專利名稱：中國南海疣鎬芋螺神經毒素及其編碼序列和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽及其編碼序列和應用，尤其涉及一種芋螺神經毒素多肽及其編碼序列和應用。
背景技術：
芋螺，亦稱雞心螺，系軟體動物門，腹足綱，前鰓亞綱，芋螺科(Conidae)動物之總稱。芋螺是一類肉食性海洋軟體動物，分類學上屬腹足綱前鰓亞綱芋螺科，它們通過其毒管中的芋螺毒素麻醉動物以幫助捕食.芋螺根據其食性可以分為三類食魚性、食蟲性和食螺性芋螺，其中食魚性芋螺的毒素對人和哺乳動物毒性較大。芋螺毒素為其毒液中的有效成分，是一種具有獨特神經藥理作用的小肽，由7-41個氨基酸殘基組成，一般富含二硫鍵。 根據其二硫鍵的構成情況可分為兩大類含有多對二硫鍵及只含有一對或不含二硫鍵的。 在近499種芋螺中據認為有超過49999種芋螺毒素肽，根據其前體信號肽序列可以分為幾個超家族，如M、A和0)超家族，每個超家族的前體擁有共同的高保守的信號序列。大量的研究表明，芋螺毒素具有獨特的能夠高特異選擇性識別結合其作用靶(受體門控離子通道，電壓門控離子通道)，產生拮抗劑(antagonist)或阻斷劑(blocker)的作用。芋螺毒素識別其作用靶具有高特異性及選擇性，它們只作用于某一類特定亞型的受體或通道。目前作用于受體門控離子通道的有nAchR拮抗劑、NMDA受體拮抗劑；作用于電壓門控離子通道阻斷劑的有Na+通道阻斷劑、k+通道阻斷劑Ca2+通道阻斷劑等。目前已知的芋螺毒素大多是從食魚芋螺中分離得到，食蟲芋螺的毒液研究的相對較少。至今已有數種芋螺毒素申請美國專利，它們在鎮痛、局部缺血性保護、癲癇治療、某些疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應用價值，有的已進入臨床研究或已被FDA正式批準為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮痛藥。如由Olivera等從幻芋螺(Conus magus)中分離的 ω-CTX,MVIIA,已被美國FAD正式批準為治療頑痛的藥物，其商品名Ziconotide。ω -芋螺毒素MVIIA是由25個氨基酸、3對二硫鍵組成的堿性親水性小肽，C端酰胺化，N端為Cys。 可選擇性抑制N型電壓敏感性鈣通道，廣泛用作神經生物學探針和無致癮性鎮痛劑，并具有多種藥物發展前景；沿脊髓傳遞的Ziconotide能阻斷傷害感受器釋放神經傳遞素，阻止疼痛信號傳入大腦，臨床表現出強大的鎮痛作用，效果優于嗎啡等現有的鎮痛劑，用于艾滋病、癌癥及神經痛患者的治療，無成癮性，且療效確切。來源不同的ω-CTX，盡管其氨基酸序列不同，但在結構上的差異都不是很大，如來自地紋芋螺(C. geographus)的GVIA、GVIC、 GVIIA和GVOIB等，和來自幻芋螺MVIIA、MVIIC、以及來自線紋芋螺(C. striatus)的S03等 ω -CTX，在藥理學方面有相似的作用。我國關于芋螺毒素研究的報道不多，大多為綜述芋螺毒素的研究概況及應用前景。盧柏松等，魏開華等對我國的少數幾種芋螺(線紋芋螺，織錦芋螺和桶形芋螺)的毒素基因或毒液成份進行了研究。我國近海的芋螺約有70種，主要分布在海南島，西沙群島和臺灣，大多數種類的芋螺毒素研究還未展開。由于每種芋螺毒液都有自己特定的藥理學作用范圍和生物學活性，因而使芋螺毒素具有重要的理論研究價值和應用價值。多樣性的芋螺毒素既可直接用作天然藥物，又可以作為設計新藥(用于治療重大疑難雜癥)的先導化合物。深入研究芋螺毒素，不僅對海洋制藥工業具有重要意義，而且可為我國芋螺海洋資源的開發利用提供重要理論依據。
