專利名稱：枳促分裂原活化蛋白激酶基因PtrMAPK克隆及用于提高植物抗旱能力的制作方法
技術領域：
本專利屬于植物基因工程領域。具體涉及從枳(Poncirus trifoliate)中分離、 克隆得到促分裂蛋白激酶基因PtrMAPK，然后將該基因導入到模式植物煙草中進行功能驗證，獲得的轉基因植株抗干旱能力明顯提高。
背景技術：
植物在生長發育過程中經常受到外界不良環境的影響，其中干旱已被證明是最具破壞力一種非生物逆境，嚴重影響植物的生長、發育及產量。然而，植物受到不利的外部環境刺激時，并不是被動地接受。事實上，植物在漫長的演變過程中，已經建立了一套應答逆境脅迫的機制，涉及到植物對逆境信號的感受、逆境信號的傳遞，以及相應受體對逆境信號的識別與轉導等三個階段，此過程受一個錯綜復雜的信號通路調控。現在大家普遍認為蛋白質磷酸化在植物調控信號傳導中應對非生物逆境起著非常重要的作用，它是植物體內一種普遍存在的適應外界環境變化的調節機制，盡管一些家族的蛋白也參與蛋白的磷酸化， 但促分裂原蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)在植物將細胞外的刺激轉到細胞內這一轉導過程中起著很重要的作用。MAPKs是一類絲氨酸/蘇氨酸6er/Thr)蛋白激酶，MAPK級聯途徑有三類激酶組成并通過依次磷酸化將逆境信號傳遞下去，即MAPKKKKs — MAPKKs — MAPKs。植物體受到外界不良環境脅迫，并將其轉化為信號刺激并傳遞給其胞內受體，然后通過MAH(級聯途徑將信號放大并傳遞下去(Zhang et al. ,2006 ；Nadarajah and Sidek，2010)，進而激活植物體內一些抗逆基因的表達，使植物主動適應環境以生存下去。MAPKs級聯途徑的最上游激酶 MAPKKKs可以接受不同信號刺激，引起下游相應基因MAPKKs的表達，進而使MAPKs磷酸化激活，被激活的MAPKs根據需要有不同的去處，它轉移到細胞內或細胞核，在那里它磷酸化下游的蛋白質啟動細胞的響應(Pedley and Martin, 2005 ；Fiil et al. ,2009 ；Nadarajah and Sidek, 2010) 0在這個意義上說，蛋白激酶MAI3K是級聯的最后一個元件，是信號轉導從上游到靶基因的一個主要通道。目前已經從高等植物中分離出數量眾多的蛋白激酶，僅在擬南芥基因組序列測定過程中就發現了 20種MAPKsUO種MAPKKs、60種MAPKKKs，MAPKs的家族至少可以分為A、 B、C、D 4類研究發現A類MAPKs主要響應環境以及與激素有關的一些事件。對B類MAPKs 的研究相對A類要少一些，但研究發現B類MAPKs也參與了由環境脅迫引起的細胞內信號傳導，以及細胞分裂過程中的一些事件。自從植物第一個編碼MAI3K的基因上世紀90年代首先被克隆出來，到現在為止MAI3K已從幾種植物中分離得到(Zai’di et al.，2010 ；Nadarajah and Sidek, 2010) 0此外，一些MAPK已經被證明參與干旱的信號傳導，如擬南芥中AtMPK4 和 AtMPK6 (Ichimura et al.，2000 ；Nadarajah and Sidek, 2010)，水稻中的 0sMAPK5 和 0sMAPK6 (Xiong and Yang, 2003 ；Rolila and Yang，2007)。揭開這些信號因素為抗旱的基因工程提供一個可行的方法，因為在其他地方已被證明(Umezawa et al.，2006)。
必須指出的是，雖然MAPK已經從不同的植物當中被克隆，但大部分蛋白激酶在干旱脅迫中的功能仍有待進一步的驗證。另一方面，值得注意的是有關MAPK的大部份信息來源于擬南芥、水稻、煙草、番茄，但有關果樹MAH(解卻很有限。研究表明盡管MAH(信號通路在真核生物進化有一定的保守性，但這種級聯的組成和具體組成部分的功能卻存在一定的不同(Morris，2001 ；Zaidi et al. ,2010).枳對柑橘產業中應用廣泛的一種砧木，但是它很容易受到干旱，這就造成其在那些的水資源有限，周期性發生干旱地區的使用。雖然有較多的研究表明MAI3K基因已經在一些植物中克隆，但在枳中尚未見該基因克隆及功能驗證的報道，更未見應用枳MAPK基因轉化植物提高抗旱的文獻報道。
發明內容
