專利名稱：小麥耐鹽抗氧化基因TaFLS及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及小麥耐鹽抗氧化基因，即小麥次生代謝類黃酮合成途徑基因TaFLS及其應用。
背景技術：
土壤鹽漬化嚴重影響農作物產量。而工業的發展使得土壤鹽漬化愈發嚴重，已成為一個全球性的問題。我國土壤鹽漬化更為嚴重，人口眾多，糧食危機尤為突出。因此，培育耐鹽農作物新品種已成為我國當前一個十分迫切的任務。利用轉基因改良植物技術將新的性狀轉入作物中，以此開發高效的轉基因植物新品種并用于在鹽堿地種植，是一項具有廣闊應用前景的技術。目前，利用基因工程技術開展植物耐鹽方面研究已取得了較大的的進展，克隆了大量相關基因，并將這些基因轉入植物中，用于耐鹽機制研究。一些實驗表明，將植物本身以及其他生物中與耐鹽相關的基因轉入植物中，其異源轉錄和翻譯產物可以使轉基因植物的抗鹽能力提高。類黃酮在植物中具有多種功能，除了充當色素以及植物與微生物互作的信號分子，誘導植物根部與共生菌相互作用以及抵御病菌、昆蟲和一些草食動物的侵襲之外，還能阻止高鹽等非生物脅迫對植物的傷害。例如，在對兩種不同水稻品種(鹽不敏感型FL478， 鹽敏感型IR29)進行鹽脅迫表達譜分析，發現鹽敏感型頂四在鹽脅迫下黃酮類合成途徑被誘導，PAL、CHS、CHI、F3’ H和DFR均上調表達；鹽耐受型和鹽敏感型甘蔗兩品系在鹽脅迫下可溶性多酚類物質、花色素以及黃酮含量均升高，并且耐受型品系的上升幅度分別是敏感型的2. 5,2. 8和3. 0倍。高鹽是最常見的非生物逆境之一，因而系統了解植物耐鹽機制非常必要。多年來， 大量研究已在DNA、RNA和蛋白質水平上比較深入地闡明了植物的鹽脅迫應答機制，但在次生代謝水平上仍然知之甚少，特別是類黃酮代謝與植物耐逆的關系尚無報道，因而有必要對類黃酮在植物鹽脅迫應答中的作用機制進行探討。而通過對類黃酮生物合成途徑調控小麥類黃酮的含量對小麥的品質改良也有重要意義。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種小麥耐鹽抗氧化基因，S卩小麥次生代謝類黃酮合成途徑基因TaFLS及其應用。本發明的技術方案在于從小麥中分離得到小麥次生代謝類黃酮合成途徑基因 TaFLS,然后將該基因轉到小麥等農作物中以實現農作物在鹽漬化土壤中種植，重復利用次質土壤。本發明提供的小麥耐鹽抗氧化基因名稱為小麥次生代謝類黃酮合成途徑基因 TaFLS，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本發明還提供了含上述的小麥耐鹽抗氧化基因TaFLS的植物表達載體PSTART-iTaFLS。本發明所述基因TaFLS在培育抗鹽抗氧化植物中的應用。其中所述植物優選是普通小麥或擬南芥。為了便于對轉基因植物或細胞系進行篩選，可以對含有所述基因TaFLS的植物表達載體(pSTART)進行加工，如可以加入選擇標記(⑶S等)或者具有抗性的抗生素標記物 (潮霉素，卡那霉素，慶大霉素等)等。事實上，任何一種可以將外源基因導入植物中表達的載體都可以應用于本發明， 本發明優選的載體是PSTART。本發明所述的基因可廣泛用于培育抗鹽抗氧化農作物品種。本發明的有益效果利用現有的植物基因工程技術，本發明首次克隆得到了小麥次生代謝類黃酮合成途徑基因TaFLS，并將該基因轉入擬南芥，經過比較分析證明，轉基因植株的耐鹽、抗氧化能力明顯提高。
