專利名稱：利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及基因工程菌株的構(gòu)建技術(shù)，尤其是一種利用基因 工程菌株耦合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化寡糖的方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著食品工業(yè)和生物科技的快速發(fā)展，功能寡糖的開發(fā)已成為國際生物 技術(shù)領(lǐng)域的重要課題，寡糖產(chǎn)業(yè)現(xiàn)已成為一個(gè)應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、化工等行業(yè)的新興 重要產(chǎn)業(yè)。人乳低聚糖不僅具有抗病毒感染、增強(qiáng)免疫力調(diào)節(jié)、減少炎癥等生理作用，而且 對(duì)于癌癥和慢性復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎等有一定的預(yù)防作用。它作為一類特殊結(jié)構(gòu)的糖類物質(zhì)，可 作為上皮細(xì)胞的可溶性受體類似物，參與母乳喂養(yǎng)嬰兒的非免疫防御體系的增強(qiáng)。人乳寡糖其含量在乳糖、脂類之后，成為人乳中第三大物質(zhì)，在初乳中寡糖含量為 20-27g/L，在成熟乳中也高達(dá)12-14g/L，而在其它動(dòng)物乳汁中含量很低，牛初乳中寡糖僅含 0. 7-1. 2g/L，低于人初乳20倍之多，除含量豐富外，人乳寡糖結(jié)構(gòu)也非常復(fù)雜，根據(jù)質(zhì)譜分 析，估計(jì)人乳中含有900多種不同結(jié)構(gòu)的寡糖，目前已至少分離出130多種結(jié)構(gòu)不同的寡 糖，而牛乳中僅含有18種寡糖。人乳寡糖大多數(shù)呈中性，以巖藻糖基化寡糖為主，其中α 1， 2-巖藻糖基化寡糖在被檢人乳中占總寡糖的比例平均為73%，巖藻糖殘基為1-15個(gè)不等。 這種在人乳中含量最為豐富的巖藻糖基化寡糖在牛、綿羊、山羊及馬等動(dòng)物的成熟乳汁卻 未曾檢測到，但在其初乳中卻含有較多的中性寡糖。不同哺乳動(dòng)物乳汁之間寡糖結(jié)構(gòu)上的 差異，也可能提示人乳寡糖具有獨(dú)特的生理功能。另外，人乳低聚糖及其類似物由于功能獨(dú) 特，安全、有效，不產(chǎn)生抗藥性，并且還能抵御對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的變異病原菌，以人乳寡糖 及類似物為原料制備抗粘附藥物成為當(dāng)前藥物開發(fā)的又一大熱點(diǎn)，其在預(yù)防和治療細(xì)菌性 疾病領(lǐng)域及嬰兒營養(yǎng)保健方面必將發(fā)揮巨大的作用。目前關(guān)于人乳寡糖的功能與制備研究在我國仍未得到有效開展。我國對(duì)功能寡糖 類物質(zhì)的開發(fā)主要集中在天然植物和微生物多糖，采用酸、堿、酶、氧化等化學(xué)方法進(jìn)行降 解制備低分子量的寡糖，如殼寡糖、果寡糖等。通過化學(xué)合成法獲得人乳低聚糖，由于合成 路線的復(fù)雜以及糖苷供體的昂貴，大多數(shù)工藝仍無法達(dá)到規(guī)模生產(chǎn)，成為化學(xué)法合成寡糖 不易逾越的障礙。隨著越來越多的糖苷酶及其基因的不斷解析和微生物代謝調(diào)控路線的不 斷闡明，以及基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，應(yīng)用合成低聚糖生產(chǎn)過程所需的酶來大量合成低 聚糖已成為可能。人乳寡糖以巖藻糖基化寡糖為主，甘露糖就是巖藻糖基化寡糖合成的一個(gè)重要的 前提物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用基因工程菌株發(fā)酵合成人乳糖基化寡糖的構(gòu)建方 法，應(yīng)用Ε. coli表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)以甘露糖為底物合成巖藻糖基化寡糖的相關(guān)酶進(jìn)行高效表達(dá)，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建含有相關(guān)酶基因的重組大腸桿菌，從而進(jìn)行發(fā)酵合成巖藻糖基 化寡糖的方法。