專利名稱：：一種紡錘體動點結合蛋白cenp-z及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一個CENP-E結合蛋白及其編碼基因與其在制備抑制腫瘤增殖藥物中的應用。
背景技術：
：細胞有絲分裂(mitosis)的主要任務是將復制的基因組(染色體)均等地分配給兩個子細胞。染色體分離的保真性對物種的生存與繁衍舉足輕重。染色體分離的缺陷將導致非整倍體，后者與腫瘤的發生關系密切。在有絲分裂過程中，染色體與紡錘體微管的連接是由動點(kinetochore)所介導的。動點是位于著絲粒(centromere)上的超蛋白質復合物，它不僅直接維系紡錘體絲與染色體的銜接，同時要調控染色體運動及染色體分離的時空序列性及保真性。這一定位在動點的保證染色體分離保真性的信號通路被稱為“紡錘體檢驗點”(spindleassemblycheckpoint,SAC)。在全部染色體都實現了穩定的雙極定向連接之前，紡錘體檢驗點釋放一個抑制中期/后期轉換的信號，阻止細胞進入后期。從生化水平看，紡錘體檢驗點是通過抑制后期啟動復合物APC/C的泛素E3連接酶活性而發揮功能的。紡錘體檢驗點的失調(deregulation)是產生非整倍體及染色體不穩定性的主要原因之一(HollandandCleveland，2009)。已經在一些呈現染色體不穩定性的癌癥中發現檢驗點蛋白質Bubl和BubRl由于突變而功能喪失(Cahilletal.，1998)。隨后，多個研究結果表明了Bubl、BubRl的突變或過表達與染色體不穩定性和腫瘤密切相關(Ruetal.，2002；Hanksetal.,2004；Yuanetal.，2006)。但迄今為止，紡錘體檢驗點信號通路的蛋白質作用網絡及其信息流傳遞的分子機制仍不清楚。云力，點馬達蛋白CENP—E(centromereassociatedproteinΕ)是一個分子量為312kD的動點蛋白，包含一個位于N端的與驅動蛋白類似的馬達結構域和包含2069個氨基酸殘基的coiled-coil結構域。CENP-E是作為馬達蛋白直接介導動點對紡錘體微管捕獲，并且沿著微管行走牽引染色體運動。它與其它紡錘體檢查點蛋白BubRl相結合直接參與紡錘體檢驗點(Yaoetal.，2000)。CENP-E的缺失使紡錘體檢驗點失活，產生染色體不穩定性(Weaveretal.，2007)。此外，CENP-E在有絲分裂后期定位到中央紡錘體，提示它還參與有絲分裂后期事件及胞質分裂。因此，鑒定并剖析CENP-E的相互作用網絡是一項非常有意義的研究工作。
發明內容本發明的目的是提供一個新的調控染色體分離保真性的動點蛋白CENP-Z，它與CENP-E相互作用并共定位。本發明所提供的CENP-E結合蛋白，名稱為CENP-Z，其基因(cDNA)來源于人睪丸組織基因文庫，是下述氨基酸序列之一1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；或2)將SEQIDNO.1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而由SEQIDNO.1衍生的且與CENP-E蛋白結合對細胞有絲分裂的行進具有調控功能的氨基酸序列。序列表中的SEQIDNO.1由316個氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第166-216位及第248-316位氨基酸殘基為螺旋-螺旋(coiled-coil)結構域。所述取代、缺失或添加的一個或幾個氨基酸殘基可以是非結構域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產生影響。編碼上述CENP-E結合蛋白CENP-Z的基因Cenp-Z，是下述核苷酸序列之一1)如SEQIDNO.2所示的DNA序列；2)編碼如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的DNA序列；3)與如SEQIDNO.2所示的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與CENP-E蛋白結合對細胞有絲分裂的行進具有調控功能的蛋白質的核苷酸序列；或4)在高嚴謹條件下可與如SEQIDN0.2所示的DNA序列雜交且編碼與CENP-E蛋白結合對細胞有絲分裂的行進具有調控功能的蛋白質的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為在0.IXSSPE(或0.IXSSC，配方參見《MolecularCloning:ALaboratoryManual))(Sambrook,J.,Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001,NY,ColdSpringHarbor))、0.1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQIDN0.2由951個堿基組成，其編碼序列為自5，端第1_951位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO.1的氨基酸殘基序列的蛋白質。