專利名稱：一種改進的研究蛋白互作的雙分子熒光互補載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種載體以及制備該載體的方法，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
蛋白互作是細胞中的一項基本生理作用，發生在所有亞細胞結構及細胞器中的每一個生理過程.闡明蛋白質的相互作用在何時、何地發生以及蛋白質復合物如何形成，能為確定蛋白質生物學作用提供決定性線索。雙分子焚光互補(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)是利用熒光蛋白的發光原理研究蛋白互作的一項技術.其主要過程是將熒光蛋白切成N端和C端兩部分，分別與目標蛋白連接，重組載體共轉染細胞.若目標蛋白間存在相互作用，則會牽引熒光蛋白的N端片段與C端片段相互靠近，進而形成熒光蛋白生色團重新發出熒光.因此，在熒光顯微鏡下檢測是否有互補熒光產生，即可推斷出兩目標蛋白是否發生了相互作用(圖1)。與常用的研究蛋白互作的免疫共沉淀、表面等離子共振、酵母雙雜交技術相比， BiFC具有簡單直觀等優點，已成為活細胞內研究蛋白質運動和功能的強有力工具。目前用于BiFC載體構建通常有兩種方法。一種方法是先將熒光基因通過稀有限制性內切酶克隆到中間載體，然后再轉移到雙元表達載體。此方法存在一些不足之處首先稀有限制性內切酶比較昂貴，而且不容易酶切與連接，這將大大增加研究過程中的難度。其次，先后連接到中間載體、雙元表達載體，此過程比較復雜、繁瑣。另一種方法是采用GATEWAY載體，此方法雖然快速、高效，但所用試劑價格昂貴。因此，采用一種低成本且高效的方法構建所需的載體是極其必要的。
發明內容
鑒于上述原因，本研究提供一種用于研究分子以研究雙分子熒光互補的載體，該載體包括CaMV 35S啟動子和CaMV 35S終止，在CaMV 35S啟動子和CaMV 35S終止子之間包括cEYFP盒或nEYFP盒。在一個具體的方式中，在cEYFP盒或nEYFP盒前插入有正向的CaMV 35S啟動子， 在cEYFP盒或nEYFP盒后插入正向的CaMV 35S終止子。優選的，該載體包括如下結構；根據權利要求2所述的載體，其特征在于， 該載體包括如下結構=EcoRI-XbaI-正向的CaMV 35S啟動子-cEYFP盒或nEYFP 盒-SalI-KpnI-BamHI-CaMV 35S 終止子。更優選的，該載體包括如下結構該載體包括如下結構=Ec0RI-XbaI-正向的2個 CaMV 35S 啟動子-nEYFP 盒-SalI-KpnI-BamHI-CaMV 35S 終止子；和 EcoRI-XbaI-正向的 2 個 CaMV 35S 啟動子-cEYFP 盒-ps11-Sa 11-KpnI-BamHI-CaMV 35S 終止子-HindIII。優選的，CaMV 35S終止子的序列包括SQl ；cEYFP盒的序列包括SQ 4 ；nEYFP盒包括SQ :2。優選的，利用該載體研究蛋白分子之間的互作功能。另一方面，本發明提供一種構件用于研究雙分子熒光互補的雙元載體的方法，包括⑴、提供基礎載體PCAMBIA1301，將CaMV3k終止子通過Hind ΙΙΙ/Xba I插入到 PCAMBIA1301的多克隆位點，從而消除了位于Hind III和)(ba I間的酶切位點，消除的酶切位點為Ml I、Pst I和Sph I ； (2)用)(ba I和EcoR I雙酶切步驟(1)中獲得的 pCAMBIA1301-CaMV35s 終止子載體，Xba I 單酶切 cEYFP 盒-pMD18_T 或 nEYFP 盒-pMD18_T， 回收上述兩種酶切產物；并將酶切產物進行粘性末端補平；C3)通過cEYFP盒或nEYFP盒連接至補平的PCAMBIA1301-終止子載體中，借此消除了 pCAMBIA1301-3k終止子MCS上位于 Xba I和EcoR I之間的酶切位點，包括BamH I、Sma I, Kpn I.Sac I, Ban II等酶切位點， 同時也產生了新的)(ba I和EcoR I酶切位點，挑取正向連接的克隆。這樣產生了單個酶切位點而避免多酶切。