本發明目的在于從枳(Poncirus trifoliate)中分離克隆出MAPK類促分裂蛋白激酶，申請人將這個蛋白激酶命名為PtrMAPK，并且通過農桿菌介導遺傳轉化方法鑒定它的抗旱功能，為植物抗非生物逆境分子設計育種提供新的基因資源，為實施綠色農業、節水農業提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發利用有利于降低農業生產成本和實現環境友好。本發明是這樣實現的申請人:基于植物基因克隆技術從枳(Poncirus trifoliate)中克隆得到一個新基因PtrMAPK，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所述，在SEQ ID NO :1所述序列的 73-1200bp處為該基因的編碼區；其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，它包含 1128bp的開放閱讀框，編碼375個氨基酸，等電點為5. 51，預測的分子量為43kD。申請人:設計了克隆上述的基因PtrMAPK的cDNA序列的引物對，其核苷酸序列如下所示lH向引物5，-CGGTCGACGGAGAGAGAGTAAAATGGCTGACG-3，(對應 SEQ ID NO 3)；反向引物5，-AAGGTACCGAAAGATTGTCGGCCACCTGCAG-3‘(對應 SEQ ID NO :4)。利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將所述的基因PtrMAPK轉化模式植物(煙草)， 使該基因在煙草中超表達，獲得的轉基因植株，經生物學功能驗證，表明本發明克隆的 PtrMAPK基因具有調控煙草抗旱性的功能。在本發明的實施例部分，我們闡述了枳PtrMAI5K促分裂蛋白激酶的分離、功能驗證和應用。
序列表SEQ ID NO :1是本發明分離自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAI^K的核苷酸序列，其中73-1200bp處為該基因的編碼區。序列表SEQ ID NO :2是本發明分離自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAI3K的編碼的氨基酸序列，它包含11 ^bp的開放閱讀框，編碼375個氨基酸。序列表SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4是克隆枳基因PtrMAPK的引物對的核苷酸序列。圖1是本發明的技術流程圖。圖2 是本發明的PtrMAI^K基因在脫水、鹽和低溫脅迫下的表達。其中圖2A是本發明的基因在枳田間苗(未轉基因)室溫下脫水不同時間點的表達模式；圖2B是枳的田間苗(未轉基因)在4度處理下，相應時間點取樣，采用實時定量PCR分析本發明的基因相對表達量；圖2C是枳的田間苗(未轉基因)在200mM氯化鈉處理下，相應時間點取樣，采用實時定量PCR分析本發明基因的相對表達量。圖3 是本發明的PtrMAPK基因亞細胞定位。圖中圖3A，GFP基因(對照)在明場(圖左)、紫外線(UV)光(中)下的成像，右圖為二者疊加后的成像；圖3B，PtrMAra基因在明場(左)、UV光(中)下的成像，右圖為二者疊加后的成像。圖4 是本發明的其中一個實施例的超表達載體圖。圖5 是本發明的一個實施例亞細胞定位用的載體圖。圖6 是PtrMAPK轉煙草后，選取兩個轉基因系(0E2和0E19)用RT-PCR分析外源基因PtrMAPK的超表達。圖7 是本發明中實施例轉PtrMAPK基因株系0E2和0E19及非轉基因植株(WT)生長30天后室溫脫水90分鐘后失水率(圖7A)、植株表型(圖7B)和電導率(圖7C)。圖8 是本發明中實施PtrMAPK基因株系0E2和0E19及非轉基因植株(WT)生長 60天后干旱21天后的表型(圖8A)、電導率(圖8B)和葉綠素含量(圖8C)圖9 是本發明中實施例PtrMAPK基因株系0E2和0E19及非轉基因植株(WT)生長30天后干旱20天后復水3天成活率及表型。其中圖9A是轉PtrMAPK基因株系0E2和 0E19及非轉基因植株(WT)干旱20天后復水3天的成活率統計，圖9B是PtrMAPK基因株系0E2和0E19及非轉基因植株(WT)干旱處理前的圖片，圖9C是0E2和0E19及非轉基因植株(WT)干旱20后復水3天的圖片。