專利名稱：一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，尤其是涉及一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌 素的方法。
背景技術(shù)：
乳酸片球菌素(Pediocin)是由屬于片球菌屬的乳酸片球菌 (Pediococcusacidilactici)產(chǎn)生的一種抗菌短肽物質(zhì)。研究表明乳酸片球菌素為一種初 級代謝產(chǎn)物，是具有較強抗菌活性的細菌素，與已經(jīng)大規(guī)模生產(chǎn)、應(yīng)用的乳酸鏈球菌素的物 理化學(xué)性質(zhì)和用途很類似，耐高低溫、耐酸、在人體中可降解，因此安全無毒，且方便使用。 Pediocin能抑制包括白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、沙門氏菌、綠膿桿 菌等在內(nèi)的大量致病菌，因此可以用于食品保藏，也可以用于人類疾病治療上，具有極高的 使用價值和應(yīng)用前景。目前主要采用間歇發(fā)酵和少量的流加方法實現(xiàn)Pediocin的高效表達，發(fā)酵過程 中PH值是影響Pediocin表達的關(guān)鍵因素，下降速率和Pediocin的產(chǎn)生速率成一定的正比 關(guān)系。Poolman (Poolman et al, J Bacteriol.，1988)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值處于堿性(大于 6. 5)時，乳酸乳球菌會大量積累谷氨酸(Glu)，而此時菌體利用谷氨酸的能力下降，因此抑 制菌體的生長；Biswas (Biswas et al,Appl. Environ. Microbiol.，1991)推測低的 pH值在 Pediocin前體轉(zhuǎn)化成活性形式的過程中起關(guān)鍵作用；Schneider (Schneider et al, Food Control, 2006)發(fā)現(xiàn)pH值的降低能夠增加Pediocin在水中的溶解度；Guerra(Guerra et al，Int. J Food Microbiol.，2001)建立了堿化周期培養(yǎng)(re-alkalized cultivation)模 型，發(fā)現(xiàn)Pediocin是一種pH依賴型的初級代謝物。但目前報道的發(fā)酵策略主要采用間歇 發(fā)酵方式，而最近幾年出現(xiàn)的少數(shù)流加發(fā)酵方式，其策略比較單一，主要采用單一的降低PH 策略(Guerra et al，Lett. Appl. Microbiol.，2003)和單一的pH循環(huán)策略(Guerra et al, Process Biochem. , 2005)等，僅有的少數(shù)文獻(如 Guerra et al, Enzyme and Microbial Technology, 2007)所采用的初始培養(yǎng)基一般是稀釋過的乳清和酵母粉的混合物，流加培養(yǎng) 基為乳糖(或葡萄糖)和酵母粉混合物，最高效價為712AU/ml，其最大的缺陷是將殘?zhí)?發(fā) 酵液中殘留葡萄糖)濃度控制的很低(基本為0)，使得菌體得不到大量增殖，而片菌素的產(chǎn) 量也無法得到顯著提高，發(fā)酵周期過長(一般超過250小時)，操作過程復(fù)雜，因此很難實現(xiàn) 工業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種發(fā)酵周期短、操 作簡單、效價高的累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將乳酸片球菌素(Pediococcus acidilactici)接種在改良后的MRS液體培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)他，然后按接種量為將乳酸片球菌素接種到發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵 溫度為30°C，發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基為改良后的MRS液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)16 30h得到效價 為1. 8萬 2. 4萬AU/ml的乳酸片球菌素。所述的改良后的MRS液體培養(yǎng)基包括以下組分葡萄糖15 20g/L，蛋白胨10 15g/L,牛肉膏 10 15g/L，酵母膏 4 6g/L，(NH4) 2HC6H5071 2g/L，吐溫 800. 5 lg/L， H3COONa · 3H20 4 6g/L, K2HPO4 · 3H20 1 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 55 0. 