其中，自5，端第499-648位堿基和第745-948位堿基編碼coiled-coil結構域。含有本發明基因的表達載體、含有所述重組表達載體的轉基因細胞系和宿主菌均屬于本發明的保護范圍。擴增Cenp-Z中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。本發明的另一個目的是提供一種抑制Cenp-Z基因表達的方法。本發明所提供的抑制Cenp-Z基因表達的方法，是將抑制Cenp-Z基因表達的小干擾RNA或其編碼基因導入宿主，實現對CENP-Z基因表達的抑制。所述抑制Cenp-Z基因表達的小干擾RNA，可為正義鏈如SEQIDN0.3所示，反義鏈如SEQIDN0.4所示的雙鏈RNA序列。將雙鏈RNA序列命名為CENP-ZsiRNA。CENP-ZsiRNA的反義鏈與CENP-ZmRNA(GenBank:NM_033286)自編碼區起始密碼子ATG開始483-503位置序列互補(5，-AGGCTACAAACCACTGAGTAA-3’)，序列表中SEQIDN0.3由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5’端一3’端，序列表中SEQIDN0.4由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5’端一3’端。本發明提供了一個與CENP-E相互作用的動點蛋白CENP-Z，它在有絲分裂的早期與CENP-E共定位于動點及紡錘體極，到后期染色體分離后離開動點并移往中央紡錘體，末期定位到中體。由于該蛋白和CENP-E直接相互作用于動點，因此將其命名為CENP-Z。CENP-Z呈細胞周期依賴性表達，在有絲分裂前中期表達量最高。CENP-Z的CC2區域約70個氨基酸殘基負責其動點定位及與CENP-E的相互作用。利用RNAi敲除技術抑制Cenp-Z基因的表達的實驗結果表明，抑制Cenp-Z基因可以引起染色體的錯誤分離，并降低姐妹染色體的張力。實時活細胞監測結果表明，敲除Cenp-Z基因可以引起細胞周期的阻滯。上述實驗結果表明，本發明的CENP-Z是一個動點蛋白，通過與CENP-E和微管的相互作用參與調控細胞有絲分裂過程中染色體分離的保真性。可以其為活性成分制備抑制腫瘤細胞增殖的藥物，本發明的蛋白及其編碼基因將在醫學及制藥領域發揮重要作用，應用前景廣闊。本發明具體包括1、一種紡錘體動點結合蛋白CENP-Z，所述蛋白質是下述氨基酸序列之一1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；或2)將SEQIDNO.1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而由SEQIDNO.1衍生的且與CENP-E蛋白結合對細胞有絲分裂的行進具有調控功能的氨基酸序列。2、編碼以上1所述的紡錘體動點結合蛋白CENP-Z的Cenp-Z基因。3、根據以上2所述的Cenp-Z基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之1)如SEQIDNO.2所示的DNA序列；2)編碼如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的DNA序列；3)與如SEQIDN0.2所示的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與CENP-E蛋白結合對細胞有絲分裂的行進具有調控功能的蛋白質的核苷酸序列；或4)在高嚴謹條件下可與如SEQIDN0.2所示的DNA序列雜交且編碼與CENP-E蛋白結合對細胞有絲分裂的行進具有調控功能的蛋白質的核苷酸序列。4、含有以上2或3所述的Cenp-Z基因的表達載體。5、含有以上4的表達載體的轉基因細胞系或宿主。6、一種抑制以上2或3所述的Cenp-Z基因表達的方法，所述方法包括將抑制所述Cenp-Z基因表達的小干擾RNA或其編碼基因導入宿主從而抑制Cenp-Z基因的表達。7、根據以上6所述的方法，其特征在于所述抑制Cenp-Z基因表達的小干擾RNA是正義鏈如SEQIDN0.3所示，反義鏈如SEQIDN0.4所示的雙鏈RNA序列。8、以上5或6的方法用于抑制細胞有絲分裂或抑制腫瘤細胞增殖的應用。9、以上5或6的方法在制備抑制細胞有絲分裂或抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用。10、用于擴增根據以上2或3所述的Cenp-Z基因的編碼區的引物對，所述引物對為引物CENP-Zf:5，-CGGAATTCATGGCGGCTCCCGAAGCC-3，和引物CENP-Zr:5，-CGGGATCCGAGCCATCTGGCCACTTGCTTCTTC-3，。11、一種抑制以上2或3所述的Cenp-Z基因表達的小干擾RNA，所述小干擾RNA是正義鏈如SEQIDN0.3所示，反義鏈如SEQIDN0.4所示的雙鏈RNA序列。12、一種抑制以上2或3所述的Cenp-Z基因表達的試劑盒，其包括以上11所述的小干擾RNA。