在一個優選的方式中，CaMV 35S終止子的序列包括SQl ;cEYFP盒的序列包括SQ ；4 ；nEYFP盒包括SQ :2。在一個優選的方式中，利用在步驟3中產生了可用酶切位點，如下一個載體中包括如下結構=EcoRI-XbaI-正向的 2 個 CaMV 35S 啟動子-nEYFP 盒-Sa 11-KpnI-BamHI-CaMV 35S終止子；另一個載體結構包括如下結構=EcoRI-XbaI-正向的2個CaMV 35S啟動子-cEYFP 盒-ps11-Sa 11-KpnI-BamHI-CaMV 35S 終止子-HindIII。本領域的一般技術人員都應該理解，與上述PCAMBIA1301載體的骨架可以從市場上購買，也包括克隆CaMV 35S終止子的序列；cEYFP盒的序列和nEYFP盒的序列都可以通過購買一些模板進行人工自行克隆，也可以通過人工直接合成這些序列。另外，在人工克隆 cEYFP盒的序列和nEYFP盒的序列的時候，還可以一并克隆一些啟動子以及開放閱讀框架以及一些酶切位點。這樣把這些序列正向連接并正向插入到CaMV 35S終止子前。在消除了原來載體骨架上的多克隆位點的同時也產生了一些多克隆位點，但是避免產生了重復的同一多克隆位點，這樣避免被雙酶切。
圖1為BiFC分析技術原理示意圖，其中YFP熒光蛋白被剪切為N端和C端兩部分， 這兩部分不能產生熒光，兩個靶蛋白分別與nYFP和cYFP融合，如果二者互作，則重新產生熒光(a)；如果沒有互作，則不產生熒光(b)。圖2為本發明的技術路線圖。圖3為pCAMBIA1301 (pCAMBIA1301載體圖譜，其中消除的原載體上的酶切位點由黑框標注，為 Ban II Sac I、Kpn I、Sma I、BamH I 禾口 Sal I、Pst I 禾口 Sph I。圖 4 為 CaMV 35S terminator-pMD18-T 酶切、PCR 驗證結果圖。1 :DL2000marker ； 2 CaMV 35Sterminator-pMD18-T PCR 產物(212bp) ；3 =CaMV 35S terminator-pMD18_T 酶切產物(Xba I/Hind III，212bp) ；4 =CaMV 35S terminator-pMD18_T 質粒。圖 5 為 nEYFP 盒和 cEYFP 盒 PCR 圖；1 :DL2000marker ；2 nEYFP 盒 PCR 驗證；3 cEYFP盒PCR驗證。圖 6nEYFP 盒-pMD 18-T 酶切圖；1 :DL2000marker ；2 :nEYFP 盒-pMD 18-T 質粒； 3:nEYFP 盒-pMD 18-T Xba I 酶切驗證。圖 7cEYFP 盒-pMD18T 酶切圖；1 :DL2000marker ；2 cEYFP 盒-pMD 18-T 質粒；3 cEYFP 盒-pMD 18-T Xba I 酶切驗證。圖 8pCAMBIA1301-nEYFP-35s terminator 正向連接酶切驗證圖。1:DL2000marker ；2 :pCAMBIA1301-nEYFP_35s terminator 質粒；3 :pCAMBIA1301-nEYFP_35s terminator正向連接酶切驗證Q62bp)圖 9pCAMBIA1301-cEYFP-35s terminator 正向連接酶切驗證圖；1 DL2000marker ；2 :pCAMBIA1301-cEYFP_35s terminator 質粒；3 :pCAMBIA1301-cEYFP_35s terminator正向連接酶切驗證Q62bp)。圖 10 為改造好的 pCAMBIA1301-nEYFP-ter 載體。圖 11 改造好的 pCAMBIA1301-cEYFP_ter 載體。圖 12LeCBL3 的 PCR 克隆。圖 13 :LeCIPK8 的 PCR 克隆。圖14 =LeCIPK 8m片段1和片段2的PCR克隆。圖 15 :Le CIPK 8m 的 PCR 克隆。圖16 =LeCBL 3與LeCII3K 8蛋白互作觀察。其中，圖16_1、16_4為暗視野下觀察圖；圖16-2、16-4為明視野中觀察圖；圖16-3、16-6為明暗視野下疊加圖。其中16_1、2和 3 為 LeCBL3 與 LeCIPK 8 的互作；16-4、5 和 6 為 LeCBL 3 與 LeCIPK 8m 的互作。圖17為)(ba I和EcoR I酶切位點的形成恢復示意圖。本發明的有益效果是獲得的載體轉化效率高，而且載體的成本底，生產載體的效率高；(2)使用載體表達的蛋白效率高；(3)在實驗過程中，酶切所用的BamH I.Sal I, Kpn I等均為常用的限制性內切酶，酶切與連接非常簡便、快捷，不需要連接到中間載體，簡化了整個實驗過程，大大降低了實驗成本，提高了實驗效率。