圖10 是本發明中實施例轉PtrMAPK基因株系0E2和0E19及非轉基因植株(WT) 生長30天后室溫脫水90分鐘后或移栽土壤中生長60天控水21天的活性氧染色結果。圖 IOA脫水90分鐘的DAB和NBT染色。圖8B為控水21天后的NBT和DAB染色。圖11 是本發明中實施例轉PtrMAPK基因煙草0E2和0E19和非轉基因植株(WT) 控水前及控水7天后SOD (圖11A)、CAT(圖11B)和POD (圖11C)三種酶活性測定。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明做出詳細的描述。根據以下的描述和這些實施例， 本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下， 可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。實施例1，PtrMAPK基因分離克隆及表達分析以MAI3K為關鍵詞搜索柑桔EST數據庫(HarvEST =Citrus ver. 0. 51),得到7個相近序列，這些由DNAstar (公用軟件)組成一個unigene，通過序列分析軟件(ORF Finder) 發現基因MAPK缺少5端編碼序列，利用5 ‘RACE試劑盒(Clontech，PaloAlto，CA, USA) 擴增出一個完整的ORF 序列，該序列用Primer Premier 5. 0設計引物GSPl (GSP，5’ -C CACACATCTATTGCAGCAGTGTAGTCAG-3，)，用RT-PCR方法擴出5端序列。將擴增的5端序列及已有的MAPK —個unigene利用軟件DNAstar重疊成一條序列。25°C脫水下從枳葉片抽提RNA及反轉錄，所得的第一鏈cDNA用于擴增PtrMAPK基因全長。RNA抽提使用Trizol 試劑盒(購自TakaRa，Code :D9108A，按照該試劑盒提供的操作說明書操作)，利用抽提的 IμgS RNA樣品經IU的DNaseI (購自Fermentas公司)室溫處理30分鐘后，加入1 μ 1 EDTA(25mM)，于65°C溫育10分鐘。第一鏈cDNA的合成用MBI反轉錄試劑盒(貨號K1621，CN 102533811 A
購自i^rmentas公司，按照試劑盒說明書操作)。擴增基因PtrMAPK引物對為正向引物 PtrMAPK Forward, 5，-CGGTCGACGGAGAGAGAGTAAAATGGCTGACG-3，(對應 SEQ ID NO 2)；反向引物PtrMAPK Reverse, 5，-AAGGTACCGAAAGATTGTCGGCCACCTGCAG-3，(對應 SEQ ID NO :3)。 25 μ 1 的反應體系中包括 IOOng cDNA, 1 X 緩沖液，2. 5mM MgCl2,0. 25mM dNTP，0. 5U Taq 聚合酶(前述緩沖液和Taq聚合酶購自Fermentas公司，Lithuania)，0.5μ M上述引物。PCR 反應在ΑΒΙ9700 (Applied Biosystem)擴增儀上按以下程序完成94°C，5分鐘，94°C變性30 秒，60°C退火50秒，72°C延伸90秒，35個循環；循環完成后72°C延伸15分鐘。產生一條單一 PCR條帶產物，經1 %的瓊脂糖凝膠電泳后，用Ε. Ζ. N. A DNA凝膠回收試劑盒(購自 Omega公司，美國)回收特異帶，提取步驟參照使用說明。回收純化的DNA溶液與pMD18_T 載體(購自寶生物工程大連有限公司即TaKaRa公司)進行連接反應，按說明書操作，連接反應體系中插入PtrMAPK基因與pMD18-T載體的摩爾比為3 1連接反應總體積是10 μ 1， 其中包括5μ 1的2Χ緩沖液(購自寶生物工程大連有限公司)，4.5μ 1純化的PCR產物， 0.5μ1 T載體。16°C過夜連接。取10 μ 1連接產物，采用熱擊法(參照《分子克隆實驗手冊》第三版，科學出版社，200 轉化大腸桿菌DH5ci，在含有50mg/L氨芐霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，挑取5個克隆測序(由上海聯合基因公司完成)，測序結果表明，本發明克隆PtrMAPK基因全長為1339bp (見SEQ ID NO 1所示)，通過測序、比對確定是本發明需要的目的基因，將這個基因命名為PtrMAPK，它包括lU8bp的編碼閱讀框，編碼375個氨基酸，等電點為5. 