圖1 TaFLS基因全長cDNA序列的擴增結果-陰性對照；M分子量標記；箭頭所指為目的片段。圖2鹽脅迫下山融3號(SR3)和濟南177(JN177)根系中TaFLS及該通路其他相關基因的RT-PCR分析。圖3pET3h_TaFLS在大腸桿菌DE3中的誘導表達及純化目的蛋白1 大腸桿菌未經過IPTG誘導；2 大腸桿菌16°C經過IPTG誘導Mh，超聲破碎細胞經離心后沉淀總蛋白；3 超聲破碎細胞離心后上清液；4 上清液經過HIS磁珠純化后得到的目的蛋白；M 蛋白質分子量Marker ；箭頭表示純化后蛋白。 圖4植物表達載體pSTART-TaFLS構建A =TaFLS片段的高保真酶擴增，箭頭所指為目的片段；B :pSTART雙酶切)(baI和BamHI，箭頭表示酶切的線性pSTART質粒條帶；C :pSTART-TaFLS表達載體雙酶切)(baI+BamHI驗證，箭頭表示酶切的TaFLS條帶；圖5pSTART_TaFLS轉基因株系的PCR鑒定。A :DNA水平檢測，從不同轉基因擬南芥株系(如3、4、5、6、13、14、15、16、23)提取 DNA,以TaFLS特異性引物擴增的TaFLS條帶，箭頭代表擴增片段；B :mRNA表達水平分析，從不同轉基因擬南芥株系(如3、4、5、6、13、14、15、16、23) 提取RNA，以TaFLS特異性引物擴增的TaFLS條帶，AtActin為擬南芥Actin基因表達；數字代表轉基因株系，VC代表轉pSTART空載體轉基因植株，ColO代表Col型野生擬南芥，-代表陰性對照，M代表分子量marker。圖6TaFLS體外酶活分析圖6A =TaFLS底物DHQ和DHK及產物Q和K標準品的HPLC分析；圖6B 以轉化pET3h空載體的大腸桿菌蛋白提取物和DHQ和DHK體外反應后的 HPLC分析，只能檢測到底物峰，沒有出現產物Q和K峰；圖6C 以轉化PET3h-TaFLS大腸桿菌蛋白提取物和DHQ和DHK體外反應后的HPLC 分析，能檢測到底物DHQ、DHK及產物Q、K峰，表明TaFLS能夠催化DHQ和DHK。
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圖7 處理下轉基因擬南芥株系及對照株系的表型分析VC 轉入pSTART空載體的轉基因對照株系；0E1/0E2 轉入pSTART-TaFLS基因的兩個株系；A :l/2MS+0mM H2O2 ；B :l/2MS+0. 3mM H2O2 ；C 1/2MS+0. 5mM H2O2 ；D l/2MS+4mM H2O2 ；E和F 轉基因株系0E1/0E2 H2O2處理后主根長度及側根數目統計分析；G :8mM H2O2處理下種子萌發率。數據表明TaFLS轉基因擬南芥在H2A脅迫下的生長能力、萌發率均優于對照株系。圖SNaCl脅迫下轉基因擬南芥株系及對照株系的表型分析VC 轉入pSTART空載體的轉基因對照株系；0E1/0E2 轉入 pSTART-TaFLS 基因的株系；A :l/2MS+0mM NaCl ；B :l/2MS+100mM NaCl ；C :l/2MS+150mM NaCl ；D :l/2MS+200mM NaCl ；E 轉基因株系0E1/0E2 NaCl處理后主根長度統計分析；數據表明TaFLS轉基因擬南芥在NaCl脅迫下的生長能力優于對照株系。
具體實施例方式
實施例1、TaFLS的克隆1. 1 提取小麥 iTotal RNA1.將組織材料放入液氮預冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；2.待液氮揮發干，立即轉移到aiil的離心管中，每IOOmg材料約加入Iml的 Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加樣槍反復吸吹，劇烈振蕩混勻樣品，使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘；3.加入0. 2ml氯仿(chloroform)，劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘；4. 4"C，12000rpm 離心 15 分鐘；5.用移液器小心吸出上層水相，加入新的1. 5ml的離心管中，加入500 μ 1的異丙醇(1 1體積)，充分混勻，-20 0C，沉淀30min或過夜；6. 40C，12000rpm離心lOmin，小心棄去上清液；7. RNA沉淀用Iml的75%乙醇洗滌。