13、以上11所述的小干擾RNA或以上12所述的試劑盒用于抑制細胞有絲分裂或抑制腫瘤細胞增殖的應用。14、以上11所述的小干擾RNA或以上12所述的試劑盒在制備抑制細胞有絲分裂或抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用。5下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。圖1為CENP-Z氨基酸序列的同源性比對結果，其中Human為人的序列，Dog為狗的序列，Mouse為小鼠的序列，Zebrafish為斑馬魚的序列。圖2為CENP-Z氨基酸序列的結構域分析結果，其中166-216位和M8-316位為coiled-coil結構域，稱為CCl和CC2。1-165位氨基酸殘基沒有已知的結構域，稱為NT，兩個coiled-coil之間稱為Link區域。圖3A為GFP-CENP-Z與CENP-E在有絲分裂中期的共定位，其中下排的小圖顯示了一對放大的動點，表明CENP-Z與CENP-E呈現完美的共定位；圖3B為GFP-CENP-Z與CENP-E在整個有絲分裂期呈現共定位。圖4為CENP-Z與CENP-E2132_261°之間的相互作用的體外pull-down檢測結果，該結果證實MBP-CENP-E2132_261°與HiS-CENP-Z相互作用。上圖為如圖所示的樣品經過10%SDS-PAGE分離后用考馬斯亮藍染色的結果，下圖為同樣的樣品經過SDS-PAGE分離后用抗His標簽抗體進行免疫印跡檢測的結果。圖5為CENP-Z全長和6個截斷突變體的表達分析。圖6為CENp-E21f與不同的CENP-Z片段之間的相互作用的酵母雙雜交分析。圖中+表示陽性對照，-表示陰性對照，FL表示全長CENP-Z，NT表示N端，CT表示C端，CCl表示第一個螺旋-螺旋結構域，CC2表示第二個螺旋-螺旋結構域，△CC2表示缺失第二個螺旋-螺旋結構域，ΔCC2L表示缺失第二個螺旋-螺旋結構域及兩個螺旋-螺旋結構域之間的連接區。圖7為CENP-Z基因siRNA對CENP-Z基因在細胞內表達的抑制作用的檢測結果。其中，siControl表示對照siRNA，siCENP-Z表示針對CENP-Z的siRNA。圖8為轉染CENP-Z的siRNA后細胞的表型，與對照細胞相比，抑制CENP-Z的表達后，細胞呈現嚴重的染色體排列錯誤和高比例的多極紡錘體。其中，siControl表示對照siRNA,siCENP-Z表示針對CENP-Z的siRNA，MT表示微管，ACA表示內層動點，DNA表示染色體，Merge表示前三個通道的合并后圖像。具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見((MolecularCloning:ALaboratoryManual))(Sambrook,J.,Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001，NY,ColdSpringHarbor)所用引物及DNA序列均由上海hvitrogen公司合成。實施例1、CENP-E結合蛋白CENP-Z基因的獲得以人睪丸組織的基因文庫為模板，應用引物CENP-Zf(上游引物)和CENP-Zr(下游引物)，利用聚合酶鏈式反應技術(PCR)擴增CENP-Z基因的編碼區。PCR采用LATaq聚合酶(Takara公司)催化反應，94°C熱啟動，退火溫度為55°C，72°C延伸1分鐘。反應結束后，利用T4DNA連接酶將PCR擴增產物連接入pMD18-T載體(Takara公司)中。再將連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞(具體制備參見上述參考書)，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆并抽提質粒(上述參考書中的常規方法)，得到含有目的片段的重組質粒，命名為PMD18-CENP-Z。對其進行測序，測序結果表明野生型人CENP-Z基因具有序列表中SEQIDN0.2的核苷酸序列，序列表中的SEQIDNO.2由951個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-948位堿基，編碼具有序列表中SEQIDNO.1的氨基酸殘基序列的蛋白質。其中，自5，端第499-648位堿基和第745-948位堿基編碼coiled-coil結構域。對上述來源于人的CENP-E結合蛋白CENP-Z的氨基酸殘基序列分別與來源于斑馬魚、小鼠和大鼠的CENP-Z的氨基酸殘基序列進行序列比對分析，結果如圖1所示(Human為本發明的人CENP-Z序列，Mouse為小鼠的CENP-Z序列，Dog為狗的CENP-Z序列，kbrafish為斑馬魚的序列)，表明CENP-Z是一個保守的蛋白質。同時，對本發明CENP-E的結合蛋白CENP-Z的氨基酸殘基序列進行結構域分析，分析結果如圖2所示，自氨基端(N端)第166-216位及第248-316位氨基酸殘基為coiled-coil結構域。