51，預測的分子量為43kD。BLASTX分析該序列與已知的(所有已發表的文獻和數據庫)的植物序列高度同源。推導的PtrMAra基因的氨基酸序列與報道的楊樹 (PtMAPK, XP_002314017)、煙草(NtMAPK，BAB79636)、黃瓜(CsMAPK，AAZ57337)的序列高度同源。多序列比對結果顯示PtrMAPK基因包括11個保守的蛋白激酶亞區，在其VII和VIII 亞區之間也存在一個催化區域，其中保守的TxY基序在此起關鍵作用。Motif scan預測氨基酸PtrMAI3K有四個磷酸化位點，一個蛋白激酶ATP結合區(Protein kinases ATP-binding region signature)。為分析PtrMAI3K基因是否對脫水、鹽和低溫處理響應，采用實時定量PCR分析該基因在上述處理下的表達。結果表明，雖然鹽脅迫處理下該基因表達量變化不大(見圖2A)， 但脫水處理(見圖2A)和低溫(見圖2C)均能誘導該基因表達，表明它是一個逆境應答候選基因。實施例2，PtrMAPK基因亞細胞定位本實施例利用洋蔥表皮研究PtrMAI3K基因的亞細胞定位。利用RT-PCR擴增出 PtrMAPK基因整個0RF，并在其擴增引物兩端加上NcoI和SpeI兩個酶切位點。首先將擴增產物裝在PMD18-T載體上，從而得到一個PMD18-TN/s-PtrMAPK重組載體。同時用NcoI 和SpeI去切PMD18-TN/s-PtrMAPK和pCAMBIA1302 (見圖3)，回收產物并連接，從而構建了一個重組載體，從而得到pCAMBIA1302-PtrMAPK-GFP重組載體。在確認序列無誤后，將 pCAMBIA1302-PtrMAPK-GFP重組載體及對照載體(pCAMBIA13(^)用熱擊法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實驗手冊》第三版，科學出版社，2002)分別轉入農桿菌EHA105。 農桿菌侵染洋蔥表皮按如下方法進行(1).劃平板，挑單克隆(含有重組質粒的農桿菌) 于:3ml YEB培養基(含卡那霉素(KmHOyg/ml，利福平(Rif) 25mg/L)，觀°C震蕩培養M 小時，至OD6tltl約0.6。2.用手術刀將洋蔥內表皮劃成Icm2大小，撕下置于報道的MS基本5/9頁
培養基(含3%蔗糖，0.75%瓊脂，不含激素)上暗培養M小時。3.按體積比為1 1000 比例，接種50 μ 1農桿菌菌液于50ml YEB (含Km 40μ g/ml, Rif25y g/ml)中，28°C振蕩培養12- 小時。4. 4000rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。5.加入50mlYEB培養基(含有IOmM MgCl2)。將洋蔥表皮放入菌液中浸泡30分鐘。6.吸干表面菌液，置于MS基本培養基(含 3%蔗糖，0.75%瓊脂，不含激素)上上培養兩天。用Olympus BX61型顯微鏡觀察報告基因定位情況。亞細胞定位結果表明含對照載體的農桿菌轉化的洋蔥表皮細胞中GFP熒光充滿整個細胞(附圖4A)，而含PtrMAPK基因載體的農桿菌浸染的洋蔥表皮中GFP熒光只在細胞核中(附圖4B)，證明PtrMAPK是核定位基因。實施例3，植物轉化載體構建根據pMV載體(切除⑶S基因的植物二元轉化載體pBI121中，由華中農業大學園藝林學學院葉志彪教授惠贈)的多克隆位點和PtrMAPK基因的編碼區序列，按照一般設計引物的原則用I^imer Premier 5. 0軟件設計出擴增PtrMAPK基因整個編碼區的上、下游 PCR引物(該引物對就是擴增本發明PtrMAI^K基因cDNA序列的引物對)。其序列如下所示Forward primer :5，~CGGTCGACGGAGAGAGAGTAAAATGGCTGACG~3‘Reverse primer :5，~AAGGTACCGAAAGATTGTCGGCCACCTGCAG~3‘以PtrMAI3K基因的克隆子為模板進行PCR擴增。PCR擴增的退火溫度為60°C。PCR 反應體系及擴增程序同實施例1。