4°C，8000rpm離心IOmin收集沉淀；8.重復用75 %乙醇洗滌一次RNA沉淀；9.去上清，RNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10-15分鐘，RNA略顯透明，加入適當體積(30-50 μ 1)的RNase-free水充分溶解(可放于_80°C長期保存)；10.紫外分光光度計及1 % Agrose凝膠電泳檢測RNA濃度及質量。注a)用紫外分光光度計檢測RNA的產量，在260nm處的吸光度，10D = 40ug/ ml。根據在260nm和280nm處的吸光值，檢測RNA的純度，純RNA的0D26(1/0D28(1比值應接近 2. 0 (比值最好在1. 9 2. 1之間)。b)用1 % Agrose凝膠電泳檢側RNA的質量及大小。吸取Iul RNA力卩入3 μ 1的 RNase-free水，加1 μ 1上樣緩沖液65°C變性5分鐘。電泳后用EB染色，另取3 μ 1的11Λ DNAMarker作為對照。1. 2 第一鏈 cDNA 的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)1. Poly-A RNA controls 的制備(用 Poly-A control dilution buffer 稀釋Poly-Acontrol stock)，按照下面的比例稀釋
RNA總量總RNA mRNA
第一次稀
梯度稀釋稀釋第二次稀
取樣
釋釋
lug 1 201 5015μ g 1 201 50110 μ g 0. 2μ g 1 201 501
2.反應體系
反應試劑體積
RNA 樣品(lug/ul)8μ 1
Diluted poly-A RNA controls2μ 1
T7_ol igo(dT)Primer,50uM2μ 1
RNase-free water0μ 1
總體積12μ 1
將上述試劑樣品輕輕混勻，70°C溫浴10分鐘，置于冰上至少
3.期間按照下表配制剩余組分
反應試劑體積
5 X 1st Strand Reaction Mix4μ 1
DTT (0· 1M)2μ 1
dNTP(IOmM)1 μ 1
總體積7 μ 1
混勻，42 °C，溫浴2分鐘；2uL (8 16ug起始)。
4.將混合液加入已經完成反應的12 μ 1 RNA/T7-oligo(dT)
第三次稀釋
50 10 5
口量
ΒΠ
2μ 1 2μ 1 2μ 1
勻，輕微離心50秒，加入1μ 1 superscript II RT QOOU/μ 1)，使總反應體積為20 μ 1。混勻后立即放入42°C溫育1小時，4°C冷卻5分鐘。1. 3 第二鏈 cDNA 的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)1.將1st cDNA合成產物置于冰上，加入下列試劑試劑組分體積RNase-Free water91 μ 15X 2nd Strand Buffer30 μ 1dNTP (IOmM)3μ 1Ε.coli DNA Ligase(10U/ul) 1 μ 1Ε. coli DNA Polymerase (10U/ul) 4μ 1Ε· coli RNase H(10U/ul)1 μ 1總體積130 μ 1混勻，16 °C，反應2小時；2.加入 2 μ 1 T4DNA Polymerase,混勻，16°C，5 分鐘；
3.加入10 μ 1 EDTA (0. 5Μ)，混勻，終止反應。_20°C保存。
1. 4開放閱讀框的克隆和序列測定
1.引物序列根據測序結果，設計基因上下游引物，擴增基因的開放閱讀框。
2. PCR反應體系(50 μ L)
2XGC buffer I10 μ 1
模板cDNAIul
dNTPs(2. 5mM each)0. 5μ 1
Primerl(IOyM)1 μ 1
Primer2(10yM)1 μ 1
LA Taq(TaKaRa)0. 5ul
