專利名稱：半滑舌鰨性別特異微衛星標記及其在超雌魚鑒定中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于水產生物技術中的魚類性別鑒定和性別控制技術領域，具體涉及一種 半滑舌鰨的性別特異微衛星標記及其在超雌魚鑒定中的應用。
背景技術：
半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是一種近海溫水性大型底層魚類，其肉質細 嫩、營養豐富，深受消費者喜愛，是我國海水魚類主導養殖品種之一。但半滑舌鰨雌、雄個體 生長速度差異很大，雌性比雄性生長快2-4倍。由于雄性個體生長緩慢、個體小，降低了半 滑舌鰨的養殖產量，增加了養殖成本，因而嚴重影響了半滑舌鰨苗種的推廣及養殖產業的 形成。而開展半滑舌鰨遺傳性別檢測和性別控制技術研究，特別是開展半滑舌鰨全雌苗種 研制和生產已成為半滑舌鰨養殖業健康、持續、快速發展的關鍵。半滑舌鰨具有雌性特異的性染色體(W染色體)，而雄性性染色體同型(ZZ)(周麗 青等，2005)。半滑舌鰨雌魚產生Z型和W型兩種卵子，通過人工雌核發育可以生產ZZ型雄 魚和Wff型超雌個體兩種雌核發育魚苗，將Wff超雌魚苗培育成熟，然后與ZZ雄魚交配，即可 大量生產ZW型全雌魚苗。不過，由于重組交換的存在，在雌核發育魚苗中也還存在一些ZW 型雌性個體。而要篩選培育WW超雌個體，其前提是必須能鑒定出WW超雌個體和普通ZW雌 性個體，因而半滑舌鰨Wff超雌個體的鑒定成為研制半滑舌鰨全雌魚苗的關鍵。性別特異分子標記是鑒定性別的很有潛力的技術手段。但目前有關魚類性別特異 分子標記和快速鑒定方法的研究只在少數幾種魚類上進行過，如加拿大西溫哥華實驗室的 Devlin (1994)篩選到大鱗大馬哈魚Y染色體特異的DNA片段；Griffiths等O000)在三椎 棘魚(Gasterosteus aculea tus L.)中找到了兩個雄性特異的AFLP標記。但是，當應用 于另外兩種棘魚時，卻不能正確鑒定其性別。Rachael等Q003)比較了 4種鮭魚(北極鮭 魚、大西洋鮭、棕鱒和虹鱒)的Y染色體連鎖圖譜，分別在北極鮭魚和虹鱒中找到了 2個和 6個性別連鎖的AFLP標記。但這些標記具有種的特異性，因此應用范圍較窄。由于魚類性別分化較為原始，雌雄性染色體差異小，因而其遺傳性別的鑒定較為 困難。雖然采用魚類的性別特異分子標記可以鑒定出少數魚類的雌雄性別，但要采用這種 標記鑒定ZW雌性個體和Wff超雌個體則非常困難。例如，Chen等Q007)分離到半滑舌鰨 雌性特異AFLP標記，將其轉化成SCAR標記后，建立了鑒定半滑舌鰨遺傳性別的PCR方法。 但因為AFLP標記是一種顯性遺傳的分子標記，難以區分純合子與雜合子；因此，Chen等 (2007)建立的半滑舌鰨AFLP雌性特異標記和遺傳性別鑒定技術可以區分半滑舌鰨ZZ雄性 個體和ZW雌性個體，但卻不能區分ZW雌性個體和Wff超雌個體。迄今，國內外尚未見有關 半滑舌鰨Wff超雌個體鑒定的分子生物學方法的文獻報道。因此，探索能夠鑒定出半滑舌鰨 Zff正常雌性個體和Wff超雌個體的分子生物學方法，對于篩選和大量培育半滑舌鰨WW超雌 個體，進而培育半滑舌鰨全雌苗種，具有重要意義和應用價值。而微衛星標記具有共顯性、 多態性高、符合孟德爾遺傳分離規律，與性別連鎖等特點，如果篩選出雌性或雄性特異的微 衛星標記，根據特異標記的序列設計引物，就有可能建立區分ZW雌性個體和Wff超雌個體的分子生物學方法，從而解決半滑舌鰨ZW雌性和Wff超雌個體鑒定的難題。而有關半滑舌鰨 雌性特異微衛星標記及WW超雌魚鑒定的分子標記方法，迄今在國內外均未見報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種半滑舌鰨的性別微衛星標記及其在超雌魚鑒定中的應 用，即通過篩選性別特異微衛星標記來獲得半滑舌鰨Wff超雌個體和ZW雌性個體鑒定的分 子標記，采用此標記可以解決半滑舌鰨性別控制和全雌育種研究中不能快速鑒別ZW雌魚 和Wff超雌魚的問題，以彌補現有技術的不足。