專利名稱：鑒別葡萄球菌并檢測其耐藥性的多重pcr試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種試劑盒，尤其涉及一種快速鑒別感染性標本中的葡萄球胃(Staphylococcus) ^ W ^ IlJ ^ ft W ^ S PCR (multiplex polymerase chain reaction)試劑盒。
背景技術：
近年來，革蘭陽性球菌感染有上升趨勢，約占醫院感染的40%。已經重新成為醫院感染的主要病原菌，與20世紀五六十年代不同的是出現了耐藥革蘭陽性球菌的廣泛傳播和流行，甚至是爆發流行。其中最主要的是葡萄球菌的感染，金黃色葡萄球菌占所有革蘭陽性球菌感染的第一位。金黃色葡萄球菌的流行。美國疾病控制與預防中心(CDC)報告，美國本土MRSA占臨床分離的金葡菌菌株的16 % 22 %，現已高達50 %，因感染MRSA而沒有得到及時治療的死亡病例數也逐年增加。在我國上海地區70年代葡萄球菌中MRAS分離率為5 %，1985-1986 為M%，1989年則升至60%，2001年已達44% 77% [何述祥.金黃色葡萄球菌耐藥性的變遷和耐藥機理.[J].內蒙古醫學雜志，2001 ;33(4) :342-345汪復，朱德妹，胡付品， 等.上海地區細菌耐藥性監測分析.[J].中華醫學雜志，2001 ;81(1) :17-19] 0 1995 1999年在大連、北京、南京等9大城市13家醫院的細菌耐藥檢測調查中MRAS的檢出率為 27. 55%，院內感染患者中MRSA檢出率為81. 82% [李家泰，AnnaJJeinsetni.中國細菌耐藥監測研究.中華醫學雜志，2001 81 (1) :8-16.]。中南地區2006年6月-2007年6月臨床分離菌株中兒童組(< 14歲)和成人組(> 15歲)耐甲氧西林金葡菌(MRSA)分離率分別為14. 8%禾口 51. 2%0非ICU中MRSA和MRSCN的分離率分別為45. 2%禾口 66. 3%, ICU 中MRSA分離率為77. 6% [簡翠，葉濤，張蓓，等。Mohnarin2006-2007年度報告中南地區細菌耐藥監測[J]中國抗生素雜志2008,33(10) :608-615]。葡萄球菌常見的金葡菌對青霉素的耐藥率為85. 11% [陳翠卿羅立曠陳作嚴，醫院細菌耐藥性監測及抗菌藥物應用對策[J].國際醫藥衛生導報2008，14(21) :81-83]，其中大部分MRSA同時對喹諾酮類、氨基糖苷類、四環素類耐藥。凝固酶陰性葡萄球菌的流行。20世紀70年代開始，凝固酶陰性葡萄球菌的致病性也得到了認識，近年來由于診療設備的不斷增多，免疫抑制劑、皮質類激素與放射治療以及抗生素的廣泛應用，致使表皮葡萄球菌等血漿凝固酶陰性葡萄球菌引起的感染日益增多。美國國家醫院感染檢測系統提供的數據顯示，自1990年1月至1999年5月患者血培養分離的病原菌中凝固酶陰性和凝固酶陽性葡萄球菌所占比例分別為37.3%、 12. 6% [von Eiff，C.，G. Peters，and C. Heilmann. Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci. [J]Lancet Infect· 2002· 2 :677-685.]。凝固酶陰性葡萄球菌的致病性不容忽視。耐藥葡萄球菌。金黃色葡萄球菌，尤其是甲氧西林或苯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌(MRSA)是引起院內感染的多重耐藥菌。在第一個耐青霉素酶的內酰胺類抗生素甲氧西林用于臨床治療葡萄球菌感染不久，1961年在英國發現了世界首例MRSA。從此， MRSA逐漸成為全世界院內感染的主要病原菌。目前在許多國家仍在增長，MRSA幾乎對所有 β-內酰胺類抗生素耐藥，甚至累及到紅霉素，環丙沙星和慶大霉素。1996年在日本首次發現了 MRSA對萬古霉素敏感性下降的菌株，即萬古霉素中介的金黃色葡萄球菌(VISA)。VISA 的出現預示著萬古霉素治療葡萄球菌感染的臨床療效下降，隨之萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌(VRSA)臨床株是否會分離到，成為人們監測和關注的熱點。如果葡萄球菌一旦對萬古霉素耐藥，臨床將如何治療？所以連續監測金黃色葡萄球菌的耐藥現狀，了解葡萄球菌的耐藥機制，感染的危險因素及其治療對策具有重要的臨床意義。葡萄球菌的耐藥率是呈上升趨勢的，該菌感染已成為當今世界范圍內醫務界面臨的嚴重問題，已經被列為“超級細菌”之首。國際上將MRSA感染作為世界上三大感染之一。 MRSA和MRCNS對β -內酸胺類與氨基糖甙類抗生素幾乎均有耐藥性，對氟哇諾酮類抗生素的耐藥性亦呈上升趨勢。因此尋找一種快速檢測MRS的方法已成當務之急，可使我們及時使用糖肽類抗生素，迅速控制耐甲氧西林葡萄球菌造成的感染，限制其播散，同時也可以減少糖肽類抗生素的濫用，減緩對糖肽類抗生素耐藥的葡萄球菌的出現。瓊脂稀釋法是CLSI0/NCCL S推薦的檢測MRSA的經典方法。M IC法費力、耗時、成本較高，臨床上不宜作為常規方法開展。目前，m ecA基因的分子檢測已取代了該法成為鑒定 MRSA 的“金標準” [B row η D F,Edw ardsD I,Haw key PM, et al. Guidelines for the Iabo rato ry diagno sis and suscep t ibility testing of methicillin2resistant Sta hylococcus aureus (MRSA)[J]. JA nt im icrob Chem other,2005,56 (6) :1000]o