(MH2O加至終體積50 μ 1
3. PCR反應程序為94°C預變性5min ；94°C變性45sec，55°C復性45sec，72°C延伸
lmin，循環 35 次；72°C延伸 7min。4.擴增片段的回收、與T載體的連接轉化方法同上，測序由上海hvirtron公司完成。結果見圖1。1. 5 基因表達分析(RT-PCR 和 real-time PCR)a.脅迫下RNA的提取山融3號(SR3)和濟南177(JN177)種子正常萌發，Hangload培養液培養至株高約IOcm時(約3周時間)開始施加鹽脅迫QOOmM NaCl)。分別在處理后的0、1、6、12，M 小時取幼嫩根系，Trizol法提取RNA，方法同上。b.逆轉錄(RT)產生cDNA逆轉錄產生cDNA，方法同上。c. PCR反應及電泳1.以cDNA為模板，進行PCR反應。引物如下TaAct-S :5，-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3，TaAct-A :5，-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3，2. PCR 體系ddH2013. 5μ 1IOXTaq buffer(Mg2+free) 2μ 1MgCl2(25mM)1. 2μ 1Primerl(IOyM)1 μ 1Primer2(10yM)1 μ 1dNTP (IOmM each)0. 2 μ 1rTaq polymerase(5U/μ 1)0. 1 μ 1逆轉錄cDNA模板Ιμ Total Volume20 μ 13. PCR 程序95°C 5min，25 30 cycles 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 35s ；72°C 7min.根據內參Actin的擴增情況確定PCR的循環數，調整cDNA模板的加入量。4. 瓊脂糖凝膠電泳。
結果見圖2。實施例2、原核表達分析2. 1原核表達載體的構建所用表達載體為Pet32a，受體菌為DE3。選用Hind III和EcoR I分別對pET32a 和含有目的基因的PMD18-T載體進行雙酶切，分別回收載體大片段和目的基因小片段，用 T4 DNA連接酶連接后轉化大腸桿菌DHlOB感受態細胞，鑒定重組子后即得到帶有目的基因的原核表達載體，然后轉化受體菌DE3感受態用于蛋白表達。1. PET32a 和 pMD18_T 的酶切堿裂解法提取ρΕΤ3^ι和pMD18-T的質粒，各取IOul進行HindIII和EcoR I雙酶切。質粒提取方法如上，質粒雙酶切體系如下EcoRI1 μ 1HindIII1 μ 1IOXK buffer1 μ 1質粒300ngddH20至 20μ1于37°C恒溫水浴鍋酶切4小時以上。2.酶切質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測及回收方法同上。3.基因與酶切得到的pET2^大片段的連接連接反應組成10 X連接酶緩沖液1 μ 1Τ4 DNA 連接酶Ιμ 回收基因目的片斷6μ1回收產物 pETMa2μ 1力nddH2O至終反應體積10μ 1，16°C連接過夜(回收目的基因與pET2^的摩爾比為 4 1)。4.轉化大腸桿菌，方法同上。5.重組子的鑒定①質粒的酶切鑒定挑取單菌落分別接種于5ml含kan的LB液體培養基中37°C震蕩培養過夜，堿變性法提取質粒，選取合適的酶進行酶切，1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有預期分子量大小的片段。②質粒的PCR驗證用基因特異引物進行PCR擴增，的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有預期分子量大小的片段。6.轉化受體菌DE3構建好的原核表達載體熱擊法轉化大腸桿菌DE3感受態細胞，篩選與鑒定方法同上。2. 2樣品的制備蛋白質提取液400mg SDSIOOmg DTT