通過本方法所獲得的基因工程菌株使得酶基因的拷貝數(shù)增加，酶的表達(dá)量 明顯提高，從而能作用于底物甘露糖合成巖藻糖基化寡糖。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化寡糖的方法，包括以下幾個(gè) 步驟(1)基因擴(kuò)增根據(jù)大腸桿菌E. coli K12中己糖激酶glk、磷酸甘露糖變位酶 manB、甘露糖-1磷酸鳥苷轉(zhuǎn)移酶manC、⑶P-甘露糖4，6-脫水酶gmd、⑶P-4-酮-6-脫氧甘 露糖3，5-變旋酶/4-還原酶wcaG和幽門螺旋桿菌Helicobacter pylori HPAGl中α -1, 2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因fuct的序列設(shè)計(jì)引物，以大腸桿菌E. coli-K12和HPAGl染色體DNA 為模板分別對(duì)上述目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的相應(yīng)的目的基因；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建用酶切連接的方法將擴(kuò)增得到的相應(yīng)的目的基因與載體 pET-22b相連，得到攜帶目的基因的重組表達(dá)載體pET-glk-manB-manC，pET-gmd-wcaG和 pET-fuct，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證；(3)基因工程菌株的構(gòu)建將上述驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體pET-glk-manB-manC， pET-gmd-wcaG和pET-fuct分別轉(zhuǎn)化宿主菌株BL21 (DE3)中，得到含有重組質(zhì)粒的基因工 程菌株 BL21 (DE3) /pET-glk-manB-manC、B2 :BL21 (DE3) /pET-gmd-wcaG 和 B3 :BL21 (DE3) / pET-fuct ；(4)耦合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化糖將步( 得到的三株基因工程菌株于培養(yǎng) 基中混合發(fā)酵，以甘露糖為合成底物，合成人乳巖藻糖基化寡糖。而且，步驟的發(fā)酵過程添加Nymeen S-215。而且，所述步驟⑷中發(fā)酵培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)，并添加其它成分為g/L =Bl濕重30 ； B2 濕重 25 ；B3 濕重 25 ；甘露糖 30 ；植酸 5 ；KH2PO4 25 ；MgSO4. 7H20 5 ；果糖 25 ；NymeenS-215 4。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明以大腸桿菌為基礎(chǔ)，運(yùn)用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建Bi，B2, B3三種基因工 程菌株，實(shí)現(xiàn)代謝途徑中酶的高效表達(dá)，并應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)，將基因工程株作用于甘露糖，進(jìn) 行耦合發(fā)酵，繼而合成人乳巖藻糖基化寡糖，為大量低價(jià)工業(yè)化生產(chǎn)人乳低聚糖的提供一 條可行途徑，這種生產(chǎn)方法降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，不僅具有經(jīng)濟(jì)效益，還具有 一定的社會(huì)效益。2、本發(fā)明利用GTP產(chǎn)生菌C. ammoniagenes為整個(gè)催化反應(yīng)提供能量，聯(lián)合發(fā)酵生 產(chǎn)GDP-巖藻糖，進(jìn)而達(dá)到人乳巖藻糖基化寡糖的大量合成，這不僅使得批量生產(chǎn)人乳寡糖 成為可能，同時(shí)也為天然寡糖藥物的生產(chǎn)提供原料，具有較強(qiáng)的基礎(chǔ)理論研究價(jià)值和社會(huì) 經(jīng)濟(jì)效益，市場開發(fā)前景廣闊。
