專利名稱：一種貽貝酶解ace抑制肽的提取技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術，可應用于水產品加工，生物與 食品工程技術領域等。
背景技術：
血壓的常期升高，可引起腦、心、腎等靶器官的損害，它極易引起腦血栓、腦卒中、 老年性癡呆癥等多種疾病，直接威脅患者的生命安全，被視為中老年人的頭號健康殺手。 根據國內外大量隨機對照的臨床試驗結果，收縮壓降低10 - 14mmHg和舒張壓降低5 — 6mmHg，腦卒中減少2/5，冠心病減少1/6，總的主要心血管事件減少1/3，所以降壓治療就顯 得尤為必要。研究表明，在高血壓人群中，約有9 5%的患者為原發性高血壓，在這一病因 中，腎素一血管緊張素這一升壓酶系是其中最重要的一個因素，在該酶體系中，ACE (angiotensin-converting enzyme),即血管緊張素轉換酶的作用最為重要，不具有生理 活性的Ang I (血管緊張素I)經過血管緊張素轉換酶的作用，轉換成具有收縮血管壁平滑 肌作用的Ang II (血管緊張素II)，導致血壓上升；另一方面，具有擴張血管平滑肌從而使 血壓下降的血管舒緩激肽又會在血管緊張素轉換酶的作用下被分解而失去活性，從而加劇 血壓上升。ACE抑制肽實質是一種對ACE酶活性具有抑制作用的生物活性肽。通過它的作用， 可使ACE酶活性受到抑制，從而減少或阻礙有升高血壓作用的血管緊張素II的生成，并抑 制具有降血壓作用的血管舒緩激肽的分解，因此起到降血壓的作用。另一方面，與化學合成 的降血壓藥物相比，ACE抑制肽具有兩大優點
1. ACE抑制肽通常是由食用級酶在溫和條件下處理食品原料蛋白獲得，已經實驗證實 無任何毒副作用，這與化學合成降壓藥對人體肝、腎等有較大副作用且易引發咳嗽、浮腫、 頭暈等不適反應相比，有極高的安全性。2. ACE抑制肽屬生物活性肽，它只對高血壓患者起到降壓作用，對血壓正常者則無 降壓作用，這種降壓作用的選擇性是普通的化學合成降壓藥所不具備的。由于ACE抑制肽的獨特優勢，加之其明顯的降血壓效果，近年來倍受國際研究界 矚目1979年Oshima等首次用細菌膠原酶降解明膠獲得具有較強降壓活性的肽段，從中分 離出六條ACE抑制肽，并通過kphadex G_25證實其活性部分大部分集中在分子量較小片 斷；Smachi等從酪蛋白的酶解物中分離出一種具有降血壓活性的短肽，用其飼喂SHR (自發 性高血壓大鼠)，發現其血壓下降了約IOmmHg,而對正常大鼠則無降血壓作用。Maruyamas 等以酪蛋白的某些片斷為目標合成肽，發現其與酶解獲得的ACE抑制肽有相同活性。Saito 以清酒水解物和從水解物中分離出的Val - Tyr, His 一 Tyr, Arg 一 Phe等飼喂SHR，發現 均可使其血壓明顯下降，但隨著SHR的增長，Val - Tyr, His 一 Tyr, Arg 一 Phe等的降壓 效果逐漸消失，而清酒水解物的降壓效果則變化不大。Kim等對不同蛋白酶水解牛皮膠制 備ACE抑制肽研究表明，其因酶種不同而有不同的水解程度，降血壓活性也不盡相同，并非水解程度最大時降壓效果就最好。此后學術界對ACE抑制肽的研究進入一個高潮，已報道有以牛奶、乳酪、大豆、魚 肉、蔬菜、小麥蛋白等食物為原料，經蛋白酶酶解產生了具有較好ACE抑制活性的ACE抑制 肽。Eiji等水解了 12種食物蛋白進一步研究發現，短肽類(含2-4個氨基酸殘基)比稍長 肽鏈(含10-12個氨基酸殘基)有更好的ACE抑制活性。此外還發現，從魚肉、蝦、蟹等水 產動物蛋白中制得的ACE抑制肽其降壓活性優于其它食物性蛋白。國外對于以水產蛋白為原料研究ACE抑制肽的成果主要還有=Matsui等用蛋白 酶水解沙丁魚制得ACE抑制肽，發現其ACE抑制活性為IC50=0. 26mg Protein/ml (即使 ACE活性抑制50%時所需ACE抑制肽濃度)，當用10%的乙醇洗提，其抑制活性可提高到 Ic50=0. 015mg Protein/ml ；同時研究發現，這些ACE抑制肽主要以酸性氨基酸為主，含較 少的疏水性氨基酸[21]。Astawan用胰蛋白酶、胃蛋白酶等水解魚干，發現用胃蛋白酶水解 的ACE抑制肽其ACE抑制活性較佳，用其飼喂SHR大鼠三個月，可使其血壓下降IOmmHg左 右，而且還發現其ACE抑制活性片斷的氨基酸序列主要為Val - Ala 一 Trp 一 Lys 一 Leu, Trp — Ser — Lys — Val — Val — Leu, Ser — Lys — Val — Pro — Pro,其 IC50 分另Ij為 31.97,156.觀和74. 