2. 5ml 0. 5M Tris-HCl (pH6. 8)2ml glycerol3mg溴酚蘭混合后，加蒸溜水至10ml。1.將含有表達片段的陽性克隆接種于5ml含卡那霉素30 U g/ml的LB液體培養基 中，37°C振蕩培養3-5小吋。到0D600約為1. O吋，吸出Iml菌液留作對照組。2.其余的培養液中加入IM的IPTG使終濃度分別為0. 6mM。20で培養30h誘導誘 導蛋白的表達。3.未誘導和誘導的菌液都加入1. 5ml離心管中，lOOOOrpm離心Imin收集菌體，棄 上清，加入100 ill蛋白提取液，旋潤振蕩混勻，沸水浴lOmin，13000rpm離心15min，上清備用。2. 3 SDS-PAGE 電泳1.藥品配制(I)IOX 電極緩沖液取！"ris 30. 3g, Glycine 144g, SDS lOg，加蒸溜水溶解后定 容至 IOOOml ；( 40%丙烯酰胺母液(Acr)取40g Acr，加蒸溜水溶解后定容到IOOml ；(3)2%甲叉雙丙烯酰胺(Bis)；取2g Bis-Acr，加蒸溜水溶解后定容到IOOml ；(4) 3mol/L Tris-HCl(pH 8.8)取 36. 3g !"ris 溶入蒸溜水，定容至 100ml，用 Imol/L 的 HCl 調 pH 至 8. 8 ；(5) Imol/L Tris-HCl(pH 6.8)取 12. Ig I^ris 溶入蒸溜水，定容至 100ml，用 Imol/L 的 HCl 調 pH 至 6. 8 ；(6) 10% SDS 稱取SDS粉末IOg加蒸溜水溶解定容至IOOml ；(7) 10% AP 稱取過硫酸銨Ig加蒸溜水溶解定容至IOml ；(8) TEMED 購自 Amersham 公司；(9)固定染色液取20ml冰醋酸，80ml甲醇加蒸溜水定容至200ml，稱取200mg考 馬斯亮藍R-250溶解于上述溶液中。2. SDS-PAGE 凝膠的制備(1)玻璃板洗浄干燥之后，用瓊脂封板。玻璃板放到制膠架上(帶耳膠板在 外)，用夾子固定，向下端封ロ的塑料槽中加入適量熔化的瓊脂，窬置，直至瓊脂凝固。(2)配膠按照下表中的比例配制12%分離膠和4%濃縮膠。聚丙烯酰胺凝膠組成12%分離膠^toil 4%濃縮膠IOml40% Acr7.62ml0.986ml2% Bis4.16ml0.54ml3M Tris-HCKpH 8.8)3.28ml——IM Tris-HCl (pH6.8)——1. 25ml10% SDS0.26ml0.1ml蒸溜水10.56ml7.14mlTEMED10.4u 1IOu 110% APS98 U 175 U 1
(3)倒入分離膠后，在膠面上加一層正丁醇，靜置，直至分離膠凝固。(4)倒置膠板，流出正丁醇，用蒸餾水沖洗膠面，用濾紙吸盡多余的水，配制濃縮膠，混勻后倒入玻璃板之間，將梳子放置在玻璃板間，注意不要產生氣泡，靜置至膠凝。(5)將膠板從制膠架上取下，去凈膠板下部殘留的瓊脂；將膠板固定到電泳槽上 (帶耳膠板在內)，直立電泳槽，夾子固定膠板。(6)拔出梳子，向電泳槽下槽加入電泳緩沖液，吹出進入玻璃板之間的氣泡。將 8μ1樣品液點入點樣孔中。然后將電泳槽放入4°C層析柜中，注意要水平，IOmA穩流電泳至指示劑遷移至凝膠底部后繼續電泳30分鐘，再停止電泳。(7)電泳結束，取下膠板，揭開玻璃板，露出膠，用刀片切去濃縮膠，切掉分離膠一角作標記，進行染色。(8)染色與脫色。取下膠，置200ml染色液中搖蕩染色過夜，然后轉移到裝有蒸餾水的塑料盤中搖蕩脫色2-4小時，其間更換蒸餾水數次，直至到背景脫色干凈為止。(9)保存結果。脫色干凈的膠的電泳圖譜用凝膠成像儀照相保存并分析。3.融合蛋白純化及蛋酶性檢測(1)含有重組質粒的大腸桿菌細胞在含有50mg/L卡那霉素的LB培養基中37°C培養。直至0D_約為0.6，加入IPTG，使終濃度為0. 5mM，37度培養5-6小時。誘導蛋白表達。