雙酶切體系反應總體積為40 μ 1，其中含有PCR的純化產物 8μ 1，10ΧΤ 緩沖液(購 TakaRa 自公司)6μ 1 及 0. BSA 4 μ 1, Kpn I 及 Mil 各 2 μ 1，雙蒸水18 μ 1。在37°C酶切過夜后純化回收。pMV載體的雙酶切體系反應總體積為 40 μ 1，其中含有經過質粒提取獲得的pMV載體DNA 8 μ 1，IOXM緩沖液(購自TakaRa公司)4μ1，Κρη I及Xho I各2μ1，加雙蒸水Μμ 。于37°C酶切過夜后純化回收。連接反應體系中插入PtrMAPK基因與載體pMV的摩爾比為3 1，反應總體積為10 μ 1，其中含有 IOXBuffer 1 μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，PtrMAPK基因的雙酶切回收產物6 μ l，pMV載體的雙酶切回收產物2 μ 1。在16°C反應14-16小時。連接產物轉化大腸桿菌菌株DH5 α，在含有 50mg/L卡那霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，抽提質粒進行酶切及PCR鑒定，測序確定沒有讀碼框突變，獲得含有插入目的片段的重組克隆，將其命名為PMV-PtrMAPK重組載體， 應用凍融法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2002 年)將重組載體pMV-PtrMAPK導入到農桿菌EHA105中。真核表達載體pMV-PtrMAPK構建流程見圖5所示。實施例4，煙草的遺傳轉化應用凍融法(參照薩姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2002年)將重組載體pMV-PtrMAPK導入到根癌農桿菌EHA105中，根癌農桿菌介導的煙草遺傳轉化步驟如下1.根癌農桿菌培養取超低溫冰箱中保存的根癌農桿菌菌液，在添加了卡那霉素 50mg/L的LB平板上劃線，刮取劃線菌斑，加入液體MS基本培養基中，28°C 180轉/分鐘振蕩培養，待菌液濃度達到0D_ = 0. 3 0. 8時作浸染。2.浸染取未轉基因的煙草葉片，切成0.5cmX0.5cm大小，然后放入制備好的根癌農桿菌菌液中，浸泡8 10分鐘，期間不斷振蕩。
3.共培養取浸染后的煙草葉片，無菌濾紙吸干上面的的菌液，然后接種于共培養培養基上(葉背面向下)，25°C暗培養3天。4.篩選培養經共培養3天后的煙草葉片，用500mg/L濃度的頭孢霉素溶液洗一遍，然后無菌水沖洗3 5次，再轉移入添加了 100mg/L卡那霉素和500mg/L頭孢霉素的篩
選培養基中。5.生根培養待篩選培養基上的不定芽長到Icm左右時，切下并轉入添加了 100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培養基上。6.煙草苗轉入土培待生根后的轉化苗長滿培養瓶，由生根培養基中取出，用自來水洗凈轉化苗上的培養基，并栽植于滅菌的營養土中。煙草轉化苗所用培養基見表1。表1煙草轉化苗所用培養基配方
培養基名稱組分及含量(培養基均含有30g/L蔗糖和0.7g/L瓊脂，pH調至5.8)
萁甭涵福涵慕弱醒6: 3
篩選培養基上述共培養培養基+100 mg/L Km+500 mg/L Cef 生根培養基 MS 基本培養基+0.3 mg/LNAA+100 mg/L Km +500 mg/L Cef注表1中培養基中激素和抗生素成分的定義6-BA-6-芐基氨基嘌呤；NAA-萘乙酸；Cef-頭孢霉素；Km-卡那霉素。7.陽性轉基因煙草初步確定按照實施例4的方法得到轉PtrMAPK基因的煙草抗性芽，按如下步驟提取煙草葉片總DNA :1、煙草葉片DNA提取取適量的轉基因煙草的葉片放入1.5mL離心管中，加液氮，充分研磨后；加入 700 μ 1 65 °C預熱的DNA提取緩沖液十六烷基三乙基溴化銨(簡稱CTAB，配方100mM Tris-HCKpH 8. 0)，1. 5M NaCl, 50mM EDTA(pH 8.0)溶液加 1 %聚乙烯吡咯燒酮，2% (體積)CTAB，65°C水浴充分溶解備用，用前在65°C水浴預熱后，加入(體積)巰基乙醇， 混勻)，65°C溫浴60-90分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒混勻；lOOOOg，離心10分鐘；取上清，加600 μ 1氯仿，顛倒混勻靜置3分鐘；lOOOOg，離心15分鐘；取上清450 μ 1，加入 900 μ 1預冷無水乙醇，420 μ 1 5Μ NaCl，混勻后，冰凍30分鐘，lOOOOg,離心10分鐘；棄上清后，用Iml 75%的乙醇，洗滌3次后，加適量雙蒸水溶解。