本發明通過在半滑舌鰨基因組測序中獲得的雌性特異微衛星標記，根據該微衛星 標記在TL雄魚、ZW雌魚和Wff超雌魚中的基因型的差異，建立了采用性別特異微衛星標記 鑒定半滑舌鰨TL雄魚、ZW雌魚和Wff超雌魚的技術方法。為半滑舌鰨性別控制和全雌苗種 的生產提供了可靠的技術手段。本發明的技術方案如下一種半滑舌鰨的性別特異微衛星標記，其特征在于微衛星標記的核苷酸序列分別 為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。其中SEQ ID NO :1是218bp雌性W染色體特異微衛星標 記的序列Gaggccgacaggatcgtacataatcccaacttcacaataactccacaattggcactttttgttttgttt ttctcttttactttcttaacaattatacacactcggagcccgtatcgcaatgtcacaccgagggtttgtttcttcta aggtcacacacacacacacacacacaggcatgactgaagagtttctgtcgaaaaccaccggagtacgtcgta ；SEQ ID NO :2是206bp雄性Z染色體特異微衛星標記的序列Gaggccgacaggatcgtacatcctcccaacttcacaataactccacaattggcacttttttttttctct tttactttcttaacaattacacacactcggagcccgtatcacaatgtcacaccgagggtctgtttcttctaaggtca aacacacacacacgggcatgactgaagagtttcagttgaaaaccaccggagtacgtcgta0上述擴增引物的上游引物的序列為SEQ ID NO :3，下游引物的序列為SEQ IDNO :4。 其中SEQ ID NO 3 上游引物 5，-gaggccgacaggatcgtac-3，；SEQ ID NO 4 下游弓丨物 5，_tacgacgtactccggtggtttt_3，。上述的引物用于鑒定半滑舌鰨超雌個體，包括半滑舌鰨基因組DNA提取、微衛星 引物擴增、擴增產物的電泳檢測步驟，其特征在于半滑舌鰨超雌個體的擴增產物電泳檢測 為一個DNA片段，大小為216-220bp ；而雌性半滑舌鰨的擴增產物電泳檢測為2個DNA片段， 大小分別為216-220和204-208bp ；雄性半滑舌鰨的擴增產物電泳檢測為1個DNA片段，大 小為 204-208bpo本發明篩選到了半滑舌鰨W染色體和Z染色體的特異性微衛星標記，并根據這些 性別特異微衛星標記的序列設計了微衛星引物，利用微衛星引物來建立半滑舌鰨Wff超雌 魚的鑒定方法。本發明的方法具有準確、快速、高效等優點，利用該性別特異微衛星標記可 以快速鑒定半滑舌鰨ZW雌魚、Wff超雌魚以及ZL雄魚，解決了半滑舌鰨性別控制和單性苗 種培育中難以進行Wff超雌和ZW正常雌魚鑒定的難題，對于Wff超雌魚的批量化培育和篩 選，以及全雌苗種的規模化生產和養殖，提高養殖產量和經濟效益，推動半滑舌鰨養殖產業 的健康、持續、快速發展，具有重要意義和產業應用價值。
圖1 本發明的性別特異微衛星標記在半滑舌鰨雌性和雄性擴增產物的電泳圖譜。其中圖1的1-12泳道為半滑舌鰨雌性個體，13-M泳道為半滑舌鰨雄性個體；A 半滑舌鰨雌性特異的等位基因；B 在半滑舌鰨雌雄個體中都存在的等位基因。圖2 本發明的半滑舌鰨Wff超雌個體微衛星標記電泳分析圖譜。其中母本泳道為卵裂雌核發育仔魚的母本；3、21、M和35號泳道的四個個體為 Wff超雌個體，其它泳道的個體為U雄性個體。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細的說明。一、半滑舌鰨性別特異微衛星標記的篩選1、半滑舌鰨性別特異微衛星標記的獲得本發明專利中的雌性特異微衛星標記序列來源于我們對半滑舌鰨進行的基因組 測序項目。對半滑舌鰨雌性個體和雄性個體采用SOLEXA測序技術分別進行全基因組測序， 將雌性個體基因組序列與雄性個體基因組序列進行比對，從中篩選出10多個性別相關微 衛星序列，根據這些性別相關微衛星序列，用引物設計軟件針對重復單元的側翼序列設計 引物10多對。