(2)收集細菌細胞，40mL初始緩沖液(20mM磷酸鉀緩沖液，pH7. 4,0. 5mMNaCl)重 ；塁、ο(3)加入5mg溶菌酶室溫30min裂解細胞。(4)冰浴20200W超聲波破碎細胞10s，每次間隔10s。12000rpm離心15min 4度。(5)用0. ImM的NiS04平衡Hi-iTrap (Amersham)柱子。蛋白純化方法參考chu等 (chu，2003)。BSA 法測定蛋白含量參考 Bradford’ s(1976)。(6)得到的蛋白產物用15% SDS-PAGE電泳。考馬斯亮藍R-250染色觀察。結果見圖3。實施例3、載體的構建和轉化農桿菌3. 1 35S啟動子植物表達載體的構建植物表達載體pSTART是含有35S啟動子和NPT II基因的雙元載體，在其多克隆位點上含有限制性內切酶)(bal和BamHI位點。分別用限制性內切酶)(bal和BamHI雙酶切載體pSTART和目的基因片斷。完全酶切的載體在瓊脂糖凝膠上電泳分離后，經膠回收、 然后與雙酶切的cDNA片段相連，構建獲得植物表達載體。酶切體系，轉化大腸桿菌DHlOB 感受態，鑒定重組子。連接、回收、轉化及鑒定方法同上。結果見圖4。3. 2農桿菌AGL1/EHA105感受態的制備(1)從YEP平板(含50yg/ml利福平)上挑取根癌農桿菌單菌落，接種于含 50 μ g/ml利福平的YEP液體培養基中，200rpm/min，培養過夜。(2)取2ml過夜培養液接種于50ml含相同抗生素的YEP液體培養基中在相同條件下培養至OD6c 達0.5。(3)菌液冰浴 30min，4°C，5000rpm 離心 lOmin，收集菌體。(4)將菌體重懸于冰浴的IOml 0. 15mol/L的NaCl中，離心收集菌體。(5)再懸浮于Iml 20mmol/L冰預冷的CaC12溶液中，以200 μ 1/管將菌液分裝在
101. 5mlEppendorf管中，置液氮中速凍Imin，_70°C保存備用。3. 3凍融法轉化根癌農桿菌AGL1/EHA105(1)在室溫下融化農桿菌感受態細胞，WAlyg表達載體質粒DNA，混勻后冰浴 30mino(2)置液氮速凍Imin，迅速移至37°C保溫;3min。(3)加入無抗生素的YEP 800μ震蕩培養3hr。(4) 7000rpm離心30s收集菌體，涂于含50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml Kan的YEP平板上，倒置暗培養2-3天。3. 4菌體PCR鑒定菌體PCR方法及程序同上。實施例4、TaFLS體外酶活分析4. 1酶活反應體系(以底物DHQ為例)400 μ 1反應體系10* α -酮戊二酸(IOOmM)10* 抗環血酸(IOOmM)20*硫酸亞鐵(5mM，其中含200mM抗環血酸)10* 甘氨酸(500mM)100*DHQ(10mM)TaFLS 蛋白HEPES (50mM)4. 2 酶反應條件:25°C 90min反應結束后加入乙酸乙酯終止反應并抽提，而后45°C真空抽干，得到目的產物，用 80%色譜甲醇溶解，進HPLC液相分析4. 3HPLC條件高效液相色譜儀(日本shimadzu LC-ATvp)色譜柱(AgelaVenusil ASB C18)A B = 45 55 (V/V) (A :4· 5% 甲酸 B :100% 甲醇)檢測波長280nm結果見圖5。實施例5、基因功能驗證-擬南芥轉化及篩選5. 1擬南芥種植將種子放入EP管中，70%乙醇中浸泡5min，然后清潔劑(20%漂水(白貓，上海)， 0. 1% Triton)洗滌10-15min，無菌水沖洗4次，4°C春化72h。向消毒好的種子中加入0. 5% agarose (冷卻至40度以免把種子燙死，加agarose是為了有利于種子散開)，鋪于1/2MS 固體培養基上，超凈臺上吹干，(可多吹一會，以免種子萌發過程中培養皿蓋子上有水汽)。 轉入人工氣候室中培養一周左右，可移栽。將人工土壤裝入合適大小的pot，70度烘干2小時以上(殺死蟲卵等，否則會長蟲)，然后將pot放在營養液中，使其充分吸水，將在1/2MS 固體培養基上生長7-10天的幼苗移栽于飽含營養液的人工土壤中，蓋上保鮮膜，轉入人工氣候室中培養。1-2天后揭去保鮮膜。隔幾天澆一次水(澆在POT底下的鐵盤子里)。5. 2擬南芥轉化
