專利名稱：一種獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種獲得真菌的方法，尤其涉及一種獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌的方法。
背景技術：
木聚糖酶(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase, EC 4. 3. 2. 8)是一種內切糖苷酶， 廣泛應用于食品、飼料、紙漿和造紙以及生物燃料等工業領域。其中不具有纖維素酶活的木聚糖酶在上述工業領域，尤其是在紙漿和造紙工業領域中具有更重要和廣泛的用途，傳統的氯漂工藝中有大量的有機氯排放到環境中，并部分殘留在紙制品中，嚴重危害人類健康， 以不具有纖維素酶活的木聚糖酶為代表的生物漂白越來越多被人們關注，木聚糖酶的處理可促進紙漿中殘余木質素的降解和溶解性木質素的抽除，而其不具有纖維素酶活的性質則避免了漂白過程對纖維素的降解帶來紙漿的得率和粘度的降低，在提高紙漿白度的同時， 也使得紙張保持了良好的纖維性能。產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的微生物中，以細菌和放線菌居多，而對于產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌所公開的報道相對較少。真菌在除了產生降解酶外，還具有一個優勢，那就是能夠通過利用菌絲的生長打開纖維素致密的結構，從而加大纖維素的利用率，所以產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌比細菌更具有利用工業價值。對于產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌的獲得，現有技術中主要通過在獲得具有半纖維素酶的真菌后測定其纖維素酶的活性，進而找到不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌，這樣目標性不強，且帶有偶然性，獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌的效率不高。
發明內容
本發明提供一種獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌的方法，通過從特定的生物材料中，使用單一性底物培養基，可高效獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌。本發明提供的獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌的方法，包括1)將從含纖維素和半纖維素生物質原料中篩出的真菌作為待篩的真菌；2)將上述待篩的真菌分別平行接種在木聚糖固體培養基上和濾紙固體培養基上進行初篩；3)將初篩得到的能在木聚糖固體培養基上生長，但不能在濾紙固體培養基上生長的真菌作為目標菌株進行復篩將所述目標菌株分別接種在液體培養基中進行培養，測定該液體培養基中木聚糖酶及與纖維素酶相關的內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和濾紙條酶的活性，能測出木聚糖酶活性，不能測出內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和濾紙條酶的活性的液體培養基中的菌株即為產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌；所述濾紙固體培養基為以濾紙為唯一碳源的固體培養基，所述木聚糖固體培養基為以木聚糖為唯一碳源的固體培養基，所述液體培養基為含纖維素和半纖維素的生物質原料的液體培養基。在本發明的一個實施例中，從含纖維素和半纖維素的生物質原料中篩出真菌的方法為將含纖維素和半纖維素生物質原料在PDA固體培養基上進行一次以上的培養以純化得到以單菌落方式生長的真菌，所述以單菌落方式生長的真菌即為待篩的真菌。本發明提供的方法中，所述PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)固體培養基為培養真菌常用的基本培養基；本發明所使用的含纖維素和半纖維素的生物質原料可以是公知的、廣義概念上的含纖維素和半纖維素的生物質原料，即，包括所有的含纖維素和半纖維素的植物以及植物的廢棄物；特別可以是狹義概念上的含纖維素和半纖維素的生物質原料，即，來自農林業生產過程中除糧食、果實以外的秸稈、樹木等含纖維素和半纖維素的部分、農產品加工業下腳料、農林廢棄物中含纖維素和半纖維素的物質。優選地，本發明所使用的含纖維素和半纖維素的生物質原料尤其可以選自包括農作物的秸稈、根、莖，木材廢棄物或紙漿中的一種或兩種以上的組合。含纖維素和半纖維素的生物質原料中含有大量的纖維素和半纖維素，在這些材料上及材料周邊的土壤、污水等中含有大量的可以降解它們的微生物，其中既包括產纖維素酶又產木聚糖酶的真菌，也包括產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌。在本發明的實施例中，優選降解狀態的(也可稱為腐敗狀態的，可以是部分腐敗的，也可以是全部腐敗的)的含纖維素和半纖維素的生物質原料(包括降解的麥秸、降解的玉米稈、降解的高粱稈、降解的甘蔗渣、降解的木材或降解的紙漿中的一種或兩種以上的組合)進行培養，這類含纖維素和半纖維素的生物質原料上及其周邊土壤、污水等中存在較多活性良好的降解纖維素和半纖維素的微生物，其中既包括產具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌，也包括產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌。本發明的方法中，在固體培養基上培養真菌的溫度和時間均可按照本領域熟知的培養真菌的溫度和時間，一般在25-35°C的溫度下進行培養，培養到可以根據菌斑的生長狀態(包括菌落形態、菌絲的形態、菌落顏色和所產色素等)分辨出不同的真菌類型即可， 針對不同的含纖維素和半纖維素的生物質原料類型對培養條件進行適當的調整。通常在
左右培養2-3天可達到要求。在液體培養基中培養時一般使用搖床控制在一定的搖速下對真菌進行培養，培養溫度和固體培養基類似，培養時間為3-5天即可。本發明提供的方法中，所述木聚糖固體培養基中木聚糖的濃度為18 25g/l ；所述液體培養基中含纖維素和半纖維素的生物質原料的濃度為10 15g/l，所述濾紙固體培養基中的濾紙為普通的滅菌濾紙。以上說明的是本發明方法中各培養環節對培養基的基本要求，當然，在制備這些培養基時，常規的營養配料也是需要的，可以根據情況具體選擇，例如，在上述限定的木聚糖固體培養基、濾紙固體培養基和液體培養基的組成的基礎上，為滿足真菌的生長需求，還可以在上述木聚糖固體培養基、濾紙固體培養基和液體培養基中加入適量的無機鹽形式的 N、P、K、Mg、Ca 元素源，如KH2PO4、NH4NO3、(NH4) 2S04、MgSO4 · 7H20 或 CaCl2 ；也可以加入適當的有機氮源，如酵母膏或胰蛋白胨等；進一步的，在固體培養基中通過加入適量的瓊脂使其在冷卻時凝固為固態；上述木聚糖固體培養基、濾紙固體培養基以及液體培養基在配置好后，分別在120°C加熱20 30分鐘左右進行滅菌。本發明提供的一種獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌的方法，通過使用濾紙固體培養基作為篩選纖維素酶菌株的單一性底物培養基，相對于目前篩選纖維素酶菌株常用的羧甲基纖維素單一性底物培養基，除了能夠反映菌株的內切葡聚糖酶活外，還可反映外切葡聚糖酶和濾紙條酶的活性，從而很好的表征纖維素總酶活，而且價格不高，更適合于用作篩選纖維素酶菌株的單一性底物培養基；另外聯合使用木聚糖固體培養基作為木聚糖酶的單一性底物培養基，使待篩選的真菌分別平行接種在木聚糖固體培養基和濾紙固體培養基上進行培養，相互對照觀察菌株的生長狀態，能夠直觀、明了的從待篩選的真菌中獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的目標菌株；進一步通過含有含纖維素和半纖維素的生物質原料的液體培養基對上述目標菌株培養后的上清中木聚糖酶、內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、和濾紙條酶的活性進行測定，來驗證所述目標菌株是否為我們所要獲得的產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌，上述方法目標性強，步驟簡單、合理科學，提高了獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌的效率。
圖IA為菌株ZH0101在濾紙固體培養基上的生長狀態圖，圖IB為菌株 T. harzianum在濾紙固體培養基上的生長狀態圖，圖IC為菌株ZH0101在木聚糖固體培養基上的生長狀態圖，圖ID為菌株T. harzianum在木聚糖固體培養基上的生長狀態圖；圖2A為菌株S4在濾紙固體培養基上的生長狀態圖，圖2B為菌株S4在木聚糖固體培養基上的生長狀態圖；圖3A為菌株W36在濾紙固體培養基上的生長狀態圖，圖菌株W36在木聚糖固體培養基上的生長狀態圖。
具體實施例方式實施例1使用本發明的方法獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌步驟1、將2-3cm長的麥秸放在PDA固體培養基上，在下進行培養，觀察菌落的生長，大約2-3天后，PDA固體培養基上長出的菌斑的生長狀態可分辨出5個不同類型的真菌的單菌落，將上述5個真菌的單菌落分別挑出，再次接種在PDA固體培養基上在下單獨培養以進行純化，最終得到5個以單菌落方式生長的不同生長狀態的真菌作為待篩的真菌；其中，PDA固體培養基的配置方法為稱取200g去皮的馬鈴薯，切成丁，煮沸大約 30min，然后16層紗布過濾，在濾液中加入20g葡萄糖、0. 3gKH2P04、0. 15g MgSO4 ·7Η20，待溶解后用自來水定容至1000ml，加入15-20g瓊脂，混勻，微波爐加熱至徹底溶解，于121°C濕熱滅菌20min。步驟2、將上述5個待篩的真菌分別平行接種在木聚糖固體培養基上和濾紙固體培養基上進行初篩，并對它們進行編號(即，每個單菌落在兩個培養基上的編號相同)，同時將能產纖維素酶又能產木聚糖酶的T. harzianum作為對照菌株平行接種在木聚糖固體培養基上和濾紙固體培養基上進行培養。所述木聚糖固體培養基的配置方法為每升培養基中含KH2P042. 