專利名稱：高效表達人源重組蛋白GLP1/Fc的CHO-S細胞株及其建立方法
CN 102533655 A高效表達人源重組蛋白GLPI/Fc的CHO-S細胞株及其建立方法技術領域
本發明屬于生物制藥領域，涉及一種高效表達人源重組蛋白GLPI/Fc的CHO-S細胞株及其建立方法。
背景技術：
糖尿病是造成人類死亡的主要原因之一，嚴重危及人類健康。國際糖尿病聯盟公布的世界衛生組織對糖尿病發病現狀和發展趨勢的最新預測顯示，全球已經診斷的II型糖尿病患者已達一億三千萬人。本世紀糖尿病將在中國、印度等發展中國家流行。到2025 年，全球糖尿病患者人數將突破三億，中國的糖尿病患者總數將占其中三分之一。截至目前，中國的糖尿病患者人數已經超過五千萬，并以年增加5-6%的速率增長。
I型糖尿病和II型糖尿病是糖尿病的兩種主要形式。I型和II型糖尿病人都表現有進行性的胰島β-細胞質量減少和β-細胞功能的降低，而β-細胞的程序性死亡是I 型和II型糖尿病胰島細胞的主要原因。胰島素療法是治療I型糖尿病的主要手段。II型糖尿病占糖尿病患者的比率約為90-95%。
I型糖尿病人的治療方式主要是給予胰島素注射或胰島移植。對于II型糖尿病人來說，使用胰島素增敏劑和胰島素分泌促進素是主要的藥物治療方式。
傳統的糖尿病的治療僅側重于緩解如高血糖等主要癥狀，而不是針對II型糖尿病真正的發病原因。國際上目前的主流觀點認為，糖尿病發病的真正原因是胰島細胞的程序性死亡。
現已證實多種激素可以促進β-細胞生長，包括生長因子、胰島素樣生長因子、催乳素、表皮生長因子和最近發現的腸胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)。
胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)是一種腸促胰島素，它具有促進胰島素分泌，抑制胰升糖素釋放，抑制胃排空的作用。其重要的功能是促進細胞的生長，增加細胞的數量，能使II型糖尿病人的β -細胞功能恢復到正常水平。
GLP-I的另外一個優點是它降血糖作用是葡萄糖依賴性的，因此不會產生低血糖。 在這一點上甚至優于胰島素。此外，它還能改善機體胰島素抵抗及改善機體血脂水平。研究顯示GLP-I也可能對I型糖尿病患者有效。比如能減少對外源胰島素的用量。由于GLP-I 在體內的半衰期很短(約1分鐘)，因此，致力尋找具有GLP-I同樣作用的長效類似物(腸降糖素類似物)是近幾年國際藥界的關注熱點。
GLPI/Fc融合蛋白主要特點是半衰期更長，功效更強。實驗已證明其注射一次可維持藥效4-6周，具有很強的競爭優勢。由于它的二聚體結構的特點可顯著加強同為二聚體的GLP-I受體的親和力，使藥效更強。該融合蛋白直接作用于GLP-I受體，促進胰臟β-細胞再生，分泌胰島素和葡萄糖耐受性，激活cAMP和其耦聯的第二信使途徑，促進β -細胞中蛋白激酶(Aktl和ΜΑΡΚ)的表達并增加其含量，降低細胞凋亡的關鍵酶caspase-3的活性。 因此該融合蛋白能夠從根本上預防和治療I型和II型糖尿病。
基因重組技術的建立為生產治療用蛋白開辟了新途徑。由于原核細胞外源基因表達系統自身的局限性難以克服，真核細胞外源基因表達系統廣泛應用于表達需要翻譯后修飾的生物活性蛋白，特別是哺乳動物表達系統具有準確的轉錄后修飾功能，與原核細胞表達系統和酵母細胞表達系統比，表達的糖基化蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近天然蛋白分子，是目前重組蛋白生產的首選體系。
在不同的哺乳動物細胞的表達系統中，CHO-S中國倉鼠卵巢細胞外源蛋白表達系統經過多年的實踐運用，已經成為最成功的表達外源蛋白的哺乳動物細胞系。其優點是外源基因能夠穩定整合于細胞內，且該細胞系易于規模化培養。發明內容
本發明的目的在于提供了一種高效表達人源重組蛋白GLPl/Fc的細胞株CHO-S， 本發明通過將帶有人源GLPl/Fc基因的質粒轉染至CHO-S細胞，經篩選后，獲得穩定、高效表達人源重組蛋白GLPl/Fc的CHO-S (GLPl/Fc)單克隆細胞株。
