專利名稱：一種3′-唾液酸乳糖的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種唾液酸乳糖的制備方法，具體涉及一種3’ -唾液酸乳糖的制備方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
隨著現代生命科學技術的迅猛發展，糖生物學逐漸成為生命科學領域的一個新的熱點。在眾多糖類物質中，唾液酸糖質原料成為最受關注的板塊之一。唾液酸一般位于機體內糖鏈部分的末端，這一位置通常是發生生理學反應的敏感端和生命信息傳遞的第一接觸位點，具有舉足輕重的地位。現階段研究已經發現唾液酸與機體內眾多的生理和病理發生有極大的關聯性，由此生命科學衍生出了以揭示唾液酸類物質的生物學功能為目標的新的研究領域“唾液酸生物學”(sialobiology)。生物體內的唾液酸大都不是以游離狀態存在的，多數情況下唾液酸與其他糖類、多肽或者酯類連接在一起形成復合物，進而發揮生理功能，如唾液酸化乳糖 (Sialylactose)、唾液酸化神經節苷酯(GMl)等。人乳中含有80多種寡糖，其中含有唾液酸的寡糖大概有40種，包括3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖、唾液酸乳-N-四糖等，而牛乳中含唾液酸寡糖含量較少，且沒有3'-唾液酸乳糖。這些唾液酸寡糖除了提供給嬰兒營養物質外，還具有抗感染、促進大腦發育和增強嬰兒免疫力等功效，而且研究證明3'-唾液酸乳糖在抗病毒和感染方面的作用比6'-唾液酸乳糖強。關于唾液酸單體在人體內的功能與作用存在很大爭議。研究表明，唾液酸單體進入機體后降解成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺，并進一步被機體當作能源物質吸收。因此唾液酸單體無法直接參與機體內大分子乳神經粘附分子、糖蛋白、糖脂等的合成。在另外一項對比人乳喂養與牛乳喂養的嬰兒發育比較研究中發現，人乳喂養嬰兒的大腦的發育較好。此外，還有研究表明，唾液酸乳糖能夠提供嬰兒對細菌和病毒的抵抗能力。由于人乳唾液酸比牛乳唾液酸含量高，這激起了奶粉生產廠家對開發模擬人乳的產品研發。目前，眾多廠商紛紛在自己生產的嬰兒奶粉中主要添加富含唾液酸寡糖的乳清粉、乳清提取物或蛋黃提取物。但是，這些外源添加物質中唾液酸寡糖成份及含量與人乳相差較大，還無法滿足模擬人乳的效果。
發明內容
本發明的目的是提供一種唾液酸乳糖的制備方法，為嬰兒奶粉添加更為有效的唾液酸類營養因子提供保障。本發明的技術方案一種產3'-唾液酸乳糖的菌株，分類命名為大腸桿菌 {Escherichia co7i)K235 WXJYL-11，已經在中國典型培養物保藏中心進行專利保藏，保藏編號 CCTCC NO :M208088。用所述菌株發酵制備3'-唾液酸乳糖的方法，工藝為
(1)高密度培養以大腸桿菌CCTCC NO :M208088為菌種，在發酵罐中添加發酵培養基，
3接種量為4%，整個發酵過程維持溫度30-37°C，通氣量1-1. 5 vvm，攪拌轉速為600-800 r/ min ；在發酵過程中流加氨水控制pH為6-7，發酵周期為32-48小時；發酵2_6小時后開始添加補料培養基，直至發酵結束前半小時停止添加，添加補料培養基的體積數與發酵培養基的體積數相當，以均速加入發酵體系內。發酵培養基成分g/L:山梨醇30，乳糖20，硫酸銨2. 5，三水合磷酸氫二鉀2.5， MgSO4 0.9，胰蛋白胨 1.5。補料培養基成分g/L 山梨醇400，硫酸銨50。(2)流加乳糖配置10_20g/L的乳糖溶液；在發酵16-20小時后，以發酵體系計 0. 5-5 g/L的恒定速率向發酵罐中流加乳糖溶液直至發酵結束前5-10小時停止流加。(3)離心除菌發酵結束后，取步驟(2)所得發酵液80°C加熱處理30分鐘，然后以 6000 rpm離心10分鐘除去菌體，得到含有唾液酸乳糖的上清液1和菌泥。