2、性別特異微衛星標記的驗證采用12尾半滑舌鰨雄性個體與12尾雌性個體基 因組DNA樣品對10多個性別相關微衛星標記序列進行PCR擴增，擴增采用15 μ 1體系，其 中雙蒸水 10. 6μ 1 ； 10 X Buffer 1. 5μ 1 ； dNTP (2. 5mM) 0. 8 μ 1 ；上下游引物各 0.5 μ 1 ；為保 證酶的活性最后加入的Takara酶(rTaq 5U/y 1)0. 1 μ 1 ；充分蝸旋混勻分裝，然后加入相 應DNA模板1. 5 μ 1 ；總共15 μ 1。擴增程序94°C預變性5min，隨后變性-退火-延伸按 下列程序進行33個循環94°C變性30S，58-62°C退火30s，72°C延伸30s。最后在72°C延 伸5min，結束程序并4°C保存。擴增產物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并通過銀染方 法進行染色，然后觀察這些微衛星標記在雌雄個體中的基因型是否有顯著差異。結果表明 其中1個性別相關微衛星標記CseF-SSRl與半滑舌鰨性別緊密連鎖。采用CseF-SSRl微衛 星標記的引物 SChen-I (上游引物 5' -gaggccgacaggatcgtac-3 ‘ (SEQ ID NO :3)，下游引 物5' -tacgacgtactccggtggtttt-3‘ (SEQ ID NO :4))擴增性成熟的半滑舌鰨12尾雌魚 和12尾雄魚基因組DNA，從雌魚基因組中共擴增出2個等位基因，按照大小順序分別命名為 A、B等位基因。根據與分子量標準比較，A等位基因大小約為216-220bp，B等位基因大小 為204-208bp。而從12尾雄魚基因組中只擴增出204_208bp的B等位基因，而沒有擴增出 216-220bp的A等位基因(圖1)，因此，確定大小為216_220bp的A等位基因為半滑舌鰨雌 性W染色體特異的微衛星標記，而204-208bp的B等位基因則為Z染色體特異的雄性微衛 星標記。3、性別特異微衛星標記的回收采用性別特異微衛星標記的引物，引物名稱為SChen-I (上游引物 5，-gaggccgacaggatcgtac-3，，下游弓丨物 5，-tacgacgtactccgg tggtttt-3，)擴增性成熟的半滑舌鰨雌魚和雄魚鰭條基因組DNA，鰭條基因組DNA提取按照常規方法進行。PCR擴增 采用 15 μ 1 體系，其中雙蒸水 10. 6μ 1 ；BufferdO X )1. 5μ 1 ； dNTP(2. 5mM) 0. 8 μ 1 ；上下游 引物各0.5μ 1 ；為保證酶的活性最后加入的Taka ra酶(rTaq 5U/y 1)0. 1μ 1 ；充分蝸旋 混勻分裝，然后加入相應DNA模板1. 5 μ 1 ；總共15 μ 1。擴增程序94°C預變性5min，隨后 變性-退火-延伸按下列程序進行33個循環94°C變性30S，58°C退火30s，72°C延伸30s。 最后在72°C延伸5min，結束程序并4°C保存。擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，從雌 魚基因組中共擴增出216-220和204-208bp大小的2個等位基因，從雄魚基因組中擴增出 204-208bp的一個等位基因。用刀片分別切下含有216-220和204-20 DNA條帶的聚丙 烯酰胺凝膠，溶解后回收目的片段備用。4、性別特異微衛星標記的克隆將回收的性別特異微衛星標記DNA片段，采用常規基因克隆方法克隆到商業獲得 的pMD 18-T載體中，采用標準方法進行連接和轉化，采用常規PCR法篩選含有目的片段的 克隆，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的長度，符合預期長度的樣品可以視為陽性克隆。5、半滑舌鰨性別標記序列的確定選取含有216-220和204_208bp性別特異微衛星標記DNA片段的陽性克隆，用 ABI3730測序儀進行序列分析。