用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置的制作方法

專利名稱：用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置的制作方法
技術領域：
本實用新型屬生命科學、醫學、化學及工學等多個領域檢測裝置，涉及一種用于數 字核酸擴增的集成流路芯片裝置。
背景技術：
現已證明，人類的許多疾病都與基因有著直接或間接的關系，而基因是具有遺傳 效應的DNA(脫氧核糖核酸)分子片段。因此，核酸的檢測和分析不僅在遺傳性疾病、腫瘤和 傳染病等醫學領域應用廣泛，而且在法醫學鑒定、食品安全、考古學等領域的地位也越來越 重要。然而，盡管核酸研究已經取得了令人矚目的成績，但同時也面臨著更多的挑戰。首先， 生物體的生長、發育不是由單一基因所決定的，而是多個基因協同作用的結果，是一個非常 復雜的過程。研究基因多樣性以及基因突變或改造等問題都亟需有核酸高通量快速檢測手 段。其次，核酸的含量非常低，目前很難直接檢測，而往往采用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，簡稱PCR)技術在體外擴增DNA，直到目的DNA濃度足以被檢測為止。聚合酶鏈式反應技術發明至今已經三十多年了，在這期間技術得到了不斷的發 展，近年來出現的實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)技術實現了 PCR從定 性到定量的飛躍。所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利 用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對待測模板進行定量分析的方 法。然而，這種傳統的定量PCR方法也有著其不可避免的缺點①熒光定量PCR的測定點在 PCR擴增的指數期，而不同模板、不同條件下，PCR擴增達到平衡所需要的循環數是不確定 的。②如果目的片段的起始濃度過低的話，往往難以擴增到可檢測水平。③待測樣品的擴 增效率有可能和標準樣品的有差異。1999年，Vogelstein等發展了一種叫做數字PCR(Digital PCR)的方法，將待測 DNA模板稀釋并載入多孔板，使平均每兩個以上孔中只有一個模板分子，在優化的條件下進 行傳統的熱循環PCR反應之后，和分子信標雜交以檢測特異性擴增產物，陽性孔產生熒光。 與傳統的熒光定量PCR相比，數字PCR是通過直接計數陽性孔的數目來定量核酸的起始拷 貝數，能夠做到真正意義上的絕對定量測定，因此稱之為數字PCR。2006年Ottesen等研制 出可以對細菌多個基因進行精確定量的微流控數字PCR芯片，同年美國Fluidigm公司開發 出了商品化的數字陣列PCR芯片，用實時PCR儀進行核酸擴增和定量檢測。這種數字PCR 芯片涉及到一種基于多層軟光刻工藝制備的PDMS彈性微閥，在這種結構中，流體通路位于 下層PDMS層中，由許多并行的串聯著的小室組成；氣體通路位于上層PDMS中，由許多與流 體通道相互垂直的通道組成。這種閥在沒有外力作用時處于開放狀態，當給氣體通路施加 壓力(如氣壓或水壓)時，位于上下層之間的PDMS薄膜向下擴展，閥處于關閉狀態，使得下 層液流通路被阻隔成若干個獨立的反應室。上述的數字PCR芯片在腫瘤的分子檢測、非侵入性產前診斷、生物的遺傳學分析 及與拷貝數變異相關的疾病等方面均有著廣闊的應用前景。《Nature》和《Nature Method)) 雜志的編輯Blow博士撰文指出數字PCR是PCR技術的新前沿，可以進行單細胞甚至單分子研究，通過直接計數而實現絕對定量。但是，這種基于PDMS彈性微閥的數字PCR芯片的制 作涉及到多層結構的對準、封接，制備過程周期長而復雜，目前商品化的芯片及配套儀器都 非常昂貴。因此，從數字PCR芯片技術的大規模應用前景來看，目前的這種制備方法及應用 成本均是不利的。