2ang Protein/ml [22]。目前，日本已有用沙丁魚制取的ACE抑制肽問 世，患者每人每天試用6克，可使血壓下降10毫米汞柱。Cushman等研究ACE抑制肽的降壓機理，認為是ACE抑制肽能與ACE的活性部位 結合，可對Ang 1(血管緊張素I)與ACE作用產生競爭性抑制，影響了血管緊張素II的產生， 從而起到降血壓作用。同時研究表明當ACE抑制肽肽鏈中含巰基時，會增加其與ACE的結 合能力，使其降壓活性提高。Tzyli等認為，由于ACE抑制肽的降壓活性與其肽鏈上特定的基團及氨基酸序列 有關，而其經口服后，由于胃腸消化系統中所含的酶的分解作用，其結構會有所改變，從而 影響其降血壓活性。Mastsui等研究了胃腸消化酶對口服ACE抑制肽的降壓活性的影響， 認為部分原本不具降壓活性的肽段在各種酶的作用下，釋放出具有生理活性的基團，而同 時部分原本具有生物活性的肽段則失去生理功能，認為需從兩個方面綜合考慮消化系統對 ACE抑制肽的作用影響。 2003年Marczak等研究用胰酶酶解菠菜得到四種具有較好ACE抑制活性的短肽 MRffRD, MRff, LRIPIA 和 IATKPAG。其 ACE 抑制活性的 IC50 分別為 2. 1,0. 6,0. 38 和 4. 2um。 以SHR大鼠做降壓實驗，分別以100mg/kg的劑量口服在2-4小時內其降壓效果分別為15， 0，20和13. 5mmHg,這與其體外實驗結果有很大差異。這些結果也驗證了 Matsui等的理論。我國在ACE抑制肽領域的研究起步相對較晚，現有報道以大豆、蛇毒、老酒、茶葉 為原料，對ACE抑制肽的制備工藝和活性基團等方面進行了一定研究；對于最適合用于ACE 抑制肽制備的水產動物蛋白的開發研究，則鮮有報道。與此同時，作為世界第一水產大國， 我國的水產加工水平相當落后，在此領域的基礎研究也較為薄弱，加大在該領域的研究和 投入已刻不容緩。貽貝，又名海紅、淡菜，近年來人工養殖取得重大成功，在我國東南沿海產量豐富。 貽貝營養豐富，其蛋白質含量約為鮮肉重的9-10%，氨基酸種類齊全，且富含牛磺酸、鈣、鎂、 硒等營養元素。據《本草綱目》記載，貽貝有益精血、滋陰補腎等功效。但因為其鮮品不 易保存，因此常被加工成干品銷售。由于產品單一，近年來市場銷量受到一定限制，給有關方面造成較大的經濟損失。而國內目前對于貽貝的開發利用，還主要集中在調味品，水解氨基酸液等研究開 發的階段慶寧等分析了貽貝的營養成份，發現其中蛋白質、氨基酸等含量較高，必需氨基 酸占總氨基酸量的33%，且富含牛磺酸、鈣、鎂、硒等營養元素；章超樺等發現貽貝中谷氨 酸、天門冬氨酸等呈味氨基酸含量豐富，因此海鮮味濃郁，研究將其用于調味料的開發；鄧 尚貴等研究了不同酶法水解貽貝氨基酸液的特點，并得到幾種酶分步水解的最佳條件；劉 志峰等研究了貽貝提取物抗高血脂作用發現貽貝提取物可有效降低食餌性高血脂大鼠的 血漿膽固醇和甘油三酯；但對于利用貽貝為原料開發ACE抑制肽的研究卻仍屬空白，這非 常令人惋惜。
發明內容
本發明針對現有技術，提供一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術。所述的一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術，其特征在于采用如下工藝步驟
1)取新鮮貽貝去殼，剖殺，搗碎形成肉糜；
2)取步驟1)所得肉糜IOOOgJn1. 5倍重的水，蒸煮10分鐘；
3)待步驟2)所得冷卻后，加入CA堿性復合蛋白酶進行酶解，對應酶解條件 酶量 100Iu/ml
酶解時間Ih PH 5. O
酶解溫度45° C；
4)步驟3)酶解結束后再加入木瓜蛋白酶進行第二次酶解，對應酶解條件 酶量 25-50Iu/ml
酶解時間2-4h PH 7. 0-8. 5 酶解溫度昍-60° C；
5)步驟4)酶解結束后滅酶，然后過濾；
6)取步驟幻所得濾液冷凍干燥，得ACE抑制肽粉劑11.5g。所述的一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術，其特征在于所述步驟4)對應的酶解 條件為
酶量 25Iu/ml 酶解時間池 PH 7. O
酶解溫度60° C。所述的一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術，其特征在于所述步驟5)中的采用 90° C高溫滅酶。所述的一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術，其特征在于所述步驟6)中濾液冷凍 干燥的條件為-25° C，-50Kp。本發明選用貽貝這一產量豐富、營養價值高的水產品為原料，通過生物酶解、冷凍 干燥成型等制備ACE抑制肽，經試驗證明，其具有顯著的降血壓效果，本發明工藝簡單，可