圖1為本發(fā)明的擴(kuò)增電泳圖，其中a :1、己糖激酶glk ；2、磷酸甘露糖變位酶基因manB ；3、甘露糖磷酸鳥苷酰轉(zhuǎn) 移酶基因manC ；
b :1-3為⑶P-4-酮-6-脫氧甘露糖3，5_變旋酶/4-還原酶(wcaG)基因；條帶4 為Ikb DNAmarker ；條帶5-7為GDP-甘露糖4,6-脫水酶(gmd)基因；c :l、lkb DNA marker ；2、α-1，2 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因(fuct)PCR 產(chǎn)物；圖 2 為本發(fā)明 pET-glk-manB-manC，pET-gmd-wcaG 和 pET-fuct，的重組表達(dá)質(zhì)粒 的結(jié)構(gòu)圖，其中a 重組質(zhì)粒 pET-glk-manB-manC 的構(gòu)建；b 重組質(zhì)粒pET-gmd-wcaG的構(gòu)建；c 重組質(zhì)粒pET-fuct的構(gòu)建；圖 3 為本發(fā)明的 pET-glk-manB-manC，pET-gmd-wcaG和 pET-fuct 的蛋白表達(dá)電泳 圖；其中a :M 為蛋白 marker, 1-2 為 pET-glk-manB_manC/BL21 ；b :M 為蛋白 marker, 1-2 為 pET-gmd_wcaG/BL21 ；c :M 為蛋白 marker，1 為 pET_22b (+)/BL21 ；2 為 pET_fuct/BL21 ；圖4為本發(fā)明利用基因工程菌株混合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化寡糖體系的構(gòu)建 流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所涉及的利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化寡糖體系的構(gòu) 建方法，是利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21/pET-22b，對(duì)催化以甘露糖為底物合成人乳巖藻糖 基化寡糖的相關(guān)酶的基因如己糖激酶基因、磷酸甘露糖變位酶基因、甘露糖-1-磷酸鳥苷 酰轉(zhuǎn)移酶基因、⑶P-甘露糖4，6-脫水酶、⑶P-4-酮-6-脫氧甘露糖3，5-變旋酶/4-還原 酶和α -1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因(glk、manB, manC、gmd、wcaG, fuct)進(jìn)行高效表達(dá)，構(gòu)建 分別包含不同目的基因的三個(gè)重組大腸菌株，通過代謝調(diào)控手段來進(jìn)行人乳巖藻糖基化寡 糖體的高效合成。本發(fā)明所用的酶來源于E. coli K12和HeliccAacter pylori HPAGl，本 發(fā)明中重組載體的的宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。所構(gòu)建的重組表達(dá)載體不僅包括編 碼酶的DNA序列，還具有表達(dá)該基因所需的控制元件。構(gòu)建方法的步驟是一、目的基因的擴(kuò)增(1)提取大腸桿菌(E. coli K12)的基因組DNA，設(shè)計(jì)如下引物Pglkl :5，-GGAATTCTCTAGAATGACAAAGTATGCATTAGTCGGT-3’ 酶切位點(diǎn)為 XbaI ；Pglk2 :5，-CGCGCCCGGGCTTACAGAATGTGACCTAAGGTCTG-3’ 酶切位點(diǎn)為 SrfI.PmanBl :5，-GGAATTCGGTACCATGAAAAAATTAACCTGCTTT-3’ 酶切位點(diǎn)為 KpnI ；PmanB2 :5，-CCCAGTACTTTACTCGTTCAGCAACGTC-3‘酶切位點(diǎn)為 kal.PmanCl :5，-CATGAGTACTATATGACAAAGTATGCATTAGTCGGT-3> 酶切位點(diǎn)為 ScaI ；PmanC2 :5，-CCCCATGGTTACAGAATGTGACCTAAGGTCTG-3’ 酶切位點(diǎn)為 NcoI.Pgmdl :5，-CATGGCCCGGGCATATGTCAAAAGTCTCTCATC-3’ 酶切位點(diǎn)為 SrfI ；Pgmd2 :5，-CCCGGTACCTTATGACTCCAGCGCGATC-3’ 酶切位點(diǎn)為 KpnI.