發明內容本實用新型的目的是提供一種成本低廉、易于操作的用于數字核酸擴增的集成流 路芯片裝置，它由真空系統、前管路、緩沖瓶、后管路、毛細管、吸盤、封接層和通道層組成， 通道層與封接層進行封接后組成了集成流路芯片組件，吸盤置于集成流路芯片組件上，通 道層刻有通道，并設有出樣口和進樣口，通道由蜿蜒的主通道及位于主通道兩側的若干側 室組成，主通道的兩個末端分別接出樣口和進樣口，所述的側室的橫截面可以為正方形、圓 形、梯形或多邊形，前管路一端連接真空系統，另一端連接緩沖瓶，后管路一端與緩沖瓶相 連，另一端與毛細管相連，毛細管穿過吸盤與集成流路芯片組件連通。主通道及側室的大小可以根據需要來決定，通道的寬度從1 μ m至1000 μ m不等， 優選的寬度范圍為50到1000 μ m，最好的范圍在50到500 μ m之間，比如50 μ m，100 μ m， 200 μ m，300 μ m，400 μ m，500 μ m ；通道9的深度范圍在1 μ m至1000 μ m之間，優選的范圍在 1 μ m至Ij 500 μ m之間，最好的范圍在10 μ m到100 μ m之間，比如10 μ m，20 μ m, 30 μ m, 50 μ m, 75 μ m，100 μ m;側室的體積為皮升(pi)到納升(nl)級別。通道層的制作材料可選用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、環氧樹脂、聚四氟乙烯、聚苯 乙烯(PC)、玻璃、PDMS等。通道層的制作根據不同的材料可選用不同的方法，比如激光刻蝕、化學蝕刻、光 刻、熱壓、澆注及注塑等方法。封接層的材料選用耐熱透明膠帶、PET膜、氟膜或是與通道層相同材料或不同材料 的平板。通道層與封接層進行封接，封接方法根據材料及應用不同可選用耐熱透明膠帶粘 合、熱鍵合、耐熱膠粘合、或是熱壓封接等；封接后用膠帶將所有孔封閉以備用。若通道層選用的是非透明材料，且封接層選用的是硬質材料，則封接層需要預先 在與通道層的進樣口與出樣口相對應的位置鉆好小孔及小孔，然后再進行封接。若通道層選用的是透明材料，可在其上的進樣口和出樣口的位置直接鉆孔后與封 接層封接。若封接層選用的是PET薄膜、氟膜或透明膠帶等軟質材料，則封接層或通道層均 無需打孔，只需在使用時用針頭將薄膜或膠帶相對應于進樣口和出樣口的位置刺破即可。根據芯片通道層選用的材料及實驗的需要不同，可將通道層的背面與鋁片、銅片 或硅片等導熱系數大的材料粘合。利用本實用新型可進行核酸數字擴增的方法，通過以下步驟完成(1)樣品準備如果核酸擴增采用傳統的PCR方法，則將模板DNA與STOR Premix EXTaq試劑盒 或I1aqman探針試劑盒混合；如果核酸擴增采用環介導等溫擴增，則將模板DNA與LAMP反應試劑及DNA熒光染料 SYBR Green I 混合；(2)將封接層上的小孔或是通道層上的出樣口 11處的透明膠帶扎破，并將吸盤置 于此孔上，然后開始抽真空，使真空度達到0 13332. 2Pa，這樣便可利用負壓進行進樣和 微流體分配；(3)根據主通道及側室的大小，在芯片封接層上的小孔處或是通道層上的進樣口 處加上適量樣品，并將此處的膠帶扎破，此時溶液會在負壓的作用下進入主通道及其兩側 的小室，待溶液充滿主通道和側室后仍繼續抽真空，直到主通道的液體被全被抽出，此時側 室的樣品不會被抽出而仍然保留，從而將樣品分隔到成百上千個皮升到納升級的小室中； 用少量雙蒸水沖洗主通道；(4)向主通道內導入礦物油并使其充滿主通道，從而將上千個側室分隔開來；也 可以向主通道內導入低沸點溶液、熱固性塑料等，目的都是為了將側室的出口堵住，避免加 熱后側室內的溶液向主通道擴散；(5)用固化膠或耐熱透明膠帶將封接層上的小孔和小孔或通道層上的出樣口和進 樣口密封；(6)將集成流路芯片組件置于原位PCR儀或類似于原位PCR儀的熱循環裝置上，可 進行傳統的PCR擴增；若對核酸進行環介導等溫擴增，將集成流路芯片組件置于普通的熱 板上，65度加熱30-60分鐘即可；(7)對擴增后的產物進行熒光成像，軟件計數陽性孔。本實用新型的優點1.