專利名稱：去除測序文庫中的載體片段的方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域。特別地，本發明提供了去除測序文庫中的載體片段的方法。本發明還提供了對基因組克隆文庫進行測序的方法，所述方法包括利用基因組克隆文庫構建測序文庫，并且在對測序文庫進行測序前去除測序文庫中的載體片段。本發明還提供了可用于本發明的方法的試劑盒。
背景技術：
De nove測序法也稱從頭測序法，其不需要任何基因序列信息即可對某個物種的基因組進行測序。在測序后，用生物信息學的分析方法對測序獲得的序列進行拼接、組裝， 即可獲得該物種的基因組序列圖譜。使用Illumina公司的DNA測序平臺進行De nove測序的方法主要分為以下四個步驟1，制備測序文庫；2，用Cluster Station對樣品進行擴增；3，對成簇后的樣品進行測序；4，數據處理和拼接。根據測序的片段的大小，基于Illumina公司的DNA測序平臺的測序文庫制備分為小片段DNA的測序文庫制備和大片段DNA的測序文庫制備。為了解決非單倍體基因組序列雜合度過高、De novo測序序列拼接組裝難度大的問題，目前通常采用以i^osmid克隆文庫為模板構建DNA小片段測序文庫的方法。建立 Fosmid克隆文庫是指將某種生物的總DNA與R)Smid載體一起以重組的形式轉移到宿主細胞中，然后通過細胞增殖形成多個克隆的整體。對于i^smid載體，可插入的基因組DNA片段的合適的長度為大約401Λ。構建R)smid小片段測序文庫是指將一定數量的R)smid克隆混合到一起作為建庫模板，然后采用以下步驟進行測序文庫制備1、打斷DNA到一定的片段大小；2、進行末端修復，S卩，利用T4 DNA聚合酶和Klenow聚合酶使DNA片段全部變成平末端，并采用T4 PNK (也稱為T4多核苷酸激酶)將DNA片段的5'端磷酸化；3、利用無 3'到5'外切酶活性的Klenow聚合酶(也稱為Klenow 3’-5’eX0_)在已進行末端修復的 DNA片段的3'端加上一個堿基“A”;4、用DNA連接酶將接頭有方向性地加到DNA片段的兩端，其中接頭的核苷酸序列能與Solexa測序儀的flowcell上帶有的寡核苷酸的序列互補； 5、將加了接頭的DNA產物進行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收一定大小的DNA片段，以除去未加到DNA片段上的接頭，以及其他不符合片段大小的DNA片段；6、富集所有兩端都加上接頭的目的片段，使用針對接頭的核苷酸序列的引物，通過PCR擴增所有加了接頭的DNA ;7、純化獲得的PCR產物，從而建立測序文庫。測序文庫經Agilent Bioanalyzer 2100和Q-PCR檢測確定濃度及片段大小合格后使用Solexa測序儀進行測序。隨著新一代測序技術的飛速發展，基因組測序的成本和時間大大降低，從而為研究新物種的全基因組序列提供了一個嶄新的研究平臺。然而，由于集中化商業性多物種基因組測序的大規模開展，使得我們迫切需要降低測序成本，減少測序流程，提高勞動效率， 以便能夠更好的將測序方法應用到分析、疾病診斷以及個性化(個體化)醫療等新領域。
發明內容
除非另有定義，否則本文中所使用的科學和技術術語具有本領域技術人員通常理解的含義。為了更好的理解本發明，特別提供了下列術語的定義。如本文中所使用的，術語“雜交”是指相互間具有互補序列的兩個單鏈核酸分子在一定條件下(適宜的溫度及離子強度等)按堿基互補配對原則退火形成雙鏈核酸的過程。 核酸雜交可以在DNA-DNA之間，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之間進行，只要它們之間存在互補序列，可以進行堿基配對。一般而言，雜交的雙方是待測核酸分子和已知核酸分子。在雜交體系中已知的核酸分子稱作探針(probe)。核酸雜交包括固-液相雜交和液相雜交。液相雜交是在溶液中進行的雜交反應，其是指待測核酸分子與已知核酸分子(探針)在溶液中退火形成雜交復合物。通常，探針是經標記的，從而在雜交反應結束后，通過利用探針上的標記物，可以分離和檢測雜交后的雙鏈。可用于標記探針的標記物在本領域內是已知的，包括但不限于，放射性同位素或核素，生物素，吖啶翁酯(acridinium ester)，polyA等。根據使用的標記物，相應的核酸分離和檢測方法在本領域內也是已知的，包括但不限于， 羥基磷灰石(HAP)法和親和吸附法。