弓丨物CENP-Zf5，-CGGAATTCATGGCGGCTCCCGAAGCC-3，弓丨物CENP-Zr5，-CGGGATCCGAGCCATCTGGCCACTTGCTTCTTC-3，實施例2、CENP-Z在細胞周期中的亞細胞定位一、構建GFP-真核細胞表達質粒使用EcoRI和BamHI限制性內切酶(Takara公司)將CENP-Z基因從PMD18-CENP-Z質粒中切下，經瓊脂糖電泳使CENP-Z基因與pMD18_T載體分離，并用UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒(Sangon公司)回收基因片段。將得到的基因片段用T4連接酶(Takara公司)插入到載體pEGFP_C2(Clontech公司)中(預先用EcoRI和BamHI雙酶切)，將連接產物轉化大腸桿菌T0P10菌株感受態(購自hvitrogen公司)，涂布于含有卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆(上述參考書中的常規方法)。抽提質粒后經DNA測序，確定CENP-Z基因正確插入到pEGFP-C2載體中，將獲得的重組質粒稱為GFP-CENP-Z。二、將GFP-CENP-Z質粒轉染進HeLa細胞根據生產商的說明書，在一個Eppendorf管中加入50μ1Opti-MEM無血清培養基(購自Invitrogen公司)，再加入L5μ1Lipofectamine2000轉染試劑(購自Invitrogen公司)，混勻后離心并靜置5分鐘；在另一個Eppendorf管中加入50μ1Opti-MEM無血清培養基，加入1μg如上獲得的重組質粒GFP-CENP-Z，混勻后離心靜置5分鐘。將兩個試管中的溶液混合，混勻后離心并靜置15分鐘。最后，將反應混合液加入生長于M孔板中(含有蓋玻片)的HeLa細胞(購自ATCC)的培養基(DMEM培養基，購自hvitrogen公司)中。三、GFP-CENP-Z亞細胞定位的免疫熒光檢測轉染后M小時，棄去孔中的培養基，用PBS緩沖液洗一遍。棄去溶液，用PHEM緩沖液(IOOmMPIPES,20mMHEPES,pH6.9,5mMEGTA,2mMMgCl2,4Mglycerol)洗一分鐘。然后用含有0.1%TritonX-IOO的PHEM緩沖液處理一分鐘以使細胞膜穿孔并允許細胞質內可溶性的蛋白質滲透出來。然后用4%新鮮配制的甲醛(溶解于PHEM中)固定細胞10分鐘，固定后用PBS緩沖液洗三遍，每次5分鐘。接下來，用BSA(溶解于含有TritonX-100的Tris鹽緩沖液，即TBST緩沖液中)在室溫下封閉30分鐘。用適當稀釋的一抗ACA抗血清(抗著絲粒抗血清，購自Immunovision公司)或CENP-E抗體(購自Abcam公司)在室溫孵育細胞/蓋玻片60分鐘。加100μ11%BSA(溶解于TBST緩沖液)至蓋玻片上以洗去非特異性結合的抗體，洗三次，每次5分鐘。然后將帶有Iihodamine偶聯的抗人二抗(Rhodamine(TRITC)-AffinityPureDonkeyAnti-HumanIgG(H+L))或FITC偶聯的抗兔的二抗(FITC-AffinityPureDonkeyAnti-RabbitIgG(H+L))(針對ACA的二抗用抗人的二抗，針對CENP-E的二抗用抗兔的二抗,均購自JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.)加在蓋玻片上，室溫孵育30分鐘。為了標記DNA，用DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)染一分鐘。用100μ1PBS洗滌三次，每次5分鐘。最后，在載玻片上加適量(5μ1)的熒光抗淬滅封片劑(購自Vector公司)，輕輕地將蓋玻片蓋下(生長細胞的一面朝下)，用指甲油封片。在DeltaVision熒光顯微鏡(AppliedPrecision公司)下觀察染好的片子，拍照后應用SoftWorx軟件進行去卷積處理。結果如圖3A和圖所示(圖中，CENP-E表示馬達動點蛋白CENP-E，CENP-Z表示GFP-CENP-Z的定位，DAPI表示染色質/染色體，Merge表示將上述三種顏色的通道合并結果)，圖3A說明CENP-Z與CENP-E有共定位且定位于動點，表明CENP-Z是一個動點蛋白；圖:3B說明到有絲分裂前期到中期，CENP-Z定位于動點，在后期姐妹染色體分離時，CENP-Z從動點上下來，定位到中央紡錘體和中體。實施例3、CENP-Z與CENP-E相互作用區域的鑒定一、CENP-E2132-2701基因的原核表達及表達產物的純化人工合成野生型CENP-E基因包含第21324610位氨基酸序列的cDNA(簡稱CENP-E2132^2610基因)，先用限制性內切酶BamHI對CENp-E2132_261°基因進行單酶切，然后將其連接入經相同酶切的載體pMAL-c2(NEB公司)中。連接產物隨后被轉化大腸桿菌Rosetta(DE;3)pLysS感受態細胞(購自hvitrogen公司)，將轉化細胞接種于含100mg/L氨芐青霉素和:Mmg/L氯霉素的LB抗性平板(LB+Amp+Cm)上進行篩選。挑取長出的單克隆，將其接種到5mLLB+Amp+Cm液體培養基中，在37°C下搖菌12-16小時。