6g/L, MnSO4 · H2O 0. 2 0. 3g/L，溶劑為蒸餾水，利用3mol/L鹽酸溶液和3mol/L NaOH溶液調(diào)整至6. 5。所述的發(fā)酵培養(yǎng)的初期采用間歇發(fā)酵，中后期采用反饋流加發(fā)酵，向發(fā)酵罐中補 充培養(yǎng)基，使發(fā)酵罐中葡萄糖濃度維持在5 10g/L。所述的發(fā)酵培養(yǎng)的初期為MRS液體培養(yǎng)基中葡萄糖濃度從初始濃度下降至5 10g/L的時間段，發(fā)酵培養(yǎng)的中后期為向發(fā)酵罐中補充培養(yǎng)基至發(fā)酵完成的時間段。所述的補充培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為300 400g/L，蛋白胨濃度為40 100g/L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)發(fā)酵周期短，從接種算起30小時內(nèi)發(fā)酵結(jié)束；(2)操作簡單，從發(fā)酵第二階段開始補料，恒速補入補料液即可控制殘?zhí)菨舛仍?5 10g/L ；(3) pH下降幅度較大，有利于快速產(chǎn)生乳酸片球菌素；(4)乳酸片球菌素效價高，最高可達2. 4萬AU/ml，高于目前國際報道的最高值，為 實現(xiàn)乳酸片球菌素的商業(yè)化生產(chǎn)提供了 一種有效方法。
圖1為實施例1中乳酸片球菌素在發(fā)酵罐中的發(fā)酵曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1取-20°C冰箱保存的乳酸片球菌200 μ 1，接種到改良的MRS搖瓶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基 組成為(g/L)葡萄糖15. 0，蛋白胨10. 0，牛肉膏10. 0，酵母膏5.0，(NH4) 2HC6H5072. 0，吐溫 801. 0，H3COONa · 3H20 5. 0，K2HPO4 · 3H20 2. 0，MgSO4 · 7H20 0. 58，MnSO4 · H2O 0. 25，蒸餾水 1000，pH值用3mol/L鹽酸溶液和3mol/L NaOH溶液調(diào)整至6. 5。將上述培養(yǎng)好的片球菌LH31接種在3. 7L發(fā)酵罐中，以培養(yǎng)基的體積計，接種量為 ^t %，發(fā)酵罐初始培養(yǎng)基為改良的MRS液體培養(yǎng)基，pH值為6. 5 ；當(dāng)發(fā)酵液pH值下降至4. 2時，開始補料，補料培養(yǎng)基組成為葡萄糖350g/L，蛋白胨 100g/L，補料采用恒速補料方式，使發(fā)酵罐中的殘留葡萄糖濃度始終維持在5-10g/L之間。當(dāng)發(fā)酵液pH值下降至4. 5時，用3mol/L NaOH溶液將發(fā)酵液pH值調(diào)整至6. 5。繼 續(xù)采用恒速補料方式，使發(fā)酵罐中的殘留葡萄糖濃度始終維持在5-10g/L之間。當(dāng)發(fā)酵液pH值下降至4. 5時，重復(fù)上述步驟?？刂蒲a料的流加速度，使發(fā)酵罐中 的殘留葡萄糖濃度始終維持在10g/L左右，pH值重復(fù)調(diào)整4次，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中，其他的發(fā)酵參數(shù)為溫度30°C、溶氧20%以上，得到的Pediocin效價最高達到2. 4萬AU/ml，乳酸片球菌素在發(fā)酵罐中的發(fā)酵曲線如圖1所示。實施例2取-20°C冰箱保存的乳酸片球菌200 μ 1，接種到改良的MRS搖瓶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基 組成為(g/L)葡萄糖20. 0，蛋白胨10. 0，牛肉膏10. 0，酵母膏5.0，(NH4) 2HC6H5072. 0，吐溫 801. 0，H3COONa · 3H20 5. 0，K2HPO4 · 3H20 2. 0，MgSO4 · 7H20 0. 58，MnSO4 · H2O 0. 25，蒸餾水 1000，pH值用3mol/L鹽酸溶液和3mol/L NaOH溶液調(diào)整至6. 5。將上述培養(yǎng)好的片球菌LH31接種在3. 7L發(fā)酵罐中，以培養(yǎng)基的體積計，接種量為 4%，發(fā)酵罐初始培養(yǎng)基為改良的MRS液體培養(yǎng)基，pH值為6. 5 ；當(dāng)發(fā)酵液pH值下降至4. 5時，開始補料，補料培養(yǎng)基組成為葡萄糖300g/L，蛋白胨 40g/L。補料采用恒速補料方式，使發(fā)酵罐中的殘留葡萄糖濃度始終維持在8g/L左右。當(dāng)發(fā)酵液pH值下降至4. 5時，用3mol/L NaOH溶液將發(fā)酵液pH值調(diào)整至6. 5。