發明內容
本發明的目的在于提供一種中國南海疣鎬芋螺神經毒素基因Ivl. 3。本發明另一目的是提供上述神經毒素基因Ivl. 3編碼的多肽lvlc。本發明另一目的是提供上述多肽lvlc在制備神經生物學研究的工具藥和鎮痛藥物中的應用。本發明所選擇的疣鎬芋螺屬于中國南海食蟲性疣鎬芋螺(Conus lividus)，采自
海南省三亞市。本發明采用構建cDNA文庫的方法，從中國南海疣鎬芋螺毒管中克隆得到神經毒素基因Ivl. 3。中國南海疣鎬芋螺毒管cDNA文庫的構建分離毒管，提取總RNA反轉錄合成cDNA 第一鏈產物；再以A超家族的信號肽和3’ UTR為引物，以cDNA為模板通過PCR進行基因克隆，將PCR產物與pGEM-T Easy Vector相連，連接產物轉化液分別涂平板，從平板上挑取單克隆進行測序。得到中國南海疣鎬芋螺神經毒素基因Ivl. 3，其DNA序列如序列表中<400>1 序列所示。利用工具軟件SEQT00L對上述神經毒素基因Ivl. 3的堿基序列進行分析，獲得其最大讀碼框，長度l%bp，可編碼65個氨基酸殘基的前體肽。通過進一步分析，確定神經毒素基因Ivl. 3編碼的多肽Ivlc的前體肽和推測的成熟肽氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示上述多肽Ivlc的成熟肽由16個氨基酸組成，分子量為1795. 04道爾頓，具有典型芋螺毒素多肽一級結構的特征，分子內具有兩對二硫鍵，第一個和第三個半胱氨酸成一對二硫鍵，第二個和第四個半胱氨酸成另一對二硫鍵。本發明利用固相化學合成法合成上述多肽lvlc。采用儀器合成策略，運用 FmocPHOBtPDCC方法，Rink樹脂及Fmoc-氨基酸，偶聯劑為DCC-H0BT，哌啶脫Fmoc-基，合成步驟參考儀器合成手冊進行。肽-樹脂裂解試劑組成及肽回收方法與手工合成方法相同。 通過固相化學合成線性多肽，然后交叉環化成具有兩對二硫鍵以及C末端酰胺化修飾的成熟肽，經HPLC鑒定通過固相化學合成法合成的多肽Ivlc純度達到95%，MALDI-T0F鑒定其分子量正確。本發明提供的多肽Ivlc作用于青蛙坐骨神經-腓腸肌標本，可有效阻斷神經一肌接頭處的遞質傳遞并抑制肌肉收縮；而在小鼠熱板法測定生理模型上的中樞鎮痛藥效實驗中，上述多肽Ivlc作用于小鼠時表現出明顯的中樞鎮痛效果，且藥效優于陽性對照藥利多卡因。因此，本發明提供的多肽Ivlc可應用于制備神經生物學研究的工具藥和鎮痛藥物。
圖1為中國南海疣鎬芋螺毒管cDNA的凝膠電泳圖。圖2為pGEM-T Easy Vector載體環形圖譜及相關的序列位點；
圖3為神經毒素基因Lvl. 3編碼的成熟肽序列與A超家族芋螺毒素成熟肽序列的比較結果；圖4為固相化學合成多肽Ivlc的HPLC分析圖；圖5鑒定固相化學合成多肽Ivlc分子量的MALDI-T0F質譜圖；圖6為多肽Ivlc的電生理活性鑒定實驗結果圖；圖7為多肽Ivlc生理模型上的鎮痛藥效實驗結果圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例，來進一步說明本發明的技術方案。應理解，以下實施例只用于說明本發明而不以任何形式限制本發明。實施例1 疣鎬毒管組織總RNA的提取及毒素cDNA克隆總RNA的提取參照Gibcol BRL公司的TRIZOL LS試劑說明書進行。