具體實施例方式在本發明的具體方式中，利用pCAMBIA1301(pCAMBIA1301載體圖譜，見圖3)為骨架，通過消除該載體上的多克隆位點(multiple cloning site, MCS)中的酶切位點(Ban II、Sac I、Kpn I、Sma I、BamH I.Sal I,Pst I、Sph I)，同時，在消除酶切位點的 MCS 處添加CaMV35S終止子、cEYFP盒或nEYFP盒等步驟，構建一個便捷、便宜的操作平臺。若要研究某些可能互作的蛋白，只要把目的蛋白對應的基因克隆至上述兩個雙元表達載體的MCS 上，隨后轉化農桿菌，將含目的雙元表達載體的農桿菌注射本氏煙，熒光共聚焦顯微鏡觀察是否產生熒光，即可獲得目的蛋白的互作情況。具體技術路線圖見圖3。具體采用以下方法獲得第一部分構建pCAMBIA1301-cEYFP-35s 和 pCAMBIA1301_n EYFP_35s 載體實驗1-克隆 CaMV 35S terminatorpSAT4-nEYFP-cl上的CaMV 35S terminator終止子為全部已知序列，序列信息可從NCBI中查詢，在很多載體中都有該序列。我們所用的中的終止子也是從其它載體上而來。如果不用pSAT4-nEYFP，我們也完全可以通過自有載體來獲得。模板pSAT4-nEYFP-cl 由美國紐約州立大學石溪分校Vitaly Citovsky教授惠贈，本研究中克隆CaMV 35S terminator所用的引物序列見(表1)。表1克隆CaMV 35S terminator所用引物對及預期擴增長度引物名稱序列(5' -3',下劃線代表酶切位點)預期擴增長度 (bp)wcc-216 (F)TCTAGAGTCCGCMAMTCACCAGTCT (IdaI ) (SQ14)212wcc-217 (R)AAGCTTCtiTCACTGGATTTTGGTTTTA (/find !Π) (SQ15) 設計引物，分別在上下游引物添加Xba I/Hind III酶切位點。以pSAT4-nEYFP_Cl 為模板，克隆CaMV 35S terminator，割膠回收連至pMD18_T并送上海生工測序部測序。 CaMV 35S terminator 片段 PCR 擴增體系wcc-216(F)0. 5 μ 1wcc-217(R)0. 5 μ 110XPCR buffer2. 0 μ 1dNTPs1. 0μ 1rTaq 酶0. 2 μ 1ddH2014.8 μ 1pSAT4-nEYFP-cl 質粒 1· 0 μ 1_Total20 μ 1PCR反應程序940C 5min — [94°C 30s — 55°C 30s — 72°C 30s] 32X — 2V IOmin — 10°C forever。實驗結果見圖4，從圖4可發現，CaMV 35S terminator-pMD18_T經PCR、酶切驗證均可獲得212bp左右的片段。克隆的CaMV 35S terminator序列如下012個核甘酸) ((SQl))1 GTCCGCAAAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATTTTTCTCCAGAAT61 AATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGT121 TGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAA181 TTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTGACG將克隆的CaMV 35S terminator 序列與已知 CaMV 35S terminator 序列在 NCBI 比對后發現上游引物TCTAGAGTCCSCAAAAATCACCAGTCT中缺失一個G堿基，可能在引物合成過程中賽百盛公司工作人員操作失誤，但由于終止子主要起調節作用，不編碼氨基酸，因此不影響后續實驗。