繼 續(xù)采用恒速補料方式，使發(fā)酵罐中的殘留葡萄糖濃度始終維持在8g/L左右。當(dāng)發(fā)酵液pH值下降至4. 5時，重復(fù)上述步驟?？刂蒲a料的流加速度，使發(fā)酵罐中 的殘留葡萄糖濃度始終維持在10g/L左右。pH值重復(fù)調(diào)整5次，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中，其他的發(fā)酵參數(shù)為溫度30°C、溶氧20%以上，得到的Pediocin效價 最高達到2. 2萬AU/ml。實施例3取-20°C冰箱保存的乳酸片球菌200 μ 1，接種到改良的MRS搖瓶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基 組成為(g/L)葡萄糖18. 0，蛋白胨10. 0，牛肉膏10. 0，酵母膏5.0，(NH4) 2HC6H5072. 0，吐溫 801. 0，H3COONa · 3H20 5. 0，K2HPO4 · 3H20 2. 0，MgSO4 · 7H20 0. 58，MnSO4 · H2O 0. 25，蒸餾水 1000，pH值用3mol/L鹽酸溶液和3mol/L NaOH溶液調(diào)整至6. 5。將上述培養(yǎng)好的片球菌LH31接種在3. 7L發(fā)酵罐中，以培養(yǎng)基的體積計，接種量為 4%，發(fā)酵罐初始培養(yǎng)基為改良的MRS液體培養(yǎng)基，pH值為6. 5 ；當(dāng)發(fā)酵液pH值下降至4. 1時，開始補料，補料培養(yǎng)基組成為葡萄糖400g/L，蛋白胨 80g/L。補料采用恒速補料方式，使發(fā)酵罐中的殘留葡萄糖濃度始終維持在5g/L左右。當(dāng)發(fā)酵液pH值下降至4. 5時，用3mol/L NaOH溶液將發(fā)酵液pH值調(diào)整至6. 5。繼 續(xù)采用恒速補料方式，使發(fā)酵罐中的殘留葡萄糖濃度始終維持在5g/L左右。當(dāng)發(fā)酵液pH值下降至4. 5時，重復(fù)上述步驟?？刂蒲a料的流加速度，使發(fā)酵罐中 的殘留葡萄糖濃度始終維持在5g/L左右。pH值重復(fù)調(diào)整4次，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程中，其他的發(fā)酵參數(shù)為溫度30°C、溶氧20%以上，得到的Pediocin效價 最高達到1. 8萬AU/ml。實施例4一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，該方法包括以下步驟將乳酸片球菌素(Pediococcus acidilactici)接種在改良后的MRS液體培養(yǎng) 基中，30°C條件下培養(yǎng)他，改良后的MRS液體培養(yǎng)基包括以下組分葡萄糖15g/L，蛋白胨 10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母膏 4g/L，(NH4)2HC6H5O7Ig/L，吐溫 80 為 0. 5g/L，H3COONa ·3Η20 4g/ L，K2HPO4 · 3H20 lg/L，MgSO4 · 7H20 0. 55g/L，MnSO4 · H2OO. 2g/L，溶劑為蒸餾水，利用 3mol/ L鹽酸溶液和3mol/LNa0H溶液調(diào)整至6. 5。然后按接種量為^t %將乳酸片球菌素接種到 發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基也為改良后的MRS液體培養(yǎng)基，控制發(fā)酵溫度為30°C，初期采用間歇發(fā)酵，當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度降至5g/L時，采用反饋流加發(fā)酵，向發(fā)酵罐中補充 培養(yǎng)基，使發(fā)酵罐中葡萄糖濃度維持在5g/L，補充的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為300g/L，蛋白 胨濃度為40g/L，乳酸片球菌素在發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)16h，得到效價為1.8萬AU/ml的乳酸 片球菌素。實施例5一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，該方法包括以下步驟將乳酸片球菌素(Pediococcus acidilactici)接種在改良后的MRS液體培養(yǎng) 基中，30°C條件下培養(yǎng)他，改良后的MRS液體培養(yǎng)基包括以下組分葡萄糖20g/L，蛋白胨 15g/L，牛肉膏 15g/L，酵母膏 6g/L，(NH4) 2HC6H5072g/L，吐溫 80 為 lg/L，H3COONa · 3H206g/L， K2HPO4 · 3H202g/L, MgSO4 · 7Η200· 6g/L，MnSO4 · H2O 0. 