與多孔板上進行的數字PCR相比，本實用新型利用芯片微型化的特點，試劑和 樣品的消耗量均很少，大大減少了實驗成本；除此之外，本實用新型只需通過抽真空進行負 壓進樣，在幾十秒的時間內便可使微量液體分配至成百上千個獨立的小室中，大大提高了 實驗速度。充分體現了當今分析設備微型化、便攜化的發展趨勢，在高通量、低消耗和大規 模平行處理方面具有極大的優勢。另外，由于樣品和試劑的分配都在芯片內部完成，不與外 界大氣直接接觸，可有效防止外界污染和交叉污染。2.本實用新型中的集成流路芯片可根據實驗的需要或不同的實驗條件而選擇 不同的材料，種類繁多，選擇面寬，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚四氟乙烯、聚苯乙烯 (PC)、聚碳酸酯(PC)、環氧樹脂、玻璃等，如果是采用正壓進樣，還可以選用聚二甲基硅氧烷 (PDMS)。3.與現有的商品化數字PCR芯片相比，本實用新型不需要微閥便可使少量液體分 配到上千個獨立的小室中，大大減少了芯片制作和使用的復雜程度。4.本實用新型結構及操作簡單，因此無論是芯片還是其所需的配套儀器，其應用 成本都將會比目前商品化的基于PDMS彈性微閥的數字PCR芯片大大減少，為數字PCR技術 的推廣與應用提供了一個良好的平臺。

圖1是本實用新型的裝置示意圖。圖2為吸盤與芯片連接處的局部放大圖。圖3為芯片通道層示意圖。[0034]圖4為陽性孔計數軟件工作框圖。
具體實施方式
以下結合附圖和實施例對本實用新型作進一步說明。實施例1參見圖1、圖2、圖3，一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，它由真空系統 1 (如真空泵)、前管路2、緩沖瓶3、后管路4、毛細管5、吸盤6、封接層7和通道層8組成，通 道層8與封接層7封接后組成了集成流路芯片組件，吸盤6置于集成流路芯片組件上，通道 層8刻有通道及進樣口 12和出樣口 11，通道由蜿蜒的主通道9及位于主通道9兩側的若干 側室10組成，主通道9的兩個末端分別接出樣口 11和進樣口 12，前管路2 —端連接真空系 統1，另一端連接緩沖瓶3，后管路4 一端與緩沖瓶3相連，另一端與毛細管5相連，毛細管 5穿過吸盤6與集成流路芯片組件連通。通道層8以厚500 μ m的黑色聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)為材料，采用激光刻蝕制 成；主通道9的寬度為100 μ m，深100 μ m ；側室10為邊長300 μ m的方形，深300 μ m，體積 為27nl ；側室10的橫截面還可以為圓形、梯形或其它多邊形。封接層7根據應用不同，選用耐熱透明膠帶或是PET膜、氟膜、透明PMMA平板等如果封接層7選用的是PMMA平板等硬質材料，封接前需要在與通道層8的出樣口 11與進樣口 12相對應的位置鉆好小孔13和小孔14，然后再進行封接，封接成功后用膠帶 將所有孔封閉以備用；但如果封接層7選用的是PET膜、氟膜等軟質材料，則無需預先打孔，只需在使用 時在與出樣口 11與進樣口 12相對應位置用針頭刺破即可。出樣口 11通過芯片封接層7上相對應的小孔13與吸盤6、毛細管5、后管路4、緩 沖瓶3及前管路2及真空系統1相連(參加圖1、2)。所述的真空系統1通過抽真空，將置于芯片封接層7上的小孔14處的樣品抽入主 通道9和側室10，當樣品充滿主通道9和側室10之后，繼續抽真空，可將主通道9中的液體 抽出，而側室10中的液體仍然保留，從而將樣品分隔到成百上千個納升級的小室中。實施例2參見圖1、圖2、圖3，參照實施例1，一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置， 它由真空系統1 (如真空泵)、前管路2、緩沖瓶3、后管路4、毛細管5、吸盤6、封接層7和通 道層8組成，通道層8與封接層7封接后組成了集成流路芯片組件，吸盤6置于集成流路芯 片組件上，通道層8上設有通道及進樣口 12和出樣口 11，通道由蜿蜒的主通道9及位于主 通道9兩側的若干側室10組成，主通道9的兩個末端分別接出樣口 11和進樣口 12。