0g, NH4N032. 0g, MgSO4 ·7Η200. 2g，酵母膏 5. 0g，樺木木聚糖 20. 0g，瓊脂 20. Og5H2O 1000ml，于 121°C濕熱滅菌 20min ；濾紙培養基的配置方法為每升培養基中含KH2P042. 0g, NH4N032. 0g, MgSO4 · 7H200. 2g，酵母膏 5. 0g，瓊脂 20. 0g，H2O 1000ml，調整 pH 為 7· 2，121 °C濕熱滅菌 30min，倒平板后，冷卻凝固為固體培養基，然后在每個固體培養基上平整放入一張滅菌后的濾紙；5株待篩菌株分別在木聚糖固體培養基單獨培養3天，在濾紙固體培養基單獨培養5天后，僅有一株能在木聚糖固體培養基，但不能在濾紙固體培養基上生長，命名為菌株 ZH0101，其和對照菌株T. harzianum在木聚糖固體培養基和濾紙固體培養基的生長狀態如圖IA-圖ID所示。由圖IA-圖ID可以看出，菌株ZH0101可以在木聚糖固體培養基上生長，并產生水解圈，說明該菌株能夠利用木聚糖，并具有較強的降解木聚糖的能力；菌株ZH0101不能在濾紙固體培養基上生長，說明該菌株不能利用濾紙(即沒有利用纖維素的能力)；菌株 T. harzianum在木聚糖固體培養基和濾紙固體培養基上均能生長，說明菌株T. harzianum 既能利用木聚糖又能利用濾紙；其中，菌株ZH0101和對照菌株T. harzianum在木聚糖固體培養基和濾紙固體培養基的具體生長數據如表1所示表1
權利要求
1.一種獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌的方法，其特征在于，該方法包括1)將從含纖維素和半纖維素生物質原料中篩出的真菌作為待篩的真菌；2)將上述待篩的真菌分別平行接種在木聚糖固體培養基上和濾紙固體培養基上進行初篩；3)將初篩得到的能在木聚糖固體培養基上生長，但不能在濾紙固體培養基上生長的真菌作為目標菌株進行復篩將所述目標菌株分別接種在液體培養基中進行培養，測定該液體培養基中木聚糖酶、內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和濾紙條酶的活性，能測出木聚糖酶活性，不能測出內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和濾紙條酶的活性的液體培養基中的菌株即為產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌；所述濾紙固體培養基為以濾紙為唯一碳源的固體培養基，所述木聚糖固體培養基為以木聚糖為唯一碳源的固體培養基，所述液體培養基為含纖維素和半纖維素的生物質原料的液體培養基。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，從含纖維素和半纖維素生物質原料中篩出真菌的方法為將含纖維素和半纖維素生物質原料在PDA固體培養基上進行一次以上的培養以純化得到以單菌落方式生長的真菌，所述以單菌落方式生長的真菌即為待篩的真菌。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述含纖維素和半纖維素生物質原料包括農作物的秸桿、根、莖、木材廢棄物或紙漿中的一種或兩種以上的組合。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述含纖維素和半纖維素生物質原料包括降解的麥秸、降解的玉米稈、降解的高粱稈、降解的甘蔗渣、降解的木材或降解的紙漿中的一種或兩種以上的組合。
5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述木聚糖固體培養基中木聚糖的濃度為18 25g/l。
6.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述濾紙固體培養基為含有滅菌濾紙的固體培養基。
7.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述液體培養基中含纖維素和半纖維素的生物質原料的濃度為10 15g/l。
全文摘要
本發明提供一種獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌的方法，包括將從含纖維素和半纖維素的生物質原料中篩出的真菌作為待篩的真菌，將上述待篩的真菌分別平行接種在木聚糖固體培養基上和濾紙固體培養基上進行初篩；將初篩得到的能在木聚糖固體培養基上生長，但不能在濾紙固體培養基上生長的真菌作為目標菌株在液體培養基中培養后測定酶活進行復篩，能測出木聚糖酶活性，不能測出內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和濾紙條酶的活性的菌株即為產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌。本發明的方法，通過從特定的生物材料中，使用單一性底物培養基，可高效獲得產不具有纖維素酶活的木聚糖酶的真菌。
文檔編號C12R1/645GK102154119SQ201010619998
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者王權帥, 生吉萍, 申琳 申請人:生吉萍, 申琳