然后按1100的比例接種于500mLLB+Amp+Cm液體培養基中，在37°C、250rpm下振蕩培養，待其600nm的OD值達0.6時，加入0.3mMIPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，購自上海生工公司)，于16°C、250rpm誘導16小時。培養結束后，離心收集菌體，重懸于MBP緩沖液QOmMTris-HClpH7.4,IOOmMNaCl,ImMEDTA,ImMDTT，ImMPMSF(苯甲基磺酰氟)，Ix大腸桿菌蛋白酶抑制劑混合物)，使用壓力破碎儀裂解細胞，然后使用高速冷凍離心機，12000rpm離心30分鐘，棄沉淀，將上清與直鏈淀粉親和樹脂(NEB公司)在4°C下孵育1小時后，用MBP緩沖液沖洗樹脂。取上清，樹脂及沉淀樣品走10%SDS-PAGE檢測表達蛋白的純化效果，檢測結果表明獲得了純度較高的分子量約100KD的與MBP蛋白(麥芽糖結合蛋白)融合的MBP-CENP-E2132"2610融合蛋白。二、CENP-Z基因的原核表達及表達產物的純化先用限制性內切酶EcoRI和)(hoI對含有野生型CENP-Z基因的質粒pMD18_CENP_Z進行雙酶切，回收并純化約950bp的CENP-Z基因片段，然后將其連接入經相同酶切的載體pETj8a(Merck/Novagen公司)中。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板(LB+Kan)上篩選重組子。培養重組子克隆，抽提質粒經酶切鑒定獲得pETj8a-CENP-Z原核表達重組質粒。將上述質粒轉化大腸桿菌Rosetta(DE;3)pLysS感受態細胞，將轉化細胞接種于含50mg/L卡那霉素和3%ig/L氯霉素的LB抗性平板(LB+Kan+Cm)上進行篩選，挑取長出的單克隆，將其接種到5mlLB+Kan+Cm液體培養基中，在37°C下搖菌12-16小時，然后按1100的比例接種于500mlLB+Kan+Cm液體培養基中，在37°C、250rpm下振蕩培養，待其600nm的OD值達0.6時，加入0.25mMIPTG，于16°C、250rpm誘導16小時。培養結束后，離心收集菌體，重懸于裂解緩沖液(50mMNaH2P04，ρΗ8·0，300mMNaCl，10mM咪唑，IOmMβ-巰基乙醇，ImMPMSF,Ix大腸桿菌蛋白酶抑制劑混合物)。使用壓力破碎儀裂解細胞，然后使用高速冷凍離心機，12000rpm離心30分鐘，棄沉淀，將上清與Bio-Rad柱中的0.5ml鎳樹脂(Qiagen公司)4°C孵育lh。用5倍體積的洗滌緩沖液I(50mMNaH2P04,pH8.0,300mMNaCl,20mM咪唑)和洗滌緩沖液II(50mMNaH2P04,pH8.0,300mMNaCl，40mM咪唑)分別洗柱子并收集。用0.5ml洗脫緩沖液(50mMNaH2P04,pH8.0,300mMNaCl，200mM咪唑)洗四次并收集，再重復四次，得到純度較高的與組氨酸標簽(His6-tag)融合的His-CENP-Z融合蛋白。三、體外pull-down檢測CENP-Z與CENP-E2132-261°之間的相互作用在3個Eppendorf管中分別加入50μ1直鏈淀粉樹脂(NEB公司)、結合有MBP蛋白(麥芽糖結合蛋白)的直鏈淀粉樹脂和結合有MBP-CENP-E2132_261°融合蛋白的直鏈淀粉樹脂(見步驟一)，再在這3個Eppendorf管中加入各250μ1的His-CENP-Z融合蛋白的大腸桿菌裂解液上清(裂解緩沖液為MBP緩沖液+ImMPMSF+lx大腸桿菌蛋白酶抑制劑混合物)，4°C混勻儀上孵育1小時。然后4°C、IOOOrpm離心2min，將上清轉移到新的Eppendorf管中，待做電泳分析。用250μ1冰預冷的MBP緩沖液懸浮樹脂，4°C、IOOOrpm離心2min，重復三次，加入IX電泳樣品緩沖液Q%SDS，50mMTrispH6.8，10%甘油，0.01%溴酚藍)50μ1，100°C煮樣品4分鐘，進行電泳并分別用考馬斯亮藍染色和轉移到硝酸纖維素膜上用抗His標簽抗體進行免疫印記檢測，電泳圖譜如圖4所示(泳道1純化的MBP-CENP-E2132_261°；泳道2用MBP-CENP-E2132-261。pull-downHis-CENP-Z；泳道3純化的MBP；泳道4用MBPpu11-downHis-CENP-Z；泳道5用空的直鏈淀粉樹脂pull-downHis-CENP-Z；泳道6:pull-down前的His-CENP-Z))。這個實驗結果表明CENP-Z可以和CENP-E2132-261°在體外直接相互作用。四、CENP-Z的6段缺失突變體的真核表達根據CENP-Z基因，構建6段不同長度的缺失突變體(Truncationmutant)，分別為自5’端第1-498位堿基(編碼自N端第1-166位氨基酸殘基，將該片段命名為NT)、第499-948位堿基(編碼自N端第166-316位氨基酸殘基，命名為CT)、第1-744位堿基(編碼自N端第1-248位氨基酸殘基，命名為ΔCC^)、第1-648位堿基(編碼自N端第1-216位氨基酸殘基，命名為ΔCC2L)、第499-648位堿基(編碼自N端第166-216位氨基酸殘基，命名為CCl)、第745-948位堿基(編碼自N端第248-316位氨基酸殘基，命名為CC^)。