Taq DNA聚合酶、10XPCRBuffer和dNTP購自鼎國公司；PCR引物由hvitrogen公司合成；其他有機試劑均為國產分析純試劑，購自廣州化學試劑廠。取活螺體，用石工錘破碎螺殼，暴露出螺肉，冰上小心并快速分離毒管組織，稱重后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量體積的TRIZOL LS試劑(即Ig組織中加入15ml)，冰浴中充分勻漿，-80°C冰箱中保存以備提取總RNA。取50_100mg組織樣品，用 0. 75ml TRIZOL LS試劑勻漿，15_30°C靜置5min。然后加入0. 2mL氯仿，劇烈振蕩15秒后，15-30°C靜置2-15min。4°C、12，OOOrpm離心15min，取上層水相。加入0. 5ml異丙醇， 15-30°C靜置IOmin后，4°C、12，OOOrpm離心lOmin，棄上清。再加Iml 75%乙醇漂洗沉淀， 5，OOOrpm離心5min，棄上清，真空干燥去除樣品中痕量的乙醇，加入適量無RNase的去離子水。取1 μ 1進行瓊脂糖膠電泳，1 μ 1用紫外分光光度計估算RNA的濃度與純度，_20°C 保存備用。l)cDNA第一鏈的合成cDNA第一鏈的合成使用 Clontech 公司的 SMART PCR cDNA Synthesis Kit，按照說明書進行試驗。在5 μ 1反應體系中加入下列組分(于冰上操作)1 μ g螺毒管總RNA， SMART Illolignucleotide和CDS 111/3，PCR引物各1 μ 1，以超純水補齊體積，混勻，短暫離心。72°C溫育2min，冰浴2min，短暫離心，使混合物集于管底。再依次加入2 μ 1 5 XFirst Strand BufferU μ 120mmol/L 的 DTTU μ 1 10mmol/L 的 dNTP Mix 禾口 1 μ 1 PowerScript RT后輕彈管壁，混勻并短暫離心。置PCR儀42°C反應Ihr逆轉錄合成第一鏈，冰浴終止反應，-40°C保存。2) A-超家族芋螺毒素的cDNA克隆PCR引物序列上游引物5，ATGGGCATGCGGATGAT 3，下游引物5，TGGACGATGTAATAACAGCAAG 3，
PCR體系PCR程序組分體積(μ D95 "C預變性3min
權利要求
1.一種中國南海疣鎬芋螺神經毒素基因，其特征在于序列如序列表400<1>所示。
2.一種由根據權利要求1所述的芋螺神經毒素基因編碼的多肽，其特征在于該多肽的成熟肽序列如序列表400<2>所示。
3.權利要求2所述神經毒素多肽在制備神經生物學研究的工具藥和鎮痛藥物中的應
全文摘要
本發明提供一種中國南海疣鎬芋螺神經毒素基因lv1.3及其編碼的多肽lv1c，以及上述神經lv1c在制備神經生物學研究的工具藥和鎮痛藥物中的應用。本發明采用構建cDNA文庫的方法，從中國南海疣鎬芋螺毒管中克隆得到的芋螺毒素基因lv1.3，通過工具軟件SEQTOOL對堿基序列進行分析，確定上述芋螺毒素基因lv1.3編碼的多肽lv1c的成熟肽氨基酸序列如序列表400所示。本發明提供的多肽lv1c能阻斷神經肌接頭的遞質傳遞，小鼠熱板法顯示該多肽lv1c具有鎮痛作用，可用于制備神經生物學研究的工具藥和鎮痛藥物。
文檔編號C12N15/12GK102154300SQ20101062011
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者任政華, 馮宇超, 吳赟, 強媛媛, 徐安龍, 王磊 申請人:中山大學