分別獲得218bp雌性W染色體特異微衛星標記的序列(SEQ ID NO 1)和206bp(SEQ ID NO 2)雄性Z染色體特異微衛星標記的序列。對獲得的性別特 異微衛星標記序列在GenBank中進行比對分析后沒有找到任何同源序列。二、用篩選出的標記進行半滑舌鰨超雌魚的鑒定1、半滑舌鰨Wff超雌魚的制備；按照常規方法獲取半滑舌鰨成熟卵，采用紫外滅活的半滑舌鰨或花鱸精子誘導 半滑舌鰨卵子進行雌核發育，精子的滅活方法如下首先將100 μ L新鮮或冷凍-解凍的 精液用 ImL MPRS (NaCl 60. 35mM, KCl 5. 23mM, NaHCO3 3. OmM, D-Glucose 55. 5mM, NaH2PO4 1. 8mM, CaCl2 · 6H20 1. 13mM, MgCl2 · 6H201. 13mM)溶液稀釋后，用 60_80mJ/cm2 紫外線照 射滅活，即獲得紫外滅活的精子。然后用紫外滅活的精子與半滑舌鰨卵子授精，授精后在 20-23°C海水中培育，培育20-25分鐘后，將上述授精卵轉移至日本生產的Bio Press 5506 靜水壓機的壓力缸中，采用38-41MP壓力進行靜水壓休克處理，處理時間為4-6min，靜水壓 處理完畢后將卵移入20-23°C海水中進行孵化和培養；在雌核發育仔魚孵出前后抽樣提取 DNA,或將這些雌核發育仔魚培養至12厘米以上，從尾鰭中提取DNA用于Wff超雌魚的檢測。2、半滑舌鰨DNA抽提包括1)胚胎和仔魚DNA抽提方法；幻半滑舌鰨魚種和成 魚DNA抽提方法。1)單個胚胎和仔魚DNA微量抽提方法取20-40個半滑舌鰨雌核發育孵出前后 的胚胎或仔魚，將單個胚胎或仔魚置于1. 5ml離心管中，將離心管底部置入液氮0. 5厘米深 3-5秒鐘，拿出后進行研磨和混勻樣品，隨后加入20 μ 1蛋白酶K溶液，在56°C孵育30-60 分鐘，加入商業獲得的200 μ 1緩沖液GB(TiangenBiotech Co LTD, Beijing)和1μ 1載體 RNA儲存液，濃度1 μ g/ μ 1 (載體RNA儲存液的配制為將310 μ g載體RNA溶解在310 μ 1無 Rnase酶的雙蒸水中)，70C°放置10分鐘，待液體變清亮后，簡短離心10秒鐘；加入200 μ 1 的無水乙醇，輕輕顛倒混勻樣品，室溫放置5分鐘，簡短離心，將所得溶液全部轉入商業可 得的吸附柱 CR2 (Tiangen Biotech Co LTD, Beijing)中，12，OOOrpm 離心 30 秒，棄廢液，將吸附柱CR2放回收集管中，隨后按照CR2柱的操作說明將基因組DNA從柱上洗脫回收，將 DNA產物保存在-20度，備用。2)半滑舌鰨魚種和成魚DNA抽提方法對于12厘米以上的半滑舌鰨魚種或成 魚，采取米粒大的尾鰭組織提取DNA，有關鰭條DNA的提取按照常用的酚-氯仿方法進行。3.半滑舌鰨Wff超雌魚的鑒定采用性別特異微衛星標記CseF-SSRl的引物SChen-I (上游引物 5，-gaggccgacaggatcgtac-3，，下 游 弓| 物 5，-tacgacgt actccgg tggtttt-3，)擴 增卵裂雌核發育半滑舌鰨基因組DNA，擴增采用15 μ 1體系，其中雙蒸水10.6μ1 ； Buffer(IOX)L 5μ 1 ； dNTP(2. 5mM) 0. 8 μ 1 ；上下游引物各0. 5 μ 1 ；為保證酶的活性最后加 入的Takara酶(rTaq 5U/ μ 1)0. 1μ 1 ；充分蝸旋混勻分裝，然后加入相應DNA模板1.5μ 1 ； 總共15 μ 1。擴增程序94°C預變性5min，隨后變性-退火-延伸按下列程序進行33個循 環94°C變性30S，58°C退火30s，72°C延伸30s。最后在72°C延伸5min，結束程序并4°C保 存。擴增產物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并通過銀染方法進行染色，然后分析電 泳圖譜。如果同時擴增出216-220bp和204-208bp兩個等位基因的個體是染色體為ZW型 的遺傳雌性個體，只擴增出204-208bp等位基因的個體一定是染色體為TL型的遺傳上為雄 性的個體，而只擴增出216-220bp等位基因的個體則是染色體為Wff型的遺傳上超雌的個體 (圖幻。采用這種方法即可從大量待測樣本中快速鑒定出WW超雌魚。并且，經本方法鑒定 確定的超雌魚，與正常的^雄性受精都獲得了全雌魚苗，證實了本鑒定方法的準確性。