為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現
高效表達人源重組蛋白GLPl/Fc的CHO-S細胞株，它由帶有GLPl/Fc基因的pMTE2 質粒載體轉染至CHO-S宿主細胞中制得。
進一步的，所述CHO-S (GLPl/Fc)單克隆細胞株的目的蛋白GLPl/Fc的表達量達到 9. 25ug/24h · IO6 細胞。
又進一步的，高效表達人源重組蛋白GLPl/Fc的CHO-S細胞株的建立方法包括以下步驟
(1)用陽離子脂質體將pMTE2質粒載體轉染至CHO-S細胞株中；
(2)用含有Hygromycin B的選擇培養基篩選整合GLPl/Fc基因的穩定轉染細胞株；
(3)通過Dot blot方法篩選出能夠表達人源GLPl/Fc重組蛋白的陽性克隆；
(4)將得到的陽性克隆于二氧化碳培養箱中搖養，待生長至平臺期時收集所分泌蛋白液；所述CHO-S細胞株在培養過程中分泌表達GLPl/Fc重組蛋白于培養基中；
(5)用Wfestern blot方法檢測收集蛋白液中GLPl/Fc的相對表達量。
再進一步的，高效表達人源重組蛋白GLPl/Fc的CHO-S細胞株，其用途在于制備治療I型和II型糖尿病方面的藥物中的應用。
由于采用本發明的技術方案，本發明與現有技術相比具有以下優點CH0_S(GLP1/ Fe)單克隆細胞株分泌產生GLPl/Fc融合蛋白，GLPl/Fc融合蛋白直接作用于GLP-I受體， 促進胰臟β-細胞再生，分泌胰島素和葡萄糖耐受性，促進β-細胞的生長，增加β-細胞的數量，能使II型糖尿病人的β -細胞功能恢復到正常水平。
具體實施方式
實施例1
本發明的具體制備方法描述如下
1.實驗材料
1. 1細胞系
CH0-S，中國倉鼠卵巢細胞。
1. 2主要試劑
1.2.1 CD CHO無血清培養基
⑶CHO培養基干粉M.3g，加入950ml滅菌水，攪拌至完全溶解，調節PH值至 6. 8-7. 2之間，加滅菌水至1000ml，用0. 22um濾膜過濾除菌，4°C保存。
1.2.2轉染試劑
轉染所用的試劑為Lipofectamin2000 (Invitrogen 公司)。
1.2.3選擇培養基
在IOml液體CD CHO無血清培養基中，加入終濃度為lmg/ml的Hygromycin B。
1. 2. 4 一抗
兔抗人IgG/HRP，使用濃度為1 1000稀釋。
2.方法和結果
2. 1細胞復蘇
按照常規細胞復蘇方法從細胞庫中取出一支凍存細胞，迅速置于預熱至37°C的恒溫水浴鍋中，邊輕輕搖動邊融化，待融化完畢后，立即消毒凍存管外壁，在生物安全柜內將細胞懸液轉移至含有約6ml⑶CHO無血清培養基的培養方瓶中，于36. 5°C，8%二氧化碳的培養箱中進行培養。
2. 2細胞擴增
待方瓶中培養的CHO-S長到80%左右時，按照1 1的比例轉移至一次性三角搖瓶中進行搖養，根據細胞生長狀況，搖瓶內可不斷添加新鮮培養基，最多添加至搖瓶體積的三分之一，搖養的轉速根據搖瓶內液體體積進行調整，一般在eOrpm-lOOrpm之間。待細胞生長至2-3 X IO6個/ml時可分養。
2. 3質粒載體的構建
轉染所用的質粒載體由加拿大多倫多大學提供。
2. 4待轉染細胞的制備
將搖瓶中生長至對數期的細胞進行計數，根據計數結果將細胞分養至6孔板中， 每個孔的細胞密度在8-16X IO5個/ml。
2. 5細胞的轉染
CHO-S (GLPl/Fc)細胞的轉染采用脂質體法，轉染所用的試劑為 Lipofectamin2000 (Invitrogen 公司)。
2. 6細胞的篩選
細胞轉染24h后，更換新鮮的CD CHO選擇培養基(含lmg/ml的Hygromycin B)， 同時將轉染細胞稀釋后加入96孔板中，于37°C，8%二氧化碳中培養1 2周，中間換一次選擇培養基，直至細胞克隆形成。
2. 7Dot blot