參見例如，Henegariu 0等人，(1999). "Custom fIuorescent-nucIeotide synthesis as an alternative method for nucleic acid labeling，，，Nature Biotechnology 18 :345-348 ；Ezaki T 等人，1989. Fluorometric Deoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridization in Microdilution Wells as an Alternative to Membrane Filter Hybridization in which Radioisotopes Are Used To Determine Genetic Relatedness among Bacterial Strains. Int. J. ofSystemic Bacteriology 29(3) :224-229 ；和 Herrington C 等人，1998. PCR 3 :PCR in situ hybridization :a practical approach, Volume 3. Oxford Oxford University Press。本發明至少部分基于下述原理在對測序文庫進行測序前，除去測序文庫中用于構建基因組克隆文庫的載體的片段可以避免浪費測序資源和產生不需要的測序數據，從而降低測序成本，提高測序效率。例如，當使用Solexa DNA測序儀對由R)smid克隆文庫建立的測序文庫進行測序時，由于在建庫過程中對i^smid克隆進行了打斷處理，R)smid載體也被打斷成了許多11Λ 以下的小片段DNA，因而測序文庫中包含有大量的R)smid載體片段，因此，如果對整個測序文庫進行測序，那么將產生大量的不需要的載體序列數據，并且這些不需要的序列數據還將影響后續的數據分析。相比之下，如果在使用SolexaDNA測序儀對測序文庫進行測序前， 將R)smid載體片段將去除，那么將可以避免對R)smid載體進行測序，減少不必要的數據讀取及分析，從而顯著降低測序成本，提高測序效率。因此，在一個方面，本發明提供了除去測序文庫中的載體片段的方法，其包括步驟1)制備經標記的探針，所述探針能夠與所述載體或其片段雜交；2)將所述探針與測序文庫進行雜交反應，從而使探針與所述載體或其片段形成帶標記的雙鏈核酸；3)利用特異性結合探針上的標記的分子實體，去除步驟2)中形成的帶標記的雙鏈核酸，從而除去測序文庫中的載體片段。在一個優選實施方案中，所述載體用于構建基因組克隆文庫，并且優選是R)smid載體。在又一個優選實施方案中，探針用生物素進行標記，并且特異性結合所述標記的分子實體是親和素，優選鏈霉親和素，例如鏈霉親和素磁珠。在另一個優選實施方案中，將探針與測序文庫進行液相雜交反應。在一個優選實施方案中，通過下列步驟制備生物素標記的探針1)使用生物素化的dNTP對載體進行PCR擴增，并純化回收PCR產物；2)將PCR產物片段化并回收純化，從而獲得生物素標記的探針。在一個優選實施方案中，使用Covaris將PCR產物片段化。在另一個優選實施方案中，將PCR產物片段化為大約200bp-500bp的片段，例如大約300bp的片段。在一個優選實施方案中，通過在95°C下使探針與測序文庫變性，然后在65°C下退火來進行雜交反應。在一個優選實施方案中，探針與測序文庫以大約1 1至大約2 1 的比(按質量計)進行雜交反應。在一個優選實施方案中，任選地，在進行探針與測序文庫的雜交之前，向測序文庫中加入接頭封閉劑(block)。如本文中所使用的，接頭封閉劑是能夠與測序文庫構建過程中所使用的接頭雜交的核酸。優選，接頭封閉劑的核苷酸序列與接頭的核苷酸序列完全互補。在進行探針與測序文庫的雜交時，接頭封閉劑與接頭雜交，從而避免發生接頭與探針的雜交以及接頭間配對連接。在一個優選實施方案中，加入的接頭封閉劑和文庫的比例為大約0.3pM/ ng-0. 8pM/ng，例如0. 5pM/ng。當加入的接頭封閉劑的量過大時，文庫中的載體片段的去除效率會降低，然而當加入的接頭封閉劑的量過少時，大量的非載體的文庫DNA片段會被探針捕獲而被去除。在一個優選實施方案中，雜交可以進行1，4，16，24或更多個小時。在另一個方面，本發明提供了對基因組克隆文庫進行測序的方法，所述方法包括1)利用基因組克隆文庫構建測序文庫，并除去測序文庫中的載體片段；2)對去除載體片段后的測序文庫進行測序。在一個優選實施方案中，所述基因組克隆文庫是R)smid克隆文庫，并且所述載體是R)smid載體。在一個優選實施方案中，使用根據本發明的方法來去除測序文庫中的載體片段。在一個優選實施方案中，測序文庫的構建包括以下步驟1)片段化基因組克隆文庫中的DNA ；2)將接頭連接至經片段化的DNA的兩端；3) PCR擴增添加了接頭的DNA，并回收純化PCR產物，從而建立測序文庫。在一個優選實施方案中，在構建測序文庫后，除去測序文庫中的載體片段。在另一個優選實施方案中，在構建測序文庫的過程中，例如在片段化基因組克隆文庫中的DNA后， 除去載體片段。在一個優選實施方案中，使用Solexa測序儀對測序文庫進行測序。在另一個方面，本發明提供了用于基因組測序的試劑盒，所述試劑盒包括用于構建基因組克隆文庫的載體，能夠與所述載體或其片段雜交的經標記的探針以及能夠特異性結合所述探針的標記的分子實體。
