專利名稱：一種基于配位作用的固相介質提取dna的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術的技術領域，具體涉及一種利用可與DNA分子產生配位作用 的固相介質在生物樣品中提取DNA的方法。
背景技術：
DNA提取是分子生物學研究和生物工程中的一項關鍵技術，是DNA分析的基礎和 前提。DNA提取的質量直接關系到PCR擴增、基因測序的后續步驟的成功與否。隨著DNA分 析技術在分子生物學研究、臨床疾病診斷、進出口檢驗檢疫、法醫學檢驗、血液質量控制等 領域應用的逐漸深入，對開發高效、快速、簡便、低成本的DNA提取技術的需求也與日俱增。目前常用的幾種DNA提取方法包括苯酚-氯仿法、Chelex-IOO法和固相提取法 等。它們均有各自的特點和適用體系苯酚-氯仿法適用范圍廣，但操作時間長，提取效率較低且因人而異，所用試劑毒 性較大，對環境有污染。Chelex-IOO法操作簡便，提取的DNA可直接用于PCR擴增；但其提取效率低，且對 體系有一定選擇性。固相提取法是目前發展較快的一種方法，它采用玻璃珠、氧化硅微粒或氧化硅包 覆的磁性微粒為固相提取介質，這些介質表面都有可部分解離的硅羥基，在高鹽濃度溶液 中，DNA帶有負電的磷酸根可以通過鹽橋的媒介作用吸附在Si02粒子表面。該方法提取純 度高，操作簡便，尤其是采用氧化硅復合磁性粒子為介質，可實現對樣品的快速、高通量的 自動化提取。但由于這種提取方法依賴的是氧化硅粒子表面和DNA磷酸根之間的較弱的間 接靜電相互作用，因此DNA的吸附效率很難進一步提高，通常最高只能達到80%左右。要想進一步提高固相提取法對DNA的吸附效率，需要對吸附介質表面進行修飾， 增強其與DNA分子之間的相互作用。從DNA分子結構看，其鏈上的磷酸根具有很強的配位能 力，可以和多種金屬離子發生很強的配位作用。因此，我們可以通過對吸附介質進行表面修 飾，使DNA分子和介質表面產生很強的配位作用，從而實現對DNA的吸附和提取。由于配位 作用的強度要遠大于靜電相互作用，這樣的設計將有助于進一步提高對DNA的吸附效率。
發明內容
本發明的目的就是提供一種利用DNA分子與固相介質間的配位相互作用實現對 生物樣品中DNA的高效提取的方法，將DNA吸附效率提高到90%以上，以克服現有提取技術 提取效率偏低的缺陷。本發明的方法包括如下步驟(1)將利用硅烷偶聯試劑在表面修飾可吸附金屬離子基團的固相提取介質和濃度 為10 25mmol/mL的金屬離子溶液混合，每毫升金屬離子溶液加入0. 4 0. 5毫克固相提 取介質，吸附1 2小時后，采取離心或磁吸方式將固相介質和溶液分離，用高純水清洗所 得固相；
(2)將吸附了金屬離子的固相介質和含DNA的溶液樣品混合，DNA樣品與吸附了 金屬離子的固相介質的質量比在0. 009 0. 01范圍；用NaCl調節混合溶液的離子強度在 0. 01 0. 5mmol/mL范圍，在pH值2. 5 4. 5下將混合溶液靜置15分鐘以完成DNA分子在 固相提取介質表面的吸附；根據所用不同的固相提取介質，采取離心或磁吸等分離方式，將 吸附了 DNA分子的固相介質和溶液分離。本發明步驟(1)中所述的固相提取介質包括玻璃珠(尺寸在毫米區間)，無定形氧 化硅微粒(形狀為球形或無定形，尺寸范圍在50μπι lOOnm)，介孔氧化硅微粒(尺寸范 圍在50 μ m IOOnm)，無定形氧化硅包覆磁性微粒(尺寸范圍在50 μ m lOOnm，磁性內核 為狗，Co, Ni, Fe2O3' Fe3O4或其混合物)和介孔氧化硅包覆磁性微粒(尺寸范圍在50 μ m lOOnm，磁性內核為Fe，Co，Ni，Fe2O3, Fe3O4或其混合物)。本發明步驟(1)中所述的表面修飾改性是指利用硅烷偶聯試劑在上述固相介質 表面修飾可吸附金屬離子的基團，如羧基等。所用硅烷偶聯劑為3-環氧基丙基三甲氧 基硅烷和氨羧類螯合物反應制得，所用氨羧類螯合物包括亞胺基二乙酸(IDA)、三乙酸胺 (NTA)、羧甲基天冬氨酸(CM-ASP)、三羧甲基乙二胺(TED)、羧甲基四聚天冬氨酸(CM-TEPA)
等。分子結構式分別如下
權利要求
1.一種基于配位作用的固相介質提取DNA的方法，有如下步驟(1)將利用硅烷偶聯試劑在表面修飾可吸附金屬離子基團的固相提取介質和濃度為 10 25mmol/mL的金屬離子溶液混合，每毫升金屬離子溶液加入0. 4 0. 5毫克固相提取 介質，吸附1 2小時后，采取離心或磁吸方式將固相介質和溶液分離，用高純水清洗所得 固相；(2)將吸附了金屬離子的固相介質和含DNA的溶液樣品混合，DNA樣品與吸附了金屬離 子的固相介質的質量比在0. 009 0. 01范圍；用NaCl調節混合溶液的離子強度在0. 01 0. 5mmol/mL范圍，在pH值2. 5 4. 5下將混合溶液靜置15分鐘以完成DNA分子在固相提 取介質表面的吸附；采取離心或磁吸方式，將吸附了 DNA分子的固相介質和溶液分離。
2.如權利要求1所述的基于配位作用的固相介質提取DNA的方法，其特征是，所述的利 用硅烷偶聯試劑在表面修飾可吸附金屬離子基團的固相提取介質，是用3-環氧基丙基三 甲氧基硅烷作硅烷偶聯劑，和氨羧類螯合物反應制得；所述的氨羧類螯合物，是亞胺基二乙 酸、三乙酸胺、羧甲基天冬氨酸、三羧甲基乙二胺或羧甲基四聚天冬氨酸。
3.如權利要求1或2所述的基于配位作用的固相介質提取DNA的方法，其特征是，所述 的固相提取介質，是玻璃珠、無定形氧化硅微粒、介孔氧化硅微粒、無定形氧化硅包覆磁性 微粒或介孔氧化硅包覆磁性微粒。
4.如權利要求1或2所述的基于配位作用的固相介質提取DNA的方法，其特征是，所述 的金屬離子是 Si2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+ 或 Ce4+。
全文摘要
本發明的一種基于配位作用的固相介質提取DNA的方法，屬于生物技術的技術領域。包括如下步驟將利用硅烷偶聯試劑在表面修飾可吸附金屬離子基團的固相提取介質和金屬離子溶液混合，吸附后采取離心或磁吸方式將固相介質和溶液分離，所述的金屬離子是Zn2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+或Ce4+；將吸附了金屬離子的固相介質和含DNA的溶液樣品混合，調節混合溶液的離子強度在0.01～0.5mmol/mL、pH值2.5～4.5，靜置15分鐘以完成DNA分子的吸附，采取離心或磁吸將吸附了DNA分子的固相介質和溶液分離。本發明的優點在于對DNA的吸附率高于90％，操作快速便捷。
文檔編號C12N15/10GK102146369SQ20101060400
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者姜珊, 莊家騏, 楊文勝 申請人:吉林大學