所應用的引物對序列如下NT:5，-ATGAATTCATGGCGGCTCCCGAAG-3，5’-ATGGATCCTGGTTTGTAGCCTTTTCTG-3，；CT:5’-ATGAATTCCTGAGTAAGCAAAAATCAGA-3’5’-ATGGATCCCATTTCTAATAGCTGCTCC-3，；ΔCC25’-ATGAATTCATGGCGGCTCCCGAAG-3’5’-ATGGATCCGTCCATGTGATCAGTAGTG-3’；ΔCC2L5’-ATGAATTCATGGCGGCTCCCGAAG-3’5’-ATGGATCCGTTGTCCCGAAACTTCTC-3，；CCl:5，-ATGAATTCCTGAGTAAGCAAAAATCAGA-3，5，-ATGGATCCGTTGTCCCGAAACTTCTC-3，；CC2:5’-ATGAATTCTCTATGTTGCTGTTAGAAAC-3，5’-ATGGATCCCATTTCTAATAGCTGCTCC-3’；PCR反應條件如下95°C/30秒；然后94°C/30秒/30秒，72°C/60秒，循環30次；最后在72°C延伸5分鐘。然后將6段突變體的PCR產物酶切(EcoRI，BamHI)后分別插入經相同酶切的帶有GFP標簽的載體pEGFP-Cl中，將連接產物轉染大腸桿菌DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆，提質粒經酶切鑒定獲得重組質粒。將6種質粒分別用Lipofectamine2000試劑轉染生長于6孔板中的人胚腎成纖維細胞(購自ATCC)，在37°C下培養于含有10%FCS的DMEM培養基中。轉染后M小時收集細胞，裂解于200μ1HEPES裂解緩沖液(50mMHEPESpH7.4,150mMNaCl,0.5%TritonX-100,ImMDTT,30ug/mlDNase,30ug/mlRNase，蛋白酶抑制劑雞尾酒)中。應用GFP抗體(購自Abcam公司)通過免疫印跡法檢測重組蛋白的表達，如圖5所示，GFP-CENP-Z全長和6個截斷突變體均正確表達。五、酵母雙雜交檢測CENP-Z與CENP-E作用的最小區域根據步驟四的6對引物，利用PCR的方法，從全長的CENP-Z的基因上擴增，獲得6種缺失突變體的片段，即NT、CT、ΔCC2、ΔCC2L、CC1和CC2。然后將6段突變體的PCR產物酶切(BamHI和EcoRI雙酶切)，分別插入經相同酶切的表達包含激活結構域(AD)的融合蛋白的PGADT7載體(購自Clontech公司)中，將連接產物轉化進入大腸桿菌ToplO感受態細胞，篩選陽性克隆，抽提質粒經測序鑒定，獲得重組質粒，即PGADT7中Gal4AD融合的NT、CT、ΔCC2、ΔCC2L、CCl和CC2質粒，即pGADT7_CENP_Z(NT)、pGADT7_CENP_Z(CT)、pGADT7-CENP-Z(ΔCC2)、pGADT7_CENP_Z(ΔCC2L)、pGADT7_CENP_Z(CCl)和pGADT7-CENP-Z(CC2)。實驗所需的與pGBKT7中Gal4BD融合的CENP-E質粒，即PGBKT7-CENP-E已經具備，參見Liuetal.，JBiolChem.(2007)282:21415-24.。復蘇凍存的AH109酵母保存種(購自Clontech公司)，在YPDA板(蛋白胨20g/1，酵母提取物1(^/1，瓊脂2(^/1，0.2%腺嘌呤)上劃線。30°C培養23天后，挑取直徑23毫米的單克隆，在YPDA液體培養基(蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，0.2%腺嘌呤)IOOml中培養，30°C、250rpm，大約培養12小時，OD600約為0.4左右。IOOOrpm離心5分鐘收集酵母，用IOmlIXTE緩沖液重懸一次；再次離心用1.5mlIXTE/LiAc重懸，重復兩次，從而獲得酵母感受態備用。在Eppendorf管中混合質粒，分別包括pGADT7_CENP_Z(NT)、pGADT7_CENP_Z(CT)、PGADT7-CENP-Z(ΔCC2)、pGADT7-CENP-Z(ΔCC2L)、pGADT7-CENP-Z(CC1)或PGADT7-CENP-Z(CC2)IOOng和pGBKT7_CENP_E200ng,以及50μg的高溫變性后的鮭魚精子DNA(上海生工公司)。然后加入100μ1感受態酵母，500μ1PEG4000/LiAc(每IOml中8ml50%PEG4000,Iml10XTE,Iml10XLiAc)，30°C放置30分鐘，保持混勻狀態。接下來加入50μ1DMS0，42°C放置15分鐘，保持混勻狀態，冰上冷卻2分鐘。離心收集酵母，用100μ11XTE重懸，涂布于二缺SD/-Trp/-Leu(缺少兩種氨基酸的酵母培養基)和三缺板SD/-Trp/-LeU/-His(缺少三種氨基酸的酵母培養基)上，30°C培養3天后挑取單克隆在四缺板SD/-Trp/-Leu/-His/-AdeΧ_α-gal(缺少四種氨基酸的酵母培養基并且含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃半乳糖苷)上劃線。