在一個優選實施方案中，所述載體是R)smid載體。在一個優選實施方案中，所述探針用生物素進行標記，并且特異性結合所述標記的分子實體是親和素，優選鏈霉親和素， 例如鏈霉親和素磁珠。在一個優選實施方案中，所述試劑盒還包括其他試劑，包括但不限于，接頭和接頭封閉劑。發明的有益效果與現有技術相比，本發明的技術方案在對測序文庫進行測序前，除去了測序文庫中的載體片段，由此可以避免對載體進行測序(避免浪費測序資源)，避免產生不需要的測序數據，減少不必要的數據分析，從而降低測序成本，提高測序效率。這對于大規模開展集中化商業性多物種基因組測序，以及開發測序方法的新應用(例如，疾病診斷以及個性化醫療)具有重要的意義。下面將結合具體實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不是對本發明的范圍的限定。根據優選實施方案的下列詳細描述，本發明的各種目的和有利方面對于本領域技術人員來說將變得顯然。
具體實施例方式在本發明的實施例中，使用的主要實驗儀器及試劑具體如下。1、主要實驗儀器。
權利要求
1.用于除去測序文庫中的載體片段的方法，其包括步驟[1)制備經標記的探針，所述探針能夠與所述載體或其片段雜交；[2)將所述探針與測序文庫進行雜交反應，從而使探針與所述載體或其片段形成帶標記的雙鏈核酸；[3)利用特異性結合探針上的標記的分子實體，去除步驟2)中形成的帶標記的雙鏈核酸，從而除去測序文庫中的載體片段。
2.權利要求1的方法，其中優選，所述載體是i^smid載體；優選，所述探針用生物素進行標記，并且特異性結合所述標記的分子實體是親和素，優選鏈霉親和素，例如鏈霉親和素磁珠；優選，將探針與測序文庫進行液相雜交反應；優選，探針與測序文庫以按質量計大約1 1至大約2 1的比進行雜交反應； 優選，在進行雜交反應前，向測序文庫中加入接頭封閉劑，并且優選接頭封閉劑和文庫的比例為大約 0. 3pM/ng-0. 8pM/ng，例如 0. 5pM/ng ；優選，雜交反應進行的時間為1，4，16，M或更多個小時。
3.用于對基因組克隆文庫進行測序的方法，所述方法包括[1)利用基因組克隆文庫構建測序文庫，并除去測序文庫中的載體片段；[2)對去除載體片段后的測序文庫進行測序。
4.權利要求3的方法，其中，優選，所述基因組克隆文庫是i^osmid克隆文庫，并且所述載體是R)smid載體； 優選，使用權利要求1或2的方法來去除測序文庫中的載體片段； 優選，通過下列步驟來構建測序文庫(1)片段化基因組克隆文庫中的DNA;(2)將接頭連接至經片段化的DNA的兩端；(3)PCR擴增添加了接頭的DNA，并回收純化PCR產物，從而建立測序文庫；優選，在構建測序文庫后，或在構建測序文庫的過程中，例如在片段化基因組克隆文庫中的DNA后，除去載體片段；優選，使用Solexa測序儀對測序文庫進行測序。
5.用于基因組測序的試劑盒，所述試劑盒包括用于構建基因組克隆文庫的載體，能夠與所述載體或其片段雜交的經標記的探針以及能夠特異性結合所述探針的標記的分子實體。
6.權利要求5的試劑盒，其中， 優選，所述載體是i^smid載體；優選，所述探針用生物素進行標記，并且特異性結合所述標記的分子實體是親和素，優選鏈霉親和素，例如鏈霉親和素磁珠；優選，所述試劑盒還包括其他試劑，例如，接頭和接頭封閉劑。
全文摘要
本發明提供了去除測序文庫中的載體片段的方法。本發明還提供了對基因組克隆文庫進行測序的方法，所述方法包括利用基因組克隆文庫構建測序文庫，并且在對測序文庫進行測序前去除測序文庫中的載體片段。本發明還提供了可用于本發明的方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102559856SQ20101060021
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月22日 優先權日2010年12月22日
發明者樊帆, 武靖華, 胡帥星, 趙美茹, 陳琳 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司