40 μ 1 40 μ 1 20 μ 1 40 μ 1 4μ 1 200 μ g
補體系體積于400 μ 1
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(1)當擬南芥(哥倫比亞野生型)花序形成時，將花序頂端減掉以誘導測花序的生成。轉化前將材料澆透營養液。(2)轉化前一天，取2ml活化的農桿菌AGL 1加到含相應抗生素的200ml YEP培養基中，過夜培養至OD6tltl = 1.0-1.2。(3)離心收集菌體，并重懸于浸染液(5%蔗糖，0.04% Silwet L-77)中，使OD6tltl =0. 8。(4)將花序浸入浸染液30秒，其間前后擺動花序，使花序上形成一層膜。(5)用保鮮膜覆蓋花序，暗培養一天后揭去保鮮膜，至于19-22°C培養室培養。(6)隔5-7天再同法浸染一次。(7)大約一個月后收獲種子。5. 3擬南芥轉化陽性株系篩選(1)收獲的TO代種子消毒后(75%乙醇5min，清潔劑洗滌10-15min，無菌水沖洗 3-5次)，鋪于含50 μ g/mL Kan或50 μ g/mL Hygo的MS篩選培養基上(方法同上)。春化48h，移到人工氣候室生長7-10天。將抗性小苗移到土中繼續生長。(3)等植物絕大多數花苞已經結果莢，用小繩將植物單株綁起，以便單株收種子 Tl代種子。G) PCR擴增以轉化株系的基因組DNA為模板，使用基因特異引物。PCR反應體系和反應條件見前。 T1種子處理同前，在T2代植物中挑選抗性比為3 1的單插入獨立株系。5. 4 轉基因陽性植株鑒定(1) CTAB法提取基因組DNA。O) PCR鑒定陽性植株。PCR擴增以轉化株系的基因組DNA為模板，引物分別用基因特異引物。PCR反應體系和反應條件見前。結果見圖6。實施例6、擬南芥轉基因植株抗逆表型分析6. 1萌發實驗將擬南芥種子用70%酒精振蕩滅菌5min，然后用無水乙醇重懸lmin，鋪在無菌干燥的濾紙上，待種子表面干燥后，擺放到1/2MS固體培養基(添加H2O2)平板上，每種放置50 顆種子，用封口膜封好，放入4°C冰箱暗培養2天，然后放入光照培養箱正常培養5d，統計子葉張開的比率。實驗重復3次。6. 2根生長實驗將表面滅菌后的種子鋪到MS培養基上，4°C暗培養2d，轉入光照培養箱培養2_3d， 再將萌發的植株放入1/2MS (加入不同濃度的NaCVH2O2)豎直培養，7天后拍照，Image J軟件統計根長。實驗重復3次。結果見圖7，圖8。
權利要求
1.一種小麥耐鹽抗氧化基因7 / &其特征在于所述基因CDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
2.一種含有權利要求1所述基因TaFLS的植物表達載體pSTART-T^/ &
3.權利要求1所述基因7 / ^在培育抗鹽抗氧化植物中的應用。
4.權利要求2所述植物表達載體pSTART-Ti^ZS在培育抗鹽抗氧化植物中的應用。
5.如權利要求4、5所述的應用，其特征在于所述植物是擬南芥或普通小麥。
全文摘要
本發明公開了一種小麥耐鹽基因即小麥次生代謝類黃酮合成途徑基因TaFLS及含有所述基因TaFLS的植物表達載體pSTART-TaFLS，本發明還公開了所述基因其表達載體在培育抗鹽抗氧化植物中的應用。實驗證明，本發明所述轉基因植株的抗鹽抗氧化能力明顯提高。
文檔編號C12N15/29GK102234652SQ20101060504
公開日2011年11月9日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者夏光敏, 張凌霄, 李偉 申請人:山東大學