前管 路2 —端連接真空系統1，另一端連接緩沖瓶3，后管路4 一端與緩沖瓶3相連，另一端與毛 細管5相連，毛細管5穿過吸盤6與集成流路芯片組件連通。通道層8以環氧樹脂為材料，采用澆注方法制得，也可以采用激光刻蝕的方法制 作；通道層8厚度為600 μ m。主通道9的寬度為50 μ m或100 μ m，深50 μ m或100 μ m (這 樣寫可以嗎？)；側室10為邊長300 μ m的方形，深400 μ m，體積為36nl，所述的側室10也 可以是梯形、圓形或多邊形。芯片封接層7根據應用不同，可選用耐熱透明膠帶或是PET膜、氟膜、聚合物平板等如果封接層7選用的是硬質材料，封接前需要在與通道層8的出樣口 11與進樣口 12相對應的位置鉆好小孔13和小孔14，然后再進行封接，封接成功后用膠帶將孔封閉以備 用；但如果封接層7選用的是PET膜、氟膜等軟質材料，則無需預先打孔，只需在使用 時在與出樣口 11與進樣口 12相對應位置用針頭刺破即可。出樣口 11通過芯片封接層7上相對應的小孔13及吸盤6、毛細管5、后管路4、緩 沖瓶3及前管路2與真空系統1相連(參見圖1、2)。所述的真空系統1通過抽真空，將置于芯片封接層7上的小孔14上的樣品抽入主 通道9和側室10，當樣品充滿主通道9和側室10之后，繼續抽真空，可將主通道9中的液體 抽出，而側室10中的液體仍然保留，從而將樣品分隔到成百上千個納升級的小室中。實施例3本實施例的用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置的結構參見圖1、圖2、圖3，參 照實施例1。它由真空系統1 (如真空泵)、前管路2、緩沖瓶3、后管路4、毛細管5、吸盤6、 封接層7和通道層8組成，通道層8與封接層7封接后組成了集成流路芯片組件，吸盤6置 于集成流路芯片組件上，通道層8上設有通道及進樣口 12和出樣口 11，通道由蜿蜒的主通 道9及位于主通道9兩側的若干側室10組成，主通道9的兩個末端分別接出樣口 11和進 樣口 12 ；前管路2 —端連接真空系統1，另一端連接緩沖瓶3，后管路4 一端與緩沖瓶3相 連，另一端與毛細管5相連，毛細管5穿過吸盤6與芯片組件連通。通道層8以Imm厚的玻璃為材料，采用標準的光刻、蝕刻技術制成。主通道9的 寬度為30 μ m，50 μ m，100 μ m;主通道9深20 μ m，30 μ m，50 μ m ；側室10的橫截面為邊長 100 μ m，200 μ m或300 μ m的正方形，深50 μ m, 100 μ m, 200 μ m ；根據不同的寬度和刻蝕深 度，側室10的體積為可為500pl，lnl，2nl，4. 5nl,8nl,9nl, 18nl ；側室10也可以為五邊形、 梯形或圓形；通道層8制作好以后，將進樣口 12和出樣口 11用直徑Imm的鉆頭打通，然后將 通道面與芯片封接層7封接；相同性質的玻璃作為芯片封接層7，采用熱鍵合與通道層8封 接；封接成功后用膠帶將通道層8上的進樣口 12和出樣口 11封閉以備用。出樣口 11通過吸盤6、毛細管5、后管路4、緩沖瓶3及前管路2與真空系統1相 連；所述的真空系統1通過抽真空，將置于進樣口 12處的樣品抽入主通道9和側室10，當 樣品充滿主通道9和側室10之后，繼續抽真空，可將主通道9中的液體抽出，而側室10中 的液體仍然保留，從而將樣品分隔到成百上千個皮升或納升級的小室中。實施例4數字化環介導等溫擴增(Digital-Loop Mediated Isothermal Amplification, Digital-LAMP)本實施例采用實施例1的裝置進樣，并進行后續的數字化環介導等溫擴增。具體步驟1、設計通道結構參見圖3，并制成掩膜。2、芯片通道層8以0. 5mm的PMMA為材料，經激光刻蝕得到所需的通道結構，主通 道9寬100 μ m，深100 μ m ；側室10形狀為正方形，邊長為300 μ m,深度為0. 5mm,即全部刻通。[0062]通道9和側室10的尺寸可根據需要選擇，通道9的寬度從10 μ m到1000 μ m不等， ΙΟμπι到1000 μ m深；側室10的尺寸為nl到μ 1級，側室可以是方形、圓形或梯形。3、將0. 