PwcaGl :5，-CATGGAGCTCGCATGAGTAAACAACGAGTTTTTATTG-3’ 酶切位點(diǎn)為 SacI ；PwcaG2 :5，-CCCCTCGAGTTACCCCCGAAAGCGGT-3’ 酶切位點(diǎn)為 XhoI.(2)提取幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori HPAG1)基因組DNA，設(shè)計(jì)如下引 物Pfuctl :5，-CATGCCATGGATCCGATGGCTTTTAAAAGTGTGCAA-3'酶切位點(diǎn)為 BamHI ；Pfuct2 :5， -CCCAAGCTTGAGCTCTTAAGCGTTATACTTTTGGGATTT-3’ 酶切位點(diǎn)為 HindIII0以大腸桿菌E. coli-K12和HPAGl染色體DNA為模板分別對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，按以下次序，在滅菌EP管內(nèi)混合，
權(quán)利要求
1.一種利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化寡糖的方法，其特征在于包 括以下幾個(gè)步驟(1)基因擴(kuò)增根據(jù)大腸桿菌E.coli K12中己糖激酶glk、磷酸甘露糖變位酶manB、甘 露糖-1磷酸鳥苷轉(zhuǎn)移酶manC、⑶P-甘露糖4，6-脫水酶gmd、⑶P-4-酮-6-脫氧甘露糖3， 5-變旋酶/4-還原酶wcaG和幽門螺旋桿菌Helicobacter pylori HPAGl中α-1，2巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶基因fuct的序列設(shè)計(jì)引物，以大腸桿菌E. coli-K12和HPAGl染色體DNA為模板 分別對(duì)上述目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的相應(yīng)的目的基因；(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建用酶切連接的方法將擴(kuò)增得到的相應(yīng)的目的基因與載體 pET-22b相連，得到攜帶目的基因的重組表達(dá)載體pET-glk-manB-manC，pET-gmd-wcaG和 pET-fuct，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證；(3)基因工程菌株的構(gòu)建將上述驗(yàn)證正確的重組表達(dá)載體pET-glk-manB-manC， pET-gmd-wcaG和pET-fuct分別轉(zhuǎn)化到宿主菌株BL21 (DE3)中，得到含有重組質(zhì)粒的基因 工程菌株 BL21 (DE3) /pET-glk-manB-manC、B2 :BL21 (DE3) /pET-gmd-wcaG 和 B3 :BL21 (DE3) / pET-fuct ；(4)耦合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化糖將步驟( 得到的三株基因工程菌株于培養(yǎng)基 中混合發(fā)酵，以甘露糖為合成底物，合成人乳巖藻糖基化寡糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化寡糖的方 法，其特征在于步驟(4)的發(fā)酵過程添加Nymeen S-215。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化寡糖的方 法，其特征在于所述步驟(4)中發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為LB培養(yǎng)基，并添加其它成分為 g/L =Bl 濕重 30 ；B2 濕重 25 ；B3 濕重 25 ；甘露糖 30 ；植酸 5 ；KH2PO4 25 ；MgSO4. 7H20 5 ；果糖 25 ；Nymeen S-215 全文摘要
本發(fā)明涉及了一種利用基因工程菌株耦合發(fā)酵合成人乳巖藻糖基化寡糖的方法，主要是利用基因工程技術(shù)構(gòu)建代謝工程菌株實(shí)現(xiàn)代謝途徑中關(guān)鍵酶的高效表達(dá)，進(jìn)而在體外實(shí)現(xiàn)人乳巖藻糖基化寡糖的生物合成，此方法構(gòu)建的工程菌株能增加這種酶基因的拷貝數(shù)，提高酶的表達(dá)量從而能高效合成人乳巖藻糖基化寡糖，為工業(yè)化低價(jià)合成人乳低聚糖提供一條可行途徑，不僅具有較強(qiáng)的基礎(chǔ)理論研究價(jià)值，而且具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，市場開發(fā)前景廣闊。
文檔編號(hào)C12P19/00GK102120999SQ20101059401
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者劉逸寒, 李玉, 王春霞, 王洪彬, 賈紅紅, 路福平 申請人:天津科技大學(xué)