或多種可檢測物質，( )至少兩種物質，每種均能夠作為具有過氧化物酶活性的酶的底物，其中標記物 (i)和過氧化物酶底物基團(ii)不是相同的化學物質； 其中標記物(i)和過氧化物酶底物基團(ii)通過接頭連接在一起，其中所述接頭是包含至少一條具有至少30個連續連接原子的直鏈的化合物，其中所述直鏈含有以至少30個連續連接原子的間距分隔的至少兩個分枝點； 其中標記物(i)和過氧化物酶底物基團(ii)在綴合物分子中被至少30個連續連接的原子分隔，并且其中兩個相鄰的過氧化物酶底物基團通過少于30個連續連接的原子彼此分隔。
2.根據權利要求1所述的綴合物，其中能夠作為具有過氧化物酶活性的酶的底物的基團具有下式其中R1 是-H、-O-X, N (X) 2 或-S-X ； R2 是-H、-O-X、-N (X) 2 或-S-X ； R3 是-H、-OH、-NH2 或-SH ； R4 是-H、-O-X、-N (X) 2 或-S-X ； R5 是-H、-O-X、-N (X) 2 或-S-X ； R6 是-CON (X) 2或 CO-X ； 其中H是氫；0是氧，S是硫，N是氮，并且X是H、烷基或芳基。
3.根據權利要求2所述的綴合物，其中所述基團是阿魏酸、肉桂酸、氨基肉桂酸、咖啡酸、或芥子酸的殘基。
4.根據權利要求1所述的綴合物，其中至少兩個能夠作為過氧化物酶底物的基團是酪氨酸殘基。
5.根據權利要求1、2、3或4所述的綴合物，其中能夠作為過氧化物酶底物的基團的數目是從2至4。
6.根據權利要求1、2、3、4或5所述的綴合物，其中至少一條直鏈是包含下式2至10個重復的聚合物其中禮和&選自NH和0，并且R3選自甲基、乙基、丙基、CH2OCH2和(CH2OCH2) 2，其中不超過三個連續重復的乙氧基。
7.根據權利要求1至6任一項所述的綴合物，其中綴合物包括2-4個能夠作為過氧化物酶底物的基團和1個可檢測標記物，所述基團和標記物通過一個線型聚合物彼此連接， 其中所述基團和所述標記物與該聚合物的兩個分枝點連接，所述兩個分枝點被聚合物鏈的至少30個連續連接原子彼此分隔。
8.根據權利要求1至6任一項所述的綴合物，其中接頭包含葡聚糖聚合物和至少一個第一線型聚合物和至少一個第二線型聚合物，其中所述至少一個第一聚合物與二至四個能夠作為過氧化物酶底物的基團綴合，并且其中至少一個所述第二聚合物與一個或多個可檢測標記物綴合，并且其中所述至少一個第一聚合物和至少一個第二聚合物與葡聚糖綴合。
9.根據權利要求8所述的綴合物，其中至少一個第二聚合物包含兩個或多個標記物， 其中所述兩個或多個標記物各自之間的分子距離是至少30個連續連接的原子。
10.根據前述權利要求任一項所述的綴合物，其中可檢測標記物是熒光物質或是特異性結合對的成員。
11.根據前述權利要求任一項所述的綴合物，其中具有過氧化物酶活性的酶是辣根過氧化物酶。
12.—種組合物，包含根據權利要求1至10任一項所述的綴合物。
13.一種用于檢測樣品中具有過氧化物酶活性的靶的成套試劑盒。
14.一種檢測樣品中具有過氧化物酶活性的靶的方法，包括III.在水溶液中孵育推測包括具有過氧化物酶活性的靶的樣品，所述水溶液包含e)根據權利要求1至10任一項所述的綴合物，f)3，3’ - 二氨基聯苯胺，和g)過氧化物化合物，從而形成綴合物沉淀；IV.檢測樣品中化合物的沉淀，從而檢測樣品中過氧化物酶活性。
15.根據權利要求14所述的方法，其中水溶液⑴包含多于5mM過氧化氫和0.25mM與 6mM之間的3，3 ’ - 二氨基聯苯胺。
16.根據權利要求14所述的方法，其中3，3’- 二氨基聯苯胺的量在1. 5mM以上。
17.根據權利要求14所述的方法，其中過氧化物酶活性與辣根過氧化物酶相關。
18.根據權利要求17所述的方法，其中辣根過氧化物酶是靶或直接或間接與靶相連。
19.根據權利要求18所述的方法，其中靶是多肽、核酸、碳水化合物、脂質或其衍生物、 分子復合物、顆粒、真核或原核細胞或微生物。
20.根據權利要求14至19任一項所述的方法，其中樣品是生物學樣品、環境樣品或化學樣品。
21.根據權利要求20所述的方法，其中樣品固定在固體支持物上。
全文摘要
本發明涉及兩個或多個基團與一個或多個標記物綴合的化合物，所述基團能夠作為具有過氧化物酶活性的酶的底物。使用很多檢測和顯影此類靶的實驗方法，例如免疫組織化學(HIC)，原位雜交(ISH)、ELISA、DNA印跡、RNA印跡和蛋白質印跡等，本發明的綴合物分子可用于檢測樣品中的靶分子，例如，生物或化學分子，分子結構等。本發明也涉及包含綴合物分子的組合物。標記物與過氧化物酶底物的基團是不同的化學物質并通過接頭連接在一起，其中所述接頭是含有至少一條直鏈的化合物，直鏈有至少30個連續連接的原子，所述直鏈包含至少兩個由至少30個連續連接的原子距離分開的分枝點，綴合物分子中的標記物和過氧化物酶底物基團由至少30個連續連接的原子分開，而兩個相鄰的過氧化物酶底物基團通過少于30個連續連接的原子相互分離。
文檔編號C12Q1/28GK102325895SQ201080008439
公開日2012年1月18日 申請日期2010年2月19日 優先權日2009年2月19日
發明者J·洛澤 申請人:丹麥達科有限公司