實驗2.構建 pCAMBIA1301-35S terminator 載體將CaMV 35S terminator 通過Hind ΙΙΙ/Xba I 插入到 pCAMBIA1301 (圖 2)的多克隆位點，從而消除了位于Hind III和)(ba I間的酶切位點(包括Ml I、Pst I和Sph I)。為進一步驗證是否已真正將CaMV 35S terminator連接至pCAMBIA1301，并成功消除7 PCAMBIA1301上位于Hind III和Xba I之間的多克隆位點，通過PCR(wcc_216， wcc-217)及酶切(Hind ΙΙΙ/Xba I)，可獲得212bp左右的片段，表明我們克隆的CaMV 35S terminator 連接至 pCAMBIA1301，而通過 Sal I、Pst I 分別對上述 pCAMBIA1301_35S terminator載體進行但酶切，其酶切產物與質粒無明顯區別，表明我們已成功地消除了位
6于Hind III和Xba I之間的多克隆位點。實驗3.克隆cEYFP盒和nEYFP盒pSAT4-nEYFP-cl-DH5 α 和 pSATl-cEYFP-cl-B_DH5 α 由美國紐約州立大學石溪分校Vitaly Citovsky教授惠贈。以pSAI^-nEYFP-cl/pSATl-cEYFP-cl為模板，因為本發明中欲克隆的nEYFP盒、cEYFP盒中兩端序列相同，因此設計了同一對引物(引物序列見表2)。 該序列(nEYFP或cEYFP)為已知序列，也可以從NCBI中查詢。如果沒有該質粒，我們可以通過自有的YFP模板來擴增，多克隆位點堿基序列可通過公司進行合成。表2克隆cEYFP盒和cEYFP盒所用引物對及預期擴增長度
引物名稱序列(5’ -3’，下劃線代表酶切位點) 預期擴增長(bp)“
wcc-218 (F) TCTAGAGTGGAGCACGACACACTTGTCT(Xba I ) (SQ16) 1161 (cEYFP 盒) wcc-219 (R) TCTAGATCAG6TGGATCCCGGG iXba l ) (SQl7) 1476 ( nEYFP盒)
—-~‘-----------—~‘~P---------------—· -..........1 ----—-- 克隆cEYFP盒和nEYFP盒的PCR擴增體系wcc-218wcc-21910XPCR bufferdNTPsEx-Taq 酶
ddH20
pSAT4-nEYFP-cl 或 pSAI^-cEYFP-cl-B 質粒
0. 5μ 1 0. 5μ 1 2μ 1 1 μ 1 0. 2μ 1 14. 8μ 1 1 μ 1
Total20 μ 1
PCR程序
94°C 5min — [94°C 40s — 72°C 40s — 72°C 30s] 35X — 72°C IOmin — 10°C foreve以 pSATl-cEYFP-Cl-B 和 pSAT4_nEYFP_Cl 為模板，克隆相應的 cEYFP 盒和 nEYFP 盒，分別割膠回收cEYFP盒和nEYFP盒并連接至pMD 18-T載體，送上海生工測序部測序。從圖5、6及7可發現，nEYFP盒-pMD18_T和cEYFP盒-pMD18_T經PCR、酶切驗證均可獲得1476bp和1161左右的片段。具體測序結果如下cEYFP盒序列(SQ4)以及對應的氨基酸序列((SQO)如下 1 gtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaa61 agggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgc121 ccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgc181 catcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaa241 gatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttca301 aagcaagtggattgatgtgataacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaat361 atcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaata
權利要求
1.一種用于研究蛋白互作的雙分子熒光互補載體，其特征在于，該載體包括CaMV 35S 啟動子和CaMV 35S終止，在CaMV 35S啟動子和CaMV 35S終止子之間包括cEYFP盒或nEYFP品.ο
2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，在cEYFP盒或nEYFP盒前插入有正向的 CaMV35S啟動子，在cEYFP盒或nEYFP盒后插入正向的CaMV 35S終止子。
3.根據權利要求2所述的載體，其特征在于，該載體包括如下結構=Ec0RI-XbaI-正向的 CaMV 35S 啟動子-cEYFP 盒或 nEYFP 盒-SalI-KpnI-BamHI-CaMV 35S 終止子。
4.根據權利要求3或1所述的載體，其特征在于，該載體包括如下結構 EcoRI-XbaI-正向的 2 個 CaMV 35S 啟動子-nEYFP 盒-SalI-KpnI-BamHI-CaMV 35S 終止子； 和 EcoRI-XbaI-正向的 2 個 CaMV 35S 啟動子-cEYFP 盒-pstl-SalI-KpnI-BamHI-CaMV 35S 終止子-HindIII。
5.根據權利要求1-4之一所述的載體，其特征在于，CaMV35S終止子的序列包括SQ 1。
6.根據權利要求1-4之一所述的載體，其特征在于，cEYFP盒的序列包括SQ4 ；nEYFP 盒包括SQ :2。
7.根據權利要求1-4之一所述的載體，其特征在于，所述的分子為蛋白分子。
8.—種構件用于研究雙分子熒光互補的載體的方法，包括(1)、提供基礎載體PCAMBIA1301，將CaMV3k終止子通過HindΙΙΙ/Xba I插入到 PCAMBIA1301的多克隆位點，從而消除了位于Hind III和)(ba I間的酶切位點，消除的酶切位點為 Ml I>Pst I 和 Sph I ；(2)、用XbaI和EcoR I雙酶切步驟(1)中獲得的pCAMBIA1301_CaMV3k終止子載體， Xba I單酶切cEYFP盒-pMD18_T或nEYFP盒-pMD18_T，回收上述兩種酶切產物；并將酶切產物進行粘性末端補平；(3)、通過cEYFP盒或nEYFP盒連接至補平的pCAMBIA1301_終止子載體中，借此消除了 pCAMBIA1301-35s terminator MCS 上位于 Xba I 和 EcoR I 之間的酶切位點，包括 BamH I、 Sma I,Kpn I.Sac I,Ban II等酶切位點，同時也產生了 )(ba I和EcoR I酶切位點，挑取正向連接的克隆。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，CaMV35S終止子的序列包括SQ:1。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，cEYFP盒的序列包括cEYFP盒的序列包 SQ 4 ；nEYFP 盒包括 SQ :2。
全文摘要
本發明提供一種用于研究蛋白互作的雙分子熒光互補載體，該載體包括CaMV 35S啟動子和CaMV 35S終止，在CaMV 35S啟動子和CaMV 35S終止子之間包括cEYFP盒或nEYFP盒。構建此載體成本低，構建效率高。
文檔編號C12N15/63GK102168102SQ20101061721
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者俞盼盼, 馮采芬, 宋凱, 李茶姿, 楊玲, 楊莉, 王偉, 王鋒青, 王長春, 趙奕銘 申請人:浙江師范大學