6mm-2mm厚的銅片用膠水與芯片通道層8的背面粘合起來。與芯片通道層8背面粘合的材料除了銅片之外，還可以選擇鎳、硅片等導熱系數 高、且不處理或經簡單處理后與核酸擴增反應的試劑有相容性的材料。4、將芯片通道層8的通道面與耐熱透明膠帶封合。芯片通道層8還可采用PET膜、氟膜封合或與鉆好孔的PMMA等聚合物平板用膠水 或熱壓封接，封接完后用透明膠帶將打孔處封閉待用；5、采用商業化λ -DNA作為反應模板考察芯片的性能將模板DNA稀釋到適當的濃 度并與適量的LAMP反應試劑及DNA熒光染料STOR Green I混合(1)將 500ng/ μ L 的 λ -DNA 溶液稀釋為 5pg/ μ L、0. 5pg/ μ L、0. 05pg/ μ L， 0. 005pg/ μ L，作為DNA模板各取1 μ L進行PCR反應。(2)按照50uL體系配制LAMP反應混合物λ -DNA模板1 μ L，弓丨物 FIP (40 μ Μ) 2 μ L,弓丨物 BIP (40 μ Μ) 2 μ L，弓丨 *F3(5yM)2yL，弓丨 *Β3(5μΜ)2μ ， dNTP (2. 5mM each) 8 μ L，MgSO4 (50mM) 6 μ L, betaine (5M) 10 μ L, Bst 酶 2 μ L，Bstbuffer 5 μ L，SYBR Green I 2 μ L, ddH20 8 μ L0 LAMP 弓丨物如下F3 :5’ GTTGGGAAGGGCGATCG 3’B3 :5， ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA 3，FIP :5’ ACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC 3’BIP :5’ CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT 3’6、將芯片封接層7上對應于出樣口 11處的透明膠帶刺破，并將吸盤6置于此孔 上，然后開始抽真空，使真空度達到0 13332. 2Pa。7、在芯片封接層7上對應于進樣口 12處加上50 μ L的反應混合物，并將此處的膠 帶扎破，此時溶液會在負壓的作用下進入主通道9及其兩側的小室10，待溶液充滿主通道9 和側室10后仍繼續抽真空，直到主通道9的液體被全被抽出，此時側室10的樣品不會被抽 出而仍然保留；少量雙蒸水沖洗主通道9。8、向主通道9內導入礦物油并使其充滿主通道9，從而將上千個側室10分隔開來； 也可以向主通道9內載入難揮發性液體、熱固性塑料，目的都是為了將側室10的出口堵住， 避免加熱后側室10內的溶液向主通道9擴散。9、用固化膠或耐熱透明膠帶將膠帶的刺破處密封。10、將芯片組件置于熱板上，65度加熱30分鐘，以對核酸進行環介導等溫擴增。 由于STOR Green I熒光染料只與雙鏈DNA小溝結合，當它與DNA雙鏈結合時，發出較原先 強800 1000倍的熒光，因此，發生擴增反應的側室9將呈現綠色熒光，陰性將無顏色變 化。因此，如果有核酸分子被分配到某個獨立的側室10，該側室在反應后將產生綠色的熒 光；如果核酸的濃度足夠低，是每個側室10最多能分到一個核酸分子，那么，通過對陽性孔 的計數就可以對起始的核酸模板量進行精確定量。11、對擴增后的產物進行熒光成像后，用自行開發的軟件對對陽性孔進行計數及 分析。參見圖4，軟件由加法器、原始圖像儲存部、圖像計算部、檢測標準選擇部及結果存儲部等部分組成。原始圖像儲存部在數據圖像進入處理軟件之后將數據保存，并在中間結 果計算及最終結果輸出中提供原始的數據；圖像計算部包含邊緣檢測、閾值分析、區域選 擇等關鍵步驟；檢測標準選擇部包含數種不同的檢測標準，按一定的順序執行，以適應不 同質量的圖像數據的處理要求；結果存儲部用來保存每次處理結果的數據，并在執行完 所有檢測標準后，將結果累加輸出。實施例5數字化聚合酶鏈反應(Digital-PCR)本實施例采用實施例2的裝置進樣，并進行后續的數字化聚合酶鏈反應。具體步驟1、參見圖3設計通道結構，并制成掩膜；2、芯片通道層8以0. 