陽性植株鑒定步驟如下設計引物NPTII和基因特異引物進行PCR擴增鑒定陽性苗。鑒定為可能的陽性植株移栽后獨立收獲種子(Tl代種子)，4°C春化處理3天，取0. Ig 在1. 5ml的離心管中，先用70%酒精浸泡種子20秒，接著用滅菌雙蒸水洗一次，再加入Iml 2. 5% NaClO表面消毒7分鐘，充分振蕩，棄去NaClO后用滅菌雙蒸水洗3次，最后用接種針將滅好的種子播于50mg/l具有卡那霉素(Km)MS基本培養基的上，結果表明本發明獲得的抗性苗在抗性平板上能正常生長，為綠色，而非抗性苗則黃化死去。成活的植株移栽再收獲 Tl代種子，T2代種子用于播種及抗性分析。實施例5，煙草轉化植株的分子及生理鑒定1、煙草葉片DNA提取
取適量煙草轉化植株的葉片放入1.5mL離心管中，加液氮，充分研磨后；加入 700 μ 1 65 °C預熱的DNA提取緩沖液十六烷基三乙基溴化銨(簡稱CTAB，配方100mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，1. 5MNaCl,50mM EDTA(pH 8. 0)溶液加聚乙烯吡咯烷酮，2% (體積) CTAB，65°C水浴充分溶解備用，用前在65°C水浴預熱后，加入1-4% (體積)巰基乙醇，混勻)，65°C溫浴60-90分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒混勻；lOOOOg，離心10分鐘；取上清，加600 μ 1氯仿，顛倒混勻靜置3分鐘；IOOOOg,離心15分鐘；取上清450 μ 1,加入 900 μ 1預冷無水乙醇，420 μ 1 5Μ NaCl，混勻后，冰凍30分鐘，lOOOOg，離心10分鐘；棄上清后，用Iml75 %的乙醇，洗滌3次后，加適量雙蒸水溶解。2、陽性轉基因植株PCR檢測采用引物NPTII和基因特異引物進行PCR擴增。引物序列、反應程序及體系分別見表2、表3和表4。采用特異引物進行PCR鑒定。表2引物序列信息
權利要求
1.一種分離自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAPK，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所述。
2.一種分離自枳的具有抗旱功能的基因PtrMAPK，其編碼的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO 2 所述。
3.一種克隆權利要求1或2所述基因PtrMAPK的引物對，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO 4 所述。
4.權利要求1或2所述的基因在植物抗旱中的應用。
5.權利要求4所述的應用，其中包括在柑橘抗旱中的應用。
全文摘要
本發明屬于植物基因工程領域。具體涉及從枳中分離、克隆得到枳(Poncirustrifoliata)MAPK基因(PtrMAPK)。該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示；其對應的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO2所示；它包含1128bp的開放閱讀框，編碼375個氨基酸，等電點為5.51，預測的分子量為43kD。將本發明所述的基因PtrMAPK導入到煙草進行功能驗證，獲得的轉基因煙草植株抗旱能力明顯提高。本發明為植物抗非生物逆境分子設計育種提供了新的基因資源，為實施綠色農業、節水農業提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發利用有利于降低農業生產成本和實現環境友好。
文檔編號C12N15/11GK102533811SQ20101059604
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月15日 優先權日2010年12月15日
發明者劉繼紅, 黃小三 申請人:華中農業大學