5產業化制造，具有很高經濟價值和社會效益。
具體實施例方式以下對本發明作進一步說明
本發明采用如下工藝步驟制取ACE抑制肽1)取新鮮貽貝去殼，剖殺，搗碎形成肉糜； 2)取步驟1)所得肉糜lOOOg，加1.5倍重的水，蒸煮10分鐘；3)待步驟2)所得冷卻后，加入 CA堿性復合蛋白酶進行酶解，對應酶解條件酶量100Iu/ml，酶解時間lh，PH 5.0，酶解 溫度45° C ；4)步驟3)酶解結束后再加入木瓜蛋白酶進行第二次酶解，對應酶解條件酶 量25Iu/ml，酶解時間2h，PH 7.0，酶解溫度60° C ；5)步驟4)酶解結束后升溫到90° C 滅酶，然后過濾；6)取步驟幻所得濾液于-25° C，-50Kp條件下冷凍干燥，得ACE抑制肽 粉劑11. 5g，檢測其ACE抑制率為58. 6%。試驗一加入木瓜蛋白酶的酶解效果
制備7份5)中得到的樣品，并編號1-7，分別按表1中的酶解條件加入木瓜蛋白酶，酶 解結束后得到酶解液，按以下方法計算ACE抑制率
1、將反應液(K3P04 IOOmM, pH8. 3; Nacl 300mM; HHL 5mM)量取 0· 25 毫升，加入試管。分別加入酶解液1毫升(對照組加蒸餾水)。取0.15毫升ACE液(5mM)于反應液中，37°C水浴保溫30分鐘。加入0.25毫升IN濃度的Hcl充分攪拌以終止反應。、加入1.5毫升醋酸乙酯，渦淪攪拌，以萃取反應生成的Hippuric Acid,收集上清液。6、將上清液于100°C水浴加熱約20分鐘，以蒸發掉醋酸乙酯，然后加入3毫升蒸餾 水，充分振蕩。7、將此溶液于228nm下用紫外分光光度計測定其吸光值。8、將各酶解液反應值與空白樣品對照，分析所得ACE抑制肽的ACE抑制活性。計 算公式為A2^ — (對照)\A2^X 100%。試驗結果如表1所示。
表
權利要求
1.一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術，其特征在于采用如下工藝步驟1)取新鮮貽貝去殼，剖殺，搗碎形成肉糜；2)取步驟1)所得肉糜IOOOgJn1. 5倍重的水，蒸煮10分鐘；3)待步驟2)所得冷卻后，加入CA堿性復合蛋白酶進行酶解，對應酶解條件 酶量 100Iu/ml酶解時間Ih PH 5. 0酶解溫度45° C；4)步驟3)酶解結束后再加入木瓜蛋白酶進行第二次酶解，對應酶解條件 酶量 25-50Iu/ml酶解時間2-4h PH 7. 0-8. 5 酶解溫度昍-60° C；5)步驟4)酶解結束后滅酶，然后過濾；6)取步驟幻所得濾液冷凍干燥，得ACE抑制肽粉劑11.5g。
2.如權利要求1所述的一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術，其特征在于所述步驟4) 對應的酶解條件為酶量 25Iu/ml 酶解時間池 PH 7. 0酶解溫度60° C。
3.如權利要求1所述的一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術，其特征在于所述步驟5) 中的采用90° C高溫滅酶。
4.如權利要求1所述的一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術，其特征在于所述步驟6) 中濾液冷凍干燥的條件為-25° C，-50Kp。
全文摘要
本發明涉及一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術。所述的一種貽貝酶解ACE抑制肽的提取技術，采用如下工藝步驟1)取新鮮貽貝去殼，剖殺，搗碎形成肉糜；2)取步驟1)所得肉糜加1.5倍重的水，蒸煮10分鐘；3)待步驟2)所得冷卻后，加入CA堿性復合蛋白酶進行酶解；4)步驟3)酶解結束后再加入木瓜蛋白酶進行第二次酶解；5)步驟4)酶解結束后滅酶，然后過濾；6)取步驟5)所得濾液冷凍干燥得ACE抑制肽粉劑。本發明選用貽貝這一產量豐富、營養價值高的水產品為原料，通過生物酶解、冷凍干燥成型等制備ACE抑制肽，經試驗證明，其具有顯著的降血壓效果，本發明工藝簡單，可產業化制造，具有很高經濟價值和社會效益。
文檔編號C12P21/06GK102127580SQ20101061235
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者毋瑾超 申請人:國家海洋局第二海洋研究所