(4)菌體加熱裂解將步驟(3)所得菌泥加水稀釋3 5倍，沸水浴加熱45-60分鐘，然后以IOOOOrpm離心10分鐘除去細胞碎片，得到含有唾液酸乳糖的上清液2。(5)離子交換樹脂吸附和脫吸將步驟(3)所得上清液1和步驟(4)所得上清液 2合并，加熱至80-90°C，恒溫加熱15分鐘；用截留分子量IOOODa的膜進行超濾，收集濾出液；用截留分子量500Da超濾膜處理濾出液，收集處理后的截留液；將截留液通入陽離子交換樹脂柱，用水洗脫，把培養基中的乳糖和產物3'-唾液酸乳糖分開，收集富含3'-唾液酸乳糖的洗脫液。(6)真空干燥將步驟(5)所得洗脫液進行真空濃縮，然后再進行噴霧干燥，即獲得產品3'-唾液酸乳糖。步驟(5)所述陽離子交換樹脂為Diaion UBK 530，即酸磺化聚苯乙烯-二乙烯基苯Na型或K型樹脂。所述3 ‘-唾液酸乳糖結構如下所示
權利要求
1.一種產3'-唾液酸乳糖的菌株，分類命名為大腸桿菌(fecAericAia co7i)K235 WXJYL-11,已經在中國典型培養物保藏中心進行專利保藏，保藏編號CCTCC NO :M208088。
2.用權利要求1所述菌株發酵制備3'-唾液酸乳糖的方法，其特征在于工藝為(1)高密度培養以大腸桿菌CCTCCN0:M208088為出發菌種，在發酵罐中添加發酵培養基，接種量為4%，整個發酵過程維持溫度30-37 °C，通氣量1-1. 5 vvm,攪拌轉速為 600-800 r/min ；在發酵過程中流加堿液氨水控制pH為6_7，發酵周期為32-48小時；發酵 2-6小時后開始添加補料培養基，直至發酵結束前半小時停止添加，添加補料培養基的體積數與發酵培養基的體積數相當，以均速加入發酵體系內；發酵培養基成分g/L 山梨醇30，乳糖20，硫酸銨2. 5，三水合磷酸氫二鉀2. 5，MgSO4 0.9，胰蛋白胨1.5 ；補料培養基成分g/L 山梨醇400，硫酸銨50 ；(2)流加乳糖配置10-20g/L的乳糖溶液；在發酵16-20小時后，以發酵體系計0.5-5 g/L的恒定速率向發酵罐中流加乳糖溶液直至發酵結束前5-10小時停止流加；(3)離心除菌發酵結束后，取步驟(2)所得發酵液80°C加熱處理30分鐘，然后以6000 rpm離心10分鐘除去菌體，得到含有唾液酸乳糖的上清液1和菌泥；(4)菌體加熱裂解將步驟(3)所得菌泥加水稀釋3 5倍，沸水浴加熱45-60分鐘，然后以IOOOOrpm離心10分鐘除去細胞碎片，得到含有唾液酸乳糖的上清液2 ；(5)離子交換樹脂吸附和脫吸將步驟(3)所得上清液1和步驟(4)所得上清液2合并，加熱至80-90°C，恒溫加熱15分鐘；用截留分子量IOOODa的膜進行超濾，收集濾出液； 用截留分子量500Da超濾膜處理濾出液，收集處理后的截留液；將截留液通入陽離子交換樹脂柱，用水洗脫，把培養基中的乳糖和產物3'-唾液酸乳糖分開，收集富含3'-唾液酸乳糖的洗脫液；(6)真空干燥將步驟(5)所得洗脫液進行真空濃縮，然后再進行噴霧干燥，即獲得產品3'-唾液酸乳糖。
3.根據權利要求1所述3'-唾液酸乳糖的制備方法，其特征在于步驟(5)所述陽離子交換樹脂為Diaion UBK 530，即酸磺化聚苯乙烯-二乙烯基苯Na型或K型樹脂。
全文摘要
一種3′-唾液酸乳糖的制備方法，屬生物工程技術領域。本發明以大腸桿菌CCTCC NOM208088為出發菌種，在發酵罐中添加發酵培養基，發酵2-6小時后添加補料培養基，發酵中后期流加乳糖；將所得發酵液離心得上清液1和菌體，將離心后菌體加水稀釋并加熱裂解，再次離心得上清液2，然后將所得上清液1和上清液2合并，通過離子交換樹脂吸附和脫吸、真空干燥得到產品3′-唾液酸乳糖。本發明通過大腸桿菌CCTCC NOM208088菌株大量制備3′-唾液酸乳糖，該產品可改變傳統嬰兒奶粉中外源添加物質中唾液酸寡糖成份偏少的現狀，為嬰兒奶粉添加更為有效的唾液酸類營養因子提供保障。
文檔編號C12P19/12GK102154163SQ20101061733
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者朱莉 申請人:朱莉