細胞篩選至第十天左右，對96孔板做Dot blot實驗。每個孔取Iul培養液進行點樣，用封閉液室溫封閉lh，后用一抗(兔抗人IgG/HRP，1 1000稀釋)室溫孵育池，用 TBST緩沖液洗6次，每次5min，于暗室下用ECL進行化學發光。根據曝光情況，篩選出6個陽性克隆。
2. 8對陽性克隆放大培養
將篩選出的6個陽性克隆分別進行擴養。首先分別轉移至M孔板中進行培養，待鋪滿M孔板底部時再轉移至6孔板進行培養，同時補加新鮮的CD CHO無血清培養基；長滿后分別轉移至一次性三角搖瓶中進行搖養，待生長至平臺期，分別收獲各個陽性克隆的蛋白液。
2. 9ffestern blot
對放大培養的陽性克隆收集蛋白液，采用AKTA親和層析提取細胞培養液中的蛋白。對提取的蛋白樣品做Western blot實驗，鑒定、分析其蛋白表達量。將蛋白樣品經 SDS-Page電泳后，轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶進行封閉lh，然后用一抗(兔抗人 IgG/HRP, 1 1000稀釋)室溫孵育濁，用TBST緩沖液洗6次，每次5min，于暗室下用ECL 進行化學發光。根據化學發光情況，計算出蛋白表達量約5. 36-9. 25ug/24h · IO6細胞。
本發明構建出能夠穩定轉染人源GLPl/Fc基因的哺乳動物細胞系，并通過藥物篩選，獲得能夠穩定、高效表達該重組蛋白的單克隆細胞株。CH0-S(GLP1/Fc)單克隆細胞株的目的蛋白GLPl/Fc是一種腸促胰島素，它具有促進胰島素分泌，抑制胰升糖素釋放，抑制胃排空的作用。重要的功能是促進細胞的生長，增加細胞的數量，能使II型糖尿病人的細胞功能恢復到正常水平。目的蛋白GLPl/Fc的另外一個優點是它降血糖作用是葡萄糖依賴性的，因此不會產生低血糖。
權利要求
1.高效表達人源重組蛋白GLPl/Fc的CHO-S細胞株，其特征在于它由帶有GLPl/Fc基因的pMTE2質粒載體轉染至CHO-S宿主細胞中制得。
2.如權利要求1所述的高效表達人源重組蛋白GLPl/Fc的CHO-S細胞株，其特征在于所述CHO-S (GLPl/Fc)單克隆細胞株的目的蛋白GLPl/Fc的表達量達到9. 25ug/24h-106細胞。
3.如權利要求1所述的高效表達人源重組蛋白GLPl/Fc的CHO-S細胞株的建立方法， 它包括以下步驟(1)用陽離子脂質體將PMTE2質粒載體轉染至CHO-S細胞株中；(2)用含有HygromycinB的選擇培養基篩選整合GLPl/Fc基因的穩定轉染細胞株；(3)通過Dotblot方法篩選出能夠表達人源GLPl/Fc重組蛋白的陽性克隆；(4)將得到的陽性克隆于二氧化碳培養箱中搖養，待生長至平臺期時收集所分泌蛋白液；所述CHO-S細胞株在培養過程中分泌表達GLPl/Fc重組蛋白于培養基中；(5)用Wfesternblot方法檢測收集蛋白液中GLPl/Fc的相對表達量。
4.如權利要求1或3所述的高效表達人源重組蛋白GLP/Fc的CHO-S細胞株，其用途在于制備治療I型和II型糖尿病方面的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種高效表達人源重組蛋白GLP1/Fc的細胞株CHO-S，通過將帶有人源GLP1/Fc基因的質粒轉染至CHO-S細胞，經篩選后，獲得穩定、高效表達人源重組蛋白GLP1/Fc的CHO-S(GLP1/Fc)單克隆細胞株。本發明獲得的CHO-S(GLP1/Fc)單克隆細胞株分泌產生GLP1/Fc融合蛋白，GLP1/Fc融合蛋白直接作用于GLP-1受體，促進胰臟β-細胞再生，分泌胰島素和葡萄糖耐受性，促進β-細胞的生長，增加β-細胞的數量，能使II型糖尿病人的β-細胞功能恢復到正常水平。
文檔編號C12N5/10GK102533655SQ20101061710
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月21日 優先權日2010年12月21日
發明者劉吉, 吳立明, 王長偉, 胡珊珊, 高義才, 黃冰 申請人:青島黃海制藥有限責任公司