6mm的耐熱環氧樹脂為材料，經激光刻蝕得到所需的通道結 構，主通道9寬100 μ m,深100 μ m ；側室10形狀為正方形，邊長為300 μ m,深度為0. 4mm。通道9和側室10的尺寸可根據需要選擇，通道9的寬度從10 μ m到1000 μ m不等， ΙΟμπι到1000 μ m深不等；側室10的尺寸為pi到nl級，側室可以是方形、圓形或梯形。3、將0. 6mm-2mm厚的鋁板用膠水與芯片通道層8的背面粘合起來。與芯片通道層8背面粘合的材料除了鋁板之外，還可以選擇銅片、鎳、硅片等導熱 系數高、且不處理或經簡單處理后與核酸擴增反應的試劑有相容性的材料。4、以耐熱氟膜或PET薄膜為芯片封接層7，經耐熱膠粘合后熱壓與芯片通道層8封 接；5、采用商業化λ -DNA作為反應模板考察芯片的性能將模板DNA稀釋到適當的濃 度并與適量的熒光定量PCR反應試劑混合1)將 500ng/yL 的 λ-DNA 溶液稀釋為 5pg/μ L、0. 5pg/μ L、0. 05pg/μ L， 0. 005pg/ μ L，作為DNA模板各取2 μ L進行PCR反應。2)使用STOR Premix EX Taq試劑盒進行PCR擴增反應，按照50 μ L體積配制反 應液，SYBR Premix EX Taq (2 X) 25 μ L, PCR Forward Primer(IOyM)IyL, PCR Reverse Primer(IOyM)IyL, ddH20 21 μ L, DNA 模板 2.0 μ L。反應條件為95 °C 30sec 預變性， 95°C 5sec，60°C 30sec，共40個循環。所用λ -DNA的引物序列如下上游引物5，GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG3，下游引物5，GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC3，PCR的擴增反應及檢測還可以采用Taqman探針來完成。6、將芯片封接層7上對應于出樣口 11處的薄膜刺破，并將吸盤6置于此處，然后 開始抽真空，使真空度達到0 13332. 2Pa。7、在芯片封接層7上對應于進樣口 12處加上50 μ L的反應混合物，并將此處薄膜 扎破，此時溶液會在負壓的作用下進入主通道9及其兩側的小室10，待溶液充滿主通道9和 側室10后仍繼續抽真空，直到主通道9的液體被全被抽出，此時側室10的樣品不會被抽出 而仍然保留；少量雙蒸水沖洗主通道9 ；8、向主通道9內載入礦物油并使其充滿主通道9，從而將上千個側室10分隔開來； 也可以向主通道9內載入低沸點液體、熱固性塑料等，目的都是為了將側室10的出口堵住， 避免加熱后側室10內的溶液向主通道9擴散。9、用固化膠或耐熱透明膠帶將薄膜的刺破處密封。[0100]10、將芯片組件置于原位PCR儀器上，95°C 30sec預變性，95°C 5sec，60°C 30sec, 共40個循環。由于STOR Green I熒光染料只與雙鏈DNA小溝結合，當它與DNA雙鏈結合 時，發出較原先強800 1000倍的熒光，因此，發生擴增反應的側室9將呈現綠色熒光，陰 性將無顏色變化。因此，如果有核酸分子被分配到某個獨立的側室10，該側室在反應后將產 生綠色的熒光；如果核酸的濃度足夠低，使每個側室10最多能分到一個核酸分子，那么，通 過對陽性孔的計數就可以對起始的核酸模板量進行精確定量。11、對擴增后的產物進行熒光成像后，通過軟件對陽性孔進行計數及分析，參見圖4。
權利要求1.一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，由真空系統(1)、前管路O)、緩沖瓶 (3)、后管路G)、毛細管(5)、吸盤(6)、封接層(7)和通道層(8)組成，道層(8)與封接層 (7)進行封接組成集成流路芯片組件，吸盤(6)置于集成流路芯片組件上，通道層(8)刻有 通道，并設有出樣口(11)和進樣口(12)，通道由蜿蜒的主通道(9)及位于主通道(9)兩側 的若干側室(10)組成，主通道(9)的兩個末端分別接出樣口 (11)和進樣口(12)，側室(10) 的橫截面為正方形、圓形或梯形，前管路O)的一端連接真空系統(1)，另一端連接緩沖瓶 (3)，后管路(4)的一端與緩沖瓶(3)相連，另一端與毛細管(5)相連，毛細管(5)穿過吸盤(6)與集成流路芯片組件連通。