培養3天后觀察結果。結果如圖6所示，CENP-Z的C端和CC2與CENP-E存在相互作用。CENP-Z的全長與CENP-E的作用較弱，可能由于CENP-Z的N端與C端存在分子內相互作用而封閉了C端與CENP-E結合的區域。C端的作用強于CC2與CENP-E的作用，藍色更深，提示CCl可能參與與CENP-E的結合。酵母雙雜交的結果表明，CENP-Z的248-316氨基酸負責與CENP-E相互作用。實施例4、CENP-Z基因siRNA的合成及其對CENP-Z抑制作用的表型檢測一、抑制CENP-Z基因表達的siRNA及其編碼基因的設計及合成根據CENP-Z基因的mRNA序列，借助Dharmacon公司在網上提供的siRNA工具軟件設計其siRNA序列，選取分值最高的靶序列，命名為CENP-ZsiRNA。再設計一條作為陰性對照的雙鏈RNA序列，命名為ControlsiRNA,靶序列如下CENP-ZsiRNA正義鏈5，-GCUACAAACCACUGAGUAA-3，(序列表中SEQIDN0.3)反義鏈5，-UUACUCAGUGGUUUGUAGC-3，(序列表中SEQIDN0.4)；(A、G、C、U表示四種核糖核酸)ControlsiRNA正義鏈:5，-UCCUUAGGCAACAGCCACC-3，反義鏈5，-GGUGGCUGUUGCCUAAGGA-3，二、檢驗CENP-ZsiRNA抑制CENP-Z基因表達的效果在傳代HeLa細胞時，將細胞分入6孔板中，細胞密度大約為20%，置于細胞培養箱中培養生長。M小時后，根據制造商的操作指南進行轉染。在一個試管中加入200μ1Opti-MEM無血清培養基(Invitrogen公司)，加入12μ1濃度為20ηΜ的CENP-ZsiRNA；另一個試管中加入48μIOpti-MEM無血清培養基，再加入12μ1Oligofectamine轉染試劑(Invitrogen公司)，混勻后靜置5分鐘。然后將兩個試管中的溶液混合，離心后靜置20分鐘。然后將混合溶液加入生長于6孔板中的細胞中。轉染后48小時，用塑料刮子將細胞刮下，離心后棄去PBS緩沖液，加入200μ1HEPES裂解緩沖液(50mMHEPESpH7.4,150mMNaCl，0·5%TritonX-100,ImMDTT,30ug/mlDNase,30ug/mlRNase，蛋白酶抑制劑雞尾酒)。重懸后冰上靜置10分鐘，12000轉、4°C、離心15分鐘。上清加入電泳樣品緩沖液(前已給出)后，95°C煮樣3分鐘。制備好的樣品應用CENP-Z抗體(實驗室根據參考書，先表達純化CENP-E重組蛋白，將得到的蛋白免疫兔子并進一步從兔子血清中純化得到)進行免疫印跡分析，結果如圖7所示，表明我們的CENP-ZsiRNA可以有效抑制CENP-Z基因表達。三、檢測CENP-Z基因的表達被抑制的表型根據hvitrogen公司的Oligofectamine試劑盒操作指南將化學合成的CENP-ZsiRNA和ControlsiRNA分別轉染M孔板內(含有載玻片)的HeLa細胞中，轉染36小時后加入蛋白酶抑制劑MG-132(購自Sigma公司)處理2小時，然后應用“實施例2”中的方法固定細胞，進行免疫熒光染色。分別用抗微管抗體和ACA抗血清標記微管和動點。結果如圖8所示，對照細胞的染色體大都正確地排列到赤道板，而抑制CENP-Z的表達后，超過50%的細胞中的染色體無法正確排列。參考文獻CahillDP,LengauerC,YuJ,RigginsGJ,WillsonJK,MarkowitzSD,KinzlerKW,VogelsteinB.1998.Mutationsofmitoticcheckpointgenesinhumancancers.Nature.392:300-3.HanksS,ColemanK,ReidS,PlajaA,etal.,2004.ConstitutionalaneuploidyandcancerpredispositioncausedbybiallelicmutationsinBUBIB.NatGenet.361159-61.HollandAJ,ClevelandDW.2009Boverirevisited:chromosomalinstability,aneuploidyandtumorigenesis.NatRevMolCellBiol.10:478-87.LiuD,DingX,DuJ,CaiX,HuangY,WardT,ShawA,YangY,HuR,JinC,YaoX.2007.HumanNUF2interactswithcentromere-associatedproteinEandisessentialforastablespindlemicrotubule—kinetochoreattachment.JBiolChem.282:21415-24.RuHY,ChenRL,LuWC,ChenJH.2002.hBUBldefectsinleukemiaandlymphomacells.Oncogene.21:4673-9.WeaverBA,SilkAD,MontagnaC,Verdier-PinardP,ClevelandDff.2007.Aneuploidyactsbothoncogenicallyandasatumorsuppressor.CancerCell.11:25-36.YaoX,AbrieuA,ZhengY,SullivanKF,ClevelandDff.2000.CENP-Eformsalinkbetweenattachmentofspindlemicrotubulestokinetochoresandthemitoticcheckpoint.NatCellBiol.2:484-91.YuanB,XuY,WooJH,WangY,etal.,2006.Increasedexpressionofmitoticcheckpointgenesinbreastcancercellswithchromosomalinstability.ClinCancerRes.12:405-10.權利要求1.一種紡錘體動點結合蛋白CENP-Z，所述蛋白質是下述氨基酸序列之一1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；或2)將SEQIDNO.1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而由SEQIDNO.1衍生的且與CENP-E蛋白結合對細胞有絲分裂的行進具有調控功能的氨基酸序列。2.編碼權利要求1所述的紡錘體動點結合蛋白CENP-Z的Cenp-Z基因。3.根據權利要求2所述的Cenp-Z基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之1)如SEQIDNO.2所示的DNA序列；2)編碼如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的DNA序列；3)與如SEQIDNO.2所示的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與CENP-E蛋白結合對細胞有絲分裂的行進具有調控功能的蛋白質的核苷酸序列；或4)在高嚴謹條件下可與如SEQIDNO.2所示的DNA序列雜交且編碼與CENP-E蛋白結合對細胞有絲分裂的行進具有調控功能的蛋白質的核苷酸序列。4.含有權利要求2或3所述的Cenp-Z基因的表達載體。5.含有權利要求4的表達載體的轉基因細胞系或宿主。6.一種抑制權利要求2或3所述的Cenp-Z基因表達的方法，所述方法包括將抑制所述Cenp-Z基因表達的小干擾RNA或其編碼基因導入宿主從而抑制Cenp-Z基因的表達。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述抑制Cenp-Z基因表達的小干擾RNA是正義鏈如SEQIDNO.3所示，反義鏈如SEQIDNO.4所示的雙鏈RNA序列。8.權利要求5或6的方法用于抑制細胞有絲分裂或抑制腫瘤細胞增殖的應用。9.權利要求5或6的方法在制備抑制細胞有絲分裂或抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用。10.用于擴增根據權利要求2或3所述的Cenp-Z基因的編碼區的引物對，所述引物對為引物CENP-Zf:5，-CGGAATTCATGGCGGCTCCCGAAGCC-3，和引物CENP-Zr:5，-CGGGATCCGAGCCATCTGGCCACTTGCTTCTTC-3，。11.一種抑制權利要求2或3所述的Cenp-Z基因表達的小干擾RNA，所述小干擾RNA是正義鏈如SEQIDNO.3所示，反義鏈如SEQIDNO.4所示的雙鏈RNA序列。12.—種抑制權利要求2或3所述的Cenp-Z基因表達的試劑盒，其包括權利要求11所述的小干擾RNA。13.權利要求11所述的小干擾RNA或權利要求12所述的試劑盒用于抑制細胞有絲分裂或抑制腫瘤細胞增殖的應用。14.權利要求11所述的小干擾RNA或權利要求12所述的試劑盒在制備抑制細胞有絲分裂或抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種紡錘體動點結合蛋白及其編碼基因與應用。其目的是提供一種紡錘體動點結合蛋白及其編碼基因與其在制備抑制腫瘤增殖藥物中的應用。該蛋白是下述氨基酸序列之一1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；或2)將SEQIDNO.1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而由SEQIDNO.1衍生的且與CENP-E蛋白結合對細胞有絲分裂的行進具有調控功能的氨基酸序列。該蛋白通過與CENP-E的相互作用參與細胞有絲分裂的紡錘體檢查點信號轉導途徑，可以其為活性成分作為藥靶開發抑制腫瘤細胞增殖的藥物。本發明的蛋白及其編碼基因將在醫學及制藥領域發揮重要作用，應用前景廣闊。文檔編號C12N15/113GK102559687SQ20101059749公開日2012年7月11日申請日期2010年12月16日優先權日2010年12月16日發明者丁霞,姚雪彪,莊筱璇,王冬梅,王茜瑋,竇震,都建申請人:中國科學技術大學