3g/L，其余為蒸餾水，利用 3mol/L 鹽酸 溶液和3mol/L NaOH溶液調(diào)整至6. 5。然后按接種量為%將乳酸片球菌素接種到發(fā)酵 罐中，發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基也為改良后的MRS液體培養(yǎng)基，控制發(fā)酵溫度為30°C，初期采用間 歇發(fā)酵，當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度降至10g/L時，采用反饋流加發(fā)酵，向發(fā)酵罐中補充培養(yǎng) 基，使發(fā)酵罐中葡萄糖濃度維持在10g/L，補充的培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為400g/L，蛋白胨濃 度為100g/L，乳酸片球菌素在發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)30h，得到效價為2. 1萬AU/ml的乳酸片球 菌素。
權(quán)利要求
1.一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟將乳酸片球菌素(Pediococcus acidilactici)接種在改良后的MRS液體培養(yǎng)基中， 30°C條件下培養(yǎng)他，然后按接種量為將乳酸片球菌素接種到發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫 度為30°C，發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基為改良后的MRS液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)16 30h得到效價為 1. 8萬 2. 4萬AU/ml的乳酸片球菌素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述的改 良后的MRS液體培養(yǎng)基包括以下組分葡萄糖15 20g/L，蛋白胨10 15g/L，牛肉膏10 15g/L,酵母膏 4 6g/L，(NH4)2HC6H5O7I 2g/L，吐溫 800. 5 lg/L，H3COONa · 3H20 4 6g/L, K2HPO4 · 3H20 1 2g/L, MgSO4 · 7H20 0. 55 0. 6g/L, MnSO4 · H2O 0· 2 0. 3g/L，溶 劑為蒸餾水，利用3mol/L鹽酸溶液和3mol/L NaOH溶液調(diào)整至6. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述的發(fā) 酵培養(yǎng)的初期采用間歇發(fā)酵，中后期采用反饋流加發(fā)酵，向發(fā)酵罐中補充培養(yǎng)基，使發(fā)酵罐 中葡萄糖濃度維持在5 10g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述的發(fā) 酵培養(yǎng)的初期為MRS液體培養(yǎng)基中葡萄糖濃度從初始濃度下降至5 10g/L的時間段，發(fā) 酵培養(yǎng)的中后期為向發(fā)酵罐中補充培養(yǎng)基至發(fā)酵完成的時間段。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，其特征在于，所述的補 充培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為300 400g/L，蛋白胨濃度為40 100g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種累積生產(chǎn)乳酸片球菌素的方法，將乳酸片球菌素(Pediococcusacidilactici)接種在改良后的MRS液體培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)8h，然后按接種量為4wt％將乳酸片球菌素接種到發(fā)酵罐中，在發(fā)酵的第一階段采用間歇發(fā)酵，待發(fā)酵液中的殘?zhí)?殘留葡萄糖)濃度低于5～10g/L時開始進行第二階段發(fā)酵，發(fā)酵16～30h得到效價1.8萬～2.4萬AU/ml的乳酸片球菌素。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明發(fā)酵周期短，操作簡單，有利于快速產(chǎn)生乳酸片球菌素，所得產(chǎn)品效價最高可達2.4萬AU/ml。
文檔編號C12P21/02GK102127578SQ201010593530
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者孫愛友, 張星, 徐瑞, 秦魯敏, 董玉國, 魏東芝 申請人:華東理工大學(xué)