2.根據權利要求1所述的一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，其特征在于， 主通道(9)的寬度從1 μ m至1000 μ m，深度范圍在Iym至IOOOym之間，側室(10)的體積 為皮升到納升級別。
3.根據權利要求1所述的一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，其特征在于， 通道層(8)的材料選用聚甲基丙烯酸甲酯、環氧樹脂、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、玻璃或PDMS 中的一種，通道層(8)的制作方法選用激光刻蝕法、化學蝕刻法、光刻法、熱壓法、澆注法或注塑法。
4.根據權利要求1所述的一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，其特征在于， 封接層(7)的材料選用耐熱透明膠帶、PET膜、氟膜或與通道層⑶相同材料或不同材料的 平板。
5.根據權利要求1所述的一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，其特征在于， 通道層(8)與封接層(7)的封接方法選用耐熱透明膠帶粘合、熱鍵合、耐熱膠粘合或熱壓封 接法。
6.根據權利要求5所述的一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，其特征在于， 當通道層(8)選用非透明材料，封接層(7)選用硬質材料時，封接層(7)需要預先在與進樣 口 (12)和出樣口 (11)相對應的位置鉆好小孔(14)及小孔(13)，然后再進行封接，封接后 用膠帶將所有孔封閉以備用。
7.根據權利要求5所述的一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，其特征在于， 當通道層(8)選用透明材料，則在進樣口(12)和出樣口(11)的位置直接鉆孔后與封接層(7)封接，封接后用膠帶將所有孔封閉以備用。
8.根據權利要求5所述的一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，其特征在于， 當封接層(7)選用軟質材料，則封接層(7)或通道層(8)均無需打孔，只需在使用時用針頭 將薄膜或膠帶相對應于進樣口(1 和出樣口(11)的位置刺破即可，軟質材料選用PET薄 膜、氟膜或透明膠。
9.根據權利要求1述的一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，其特征在于，通 道層(8)的背面與導熱系數大的材料粘合，導熱系數大的材料選用鋁片、銅片或硅片。
專利摘要本實用新型提供一種用于數字核酸擴增的集成流路芯片裝置，由真空系統、前管路、緩沖瓶、后管路、毛細管、吸盤、封接層和通道層組成，通道層與封接層進行封接后組成集成流路芯片組件，通道層刻有通道，并設有出樣口和進樣口，通道由蜿蜒的主通道及位于主通道兩側的若干側室組成，主通道的兩個末端分別接出樣口和進樣口，前管路一端連接真空系統，另一端連接緩沖瓶，后管路一端與緩沖瓶相連，另一端與毛細管相連，毛細管穿過吸盤與集成流路芯片組件連通。本實用新型設計合理，微型化、便攜化，操作簡單，在幾十秒的時間內可使微量液體分配至上千個獨立小室中，減少芯片制作和使用的復雜程度，提高實驗速度，可在核酸數字擴增中應用。
文檔編號C12M1/00GK201901669SQ20102027029
公開日2011年7月20日 申請日期2010年7月23日 優先權日2010年7月23日
發明者吳青青, 朱強遠, 牟穎, 金偉, 金欽漢, 黃江 申請人:浙江大學