權利要求
1.半滑舌鰨性別特異微衛星標記，其特征在于，微衛星標記的核苷酸序列分別為SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2 ；其中SEQ ID NO :1是218bp雌性W染色體特異微衛星標記的序列Gaggccgacaggatcgtacataatcccaacttcacaataactccacaattggcactttttgttttgtttttc tcttttactttcttaacaattatacacactcggagcccgtatcgcaatgtcacaccgagggtttgtttcttctaagg tcacacacacacacacacacacaggcatgactgaagagtttctgtcgaaaaccaccggagtacgtcgta ；SEQ ID NO :2是206bp雄性Z染色體特異微衛星標記的序列Gaggccgacaggatcgtacatcctcccaacttcacaataactccacaattggcacttttttttttctctttt actttcttaacaattacacacactcggagcccgtatcacaatgtcacaccgagggtctgtttcttctaaggtcaaac acacacacacgggcatgactgaagagtttcagttgaaaaccaccggagtacgtcgta0
2.用于擴增權利要求1所述的微衛星標記的引物名稱為SChen-Ι，其上游引物序列為 SEQ ID NO :3，下游引物序列為SEQ ID NO :4 ；其中SEQ ID NO 3 上游弓丨物 5' -gaggccgacaggatcgtac-3‘；SEQ ID NO 4 下游弓丨物 5，-tacgacgtactccggtggtttt-3，。
3.權利要求2所述的引物用于半滑舌鰨超雌個體的鑒定，包括半滑舌鰨基因組DNA提 取、微衛星引物擴增、擴增產物的電泳檢測步驟，其特征在于半滑舌鰨超雌個體的擴增產物 電泳檢測為1個DNA片段，大小為216-220bp。
4.權利要求2所述的引物用于半滑舌鰨雌雄個體的鑒定，包括半滑舌鰨基因組DNA提 取、微衛星引物擴增、擴增產物的電泳檢測步驟，其特征在于雌性半滑舌鰨的擴增產物電泳 檢測為2個DNA片段，大小分別為216-220bp和204_208bp ；雄性半滑舌鰨的擴增產物電泳 檢測為1個DNA片段，大小為204-208bp。
全文摘要
本發明涉及一種半滑舌鰨性別特異微衛星標記及其在超雌魚鑒定中的應用，其特征在于，微衛星標記的核苷酸序列分別為SEQ ID NO1、SEQ IDNO2；用于擴增特異微衛星標記的引物，其上下游引物序列分別為SEQ IDNO3、SEQ ID NO4。把引物用于半滑舌鰨雌雄個體的鑒定，超雌體的擴增產物片段為218bp，雌性半滑舌鰨的擴增產物為2個DNA片段，大小分別為216-220bp和204-208bp；雄性半滑舌鰨的擴增產物為1個DNA片段，大小為204-208bp。本發明篩選到了半滑舌鰨W和Z染色體的特異性微衛星標記，并設計了微衛星引物。利用該微衛星標記可以快速的鑒定半滑舌鰨ZW雌魚、WW超雌魚以及ZZ雄魚，解決了半滑舌鰨性別控制和單性苗種培育中難以進行WW超雌和ZW正常雌魚鑒定的難題。
文檔編號C12Q1/68GK102134593SQ20101060290
公開日2011年7月27日 申請日期2010年12月23日 優先權日2010年12月23日
發明者季相山, 宋文濤, 徐營, 李文龍, 梁卓, 邵長偉, 陳松林 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所