實用新型內容本實用新型的目的是解決上述問題而提供一種結構簡單，在保證結果準確的同時又有高通量的優勢，更加省時省力，降低成本的快速鑒別感染性標本中的葡萄球菌并同時檢測其耐藥性的多重PCR試劑盒。本實用新型解決上述技術問題所采用的技術方案是它包括殼體，殼體上設有溶葡萄球菌素放置倉、NaOH溶液放置倉、多重PCR反應液放置倉、標準陽性模板放置倉、陰性質控標準品放置倉和％ NaCl溶液放置倉。與現有技術相比，本實用新型取得了以下的技術效果1、此實用新型結構簡單，與臨床檢測上傳統的培養法相比多重PCR方法跟單一 PCR方法比較起來，在保證結果準確的同時又有高通量的優勢，更加省時省力，降低成本；2、特異性好，靈敏度高，步驟簡單，可重復性高，可同時進行高通量的樣品檢測，檢測速度快，加上樣品DNA的提取制備，5小時內可以完成。
圖1為本實用新型俯視圖。其中1-殼體、2-溶葡萄球菌素放置倉、3-NaOH溶液放置倉、4-多重PCR反應液放置倉、5-標準陽性模板放置倉、6-陰性質控標準品放置倉、7-NaCl溶液放置倉。
具體實施方式
以下結合附圖進一步說明本實用新型的實施例。實施例1參見圖1，一種鑒別葡萄球菌并檢測其耐藥性的多重PCR試劑盒，它包括殼體1，殼體上設有溶葡萄球菌素放置倉2、4% NaOH溶液放置倉3、多重PCR反應液放置倉4、標準陽性模板放置倉5、陰性質控標準品放置倉6和0. 9% NaCl溶液放置倉7。多重PCR反應液含有3對引物，引物分為正向引物和反向引物，分別為；mecA 5' -GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ΑΤΑ A-3'5' -CCA ATT CCA CAT TGT TTC GGT CTA A-3'；femB 5’ -TTA CAG AGT TAA CTG TTA CC-3’5' -ATA CAA ATC CAG CAC GCT CT-3'；16SrDNA5' -AAC TCT GTT ATT AGG GAA GAA CA-3’5' -CCA CCT TCC TCC GGT TTG TCA CC-3'；標準陽性模板從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌標準菌株(ATCC43300)中提取的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌組DNA。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌標準菌株先用無菌TE緩沖液配制成細菌懸液，經過平板計數法及用定量接種環確定所配制的菌液濃度為108CFU/ml，經過熱裂解提取細菌基因組DNA，具體地說a)標本DNA提取液包括20U/ml溶葡萄球菌素、4% NaOH溶液、0. 9% NaCl溶液b)多重PCR反應液 多重PCR反應液是由正向引物和反向引物3對，TaqDNA聚合酶，dNTPMixture，Mg2+， 10Xbuffer和無菌雙蒸水組成。在本發明的一個具體方案中，多重PCR反應液由IOymol/ L的引物，各引物量分別為mecA正負向引物各0. 6 μ 1，femB正負向引物各1. 9 μ 1，16SrRNA 正負向引物各 0. 6 μ 1，10Xbuffer3y 1，dNTP Mixture3 μ 1，Mg2+2. 5 μ 1，無菌雙蒸水 4. 3 μ 1，反應液總體積22 μ 1。其中引物為所示的核苷酸序列。c)標準陽性模板標準陽性模板從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌標準菌株(ATCC43300)中提取的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌組DNA。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌標準菌株(ATCC43300)菌落，溶于2ml的無菌TE緩沖液中配成細菌懸液，經平板計數法以及用定量接種環確定所配制的菌液濃度為10!^^/1111，取40(^1經過熱裂解提取細菌基因組 DNA, -20°C保存，做為陽性模板備用。d)陰性質控標準品陰性質控標準品為無菌雙蒸水。本實用新型的使用方法包括下列步驟a)按陽性標本處理方法提取送檢標本細菌DNA用于多重PCR反應；b)將標準陽性模板從-20°C冰箱取出，平衡至室溫待用；c)分別取等量的a)步中的標本中的細菌組DNA和b)步中標準陽性模板加入到多重PCR反應液(正向引物和反向引物3對，TaqDNA聚合酶，dNTPMi xtur e, Mg2+，IOXbuffer和無菌雙蒸水)中，用PCR擴增儀進行擴增；d)將擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。本方法可對臨床分離的可疑葡萄球菌進行快速鑒定，并同時檢測其耐藥性，縮短一直沿用的傳統培養藥敏法的診斷時。實施例1 快速鑒定葡萄球菌及檢測耐藥基因的多重PCR試劑盒組成與配制。試劑組成a、標本 DNA 提取液al_20U/ml 溶葡萄球菌素、a2~4% NaOH 溶液、a3-0. 9% NaCl 溶液b、多重PCR反應液正向引物和反向引物3對(ΙΟμπιοΙ/L)，其中引物量分別為 mecA正負向引物各0. 6μ 1，femB正負向引物各1. 9 μ 1，16SrRNA正負向引物各0. 6 μ 1， 10 X buffer3 μ 1，dNTPMixture3 μ 1，Mg2+2. 5 μ 1，無菌雙蒸水 4. 3 μ 1，反應液總體積 22μ 1 ；C、標準陽性模板標準陽性模板從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌標準菌株 (ATCC43300)中提取的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細菌組DNA ；d、陰性質控標準品為無菌雙蒸水。實施實例2 用快速鑒定葡萄球菌及檢測耐藥基因的多重PCR試劑盒檢測標本中的葡萄球菌。 1、臨床標本DNA的提取膿液取Iml于無菌瓶中，加入4倍體積4% NaOH溶液，室溫放置，液化30min， 充分振蕩，取Iml液化后液體于無菌EP管中，12000rpm離心lOmin，棄上清；加Iml生理鹽水于沉淀中，打勻，12000rpm離心lOmin，棄上清；重復一次；收集沉淀，將沉淀溶于 300 μ ITE (ΡΗ8. 0)的EP管中；加入20U/ml溶葡萄球菌素20 μ 1，放入37°C恒溫水浴箱作用30min ；金屬浴100°C加熱IOmin ；不等冷卻，4°C低溫離心機12000gX lOmin，取上清液 50 μ 1即得細菌總DNA。血液取陽性報警血培養瓶中血液Iml于無菌EP管中，3000rpm離心5min，取血清于另一 EP管，12000rpm離心lOmin，棄上清；用生理鹽水洗2 3次后收集最終沉淀，采用上述方法提取DNA。體液包括腦脊液、胸腹腔液、前列腺液等，可直接離心沉淀用生理鹽水洗2 3次后收集最后沉淀，采用1.所述方法提取DNA;成分粘稠同膿液處理方法，加入4倍體積4% NaOH溶液，室溫放置，液化30min，充分振蕩，取Iml液化后液體于無菌EP管中，12000rpm 離心lOmin，棄上清；加Iml生理鹽水于沉淀中，打勻，12000rpm離心lOmin，棄上清；重復一次；收集沉淀，采用上述方法提取DNA。2、將標準陽性模板從-20°C冰箱取出，平衡至室溫待用；3、分別取等量的細菌組DNA和標準陽性模板(3 μ 1)加入到多重PCR反應液 22μ 1(正向引物和反向引物3對，TaqDNA聚合酶，dNTP Mixture，Mg2+，IOXbuffer和無菌雙蒸水)中，用PCR擴增儀進行擴增；擴增條件為94°C 3min預變性，94°C 40s 58°C 40s 72°C Imin 20cycles, 94°C Imin 50°C Imin 72°C 2min 25cycles ；72°C IOmin 延伸；4、將擴增后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件100v 80mA 50min凝膠濃度
61. 5%電泳結束后紫外燈下觀察結果；5、結果的判讀
權利要求1.鑒別葡萄球菌并檢測其耐藥性的多重PCR試劑盒，其特征在于它包括殼體(1)，殼體上設有溶葡萄球菌素放置倉O)、Na0H溶液放置倉(3)、多重PCR反應液放置倉、標準陽性模板放置倉(5)、陰性質控標準品放置倉(6)和NaCl溶液放置倉(7)。
專利摘要本實用新型涉及鑒別葡萄球菌并檢測其耐藥性的多重PCR試劑盒，它包括殼體，殼體上設有溶葡萄球菌素放置倉、NaOH溶液放置倉、多重PCR反應液放置倉、標準陽性模板放置倉、陰性質控標準品放置倉和NaCl溶液放置倉。本實用新型結構簡單，與臨床檢測上傳統的培養法相比多重PCR方法跟單一PCR方法比較起來，在保證結果準確的同時又有高通量的優勢，更加省時省力，降低成本。
文檔編號C12Q1/14GK201952436SQ2010205545
公開日2011年8月31日 申請日期2010年10月9日 優先權日2010年10月9日
發明者李艷, 汪明, 胡慧霞 申請人:李艷, 汪明, 胡慧霞