專利名稱：一種復合蛋白酶及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及微生物學和生物化學領域，更具體的，本發明涉及一種新穎的弗氏鏈霉菌菌株及其所產復合蛋白酶的性質和用途。
背景技術：
角蛋白是一種雙鍵結構十分牢固蛋白質，其化學成分與一般蛋白質一樣，其特點是分子形狀似纖維，由多個肽鏈平行排列，并由氫鍵和二硫鍵作為交聯鍵將它們集聚成為不溶性的動物蛋白質。角蛋白組分可分為α型和β型。角蛋白是角蛋白的優勢形式， α-角蛋白存在于毛發、羊毛、羽毛、羽莖、指甲、蹄、角等結構蛋白中，具有很好的伸縮性能。 β-角蛋白富含甘氨酸，丙氨酸、絲氨酸和一些由酪氨酸、脯氨酸、組氨酸組成的大側鏈，在自然界中以天然存在的蠶絲和蜘蛛絲中的絲心蛋白為代表。角蛋白以各種動物的毛發、羽毛、蹄、角等作為主要形式大量存在于自然界中，是一種抗性很強的硬蛋白，不溶于水、稀酸或稀堿溶液，也不易被大多數蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)所水解。角蛋白是禽類加工中產生的廢棄物之一羽毛中的主要成分，其粗蛋白含量可達89-97%，而其中約有85-90%的蛋白質為角蛋白，并且富含多種動物所需要的必需氨基酸另外，還含有常量元素、微量元素以及一些未知的生長因子。因此羽毛蛋白是一種非常有應用前景的飼料蛋白源，但由于角蛋白的特殊結構，在動物體內很難被直接消化利用。以往用高溫高壓蒸煮或酸、堿水解的方法雖然可以改善蛋白質的消化率，但存在能耗大，產品的營養質量易被破壞，三廢不易處理，環境污染嚴重等問題。角蛋白酶是一類能夠高效水解天然角蛋白的酶類，可顯著提高角蛋白的消化率，并且有些角蛋白酶還同時對除角蛋白外的多種蛋白質有水解作用。在飼料工業中，角蛋白酶可將羽毛、豬毛等廢棄物轉化為高營養的飼料蛋白。利用角蛋白酶可有效的解決這一問題，它的優點在于更為經濟，提高廢棄角蛋白的利用率，同時產品營養價值好，而且無污染。我國的羽毛資源及其豐富，年產量數十萬噸，但目前這部分優良的蛋白源未能得到有效利用，既造成了資源的浪費，又污染環境，而我國飼料蛋白資源嚴重匱乏，按照我國飼料工業的發展規劃，到2010年飼料蛋白的缺口將達到800萬噸。因此，羽毛蛋白飼料資源的開發與利用有著及其重要的意義。角蛋白酶的研究工作已有幾十年的歷史，自然界中許多微生物均能分泌角蛋白酶，能特異性的分解角蛋白，使其降解為多肽和氨基酸。自1899年Ward報道了真菌馬爪甲團囊菌(Equina)能分解角蛋白以來，已先后發現30余種微生物具有降解角蛋白能力，包括細菌中的地衣芽孢桿菌(Bacilcus lincheniformis)、嗜熱桿菌 (thermophilic Bacillu)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和嗜熱厭氧菌閃光桿菌(Fervidobacterium pennavorans)，放線菌中的弗氏鏈霉(Streptomyces fradiae)、 密方寵鏈霉菌(Streptomyces pactum)、微白黃鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus)、純白高溫放線菌 CThermo actinomyces candidus)禾口嗜熱禾生鏈霉菌 CThermotolerant Streptomyces graminofacients)及真菌中白勺須發 11菌(Trichophyton mentagrophytes)、串孢屬菌(Catenularia sp)和煙曲霉(spergillus fumigatus)等等。這些微生物對自然界中的羽毛、毛發、蹄足等角蛋白有一定的降解和轉化能力。國內對角蛋白酶的研究還基本停留在產角蛋酶菌的分離、篩選，以及酶學性質的初步研究，但未對這些菌株產生的蛋白酶系進行系統的分析和純化，不能確定這些菌株分解角蛋白的能力是由一種酶實現的，還是由包括角蛋白酶在內的混合蛋白酶完成的；并且這些菌株的產酶水平及其所產蛋白酶的性能都難以到達產業化應用的要求。因此，到目前為止，國內還未有角蛋白酶的商品化生產和實際應用。國外已進行了大量的角蛋白酶分解菌篩選、角蛋白酶的分離提純的工作，分子生物學上研究則主要集中于對地衣形芽孢桿菌的角蛋白酶因研究，不但已測出序列，而且已成功地轉subtilis菌株及E. coli中，得到較好的結果。但由于其所得到的均為單一的角蛋白酶，從而使其應用效果和應用范圍都受到了很大的限制。研究發現，肽與蛋白質相比，具有良好的溶解性、低粘度、抗凝膠形成性，低分子肽不會產生過敏反應等優點。除此之外，還具有眾多的生理活性，如促進發酵、抗氧化、降血壓、降膽固醇、抗疲勞、促進乙醇代謝等活性。而且與氨基酸和蛋白質相比，更易被人體吸收利用。生物活性肽早期主要從動物、植物及昆蟲等生物體內分離提取，但其具有含量少、周期長、成本高等缺點。隨著科學的發展與進步，科學家逐漸注意到在營養蛋白的多肽鏈內部可能普遍存在著功能區，選擇適當的方法水解這些多肽，有可能將其釋放出來，從而制備各種各樣的生物活性肽，為能生產出更好滿足人類保健需要的食品基料提供了新的機遇。蛋白質水解物生產方式多種多樣，包括化學法、生物法與合成法，其中化學法是利用酸堿水解蛋白。但反應條件劇烈，破壞了氨基酸原有構型，產生了有毒物質已處于被淘汰邊緣。與酸水解和堿水解比較，酶法水解蛋白質具有多種優點蛋白質的酶水解是一種不完全、不徹底的水解，其產物主要是肽而不是氨基酸。反應條件溫和，反應時間短，效率高， 不產生消旋作用，也不破壞氨基酸，產品純度高，產物易分離，成本低。而通過基因工程、化學合成的方法生產生物活性肽需要相當大的投入，且其安全性還需要進行研究。因此酶法水解蛋白質制備活性肽是目前生產活性肽的主要方法。反應產物與原料蛋白、相同組成的氨基酸相比具有特殊的理化性能與生理功能，所以肽基蛋白水解物成為蛋白制品的發展方向。生物方法生產肽類制品時，底物的選擇主要是基于蛋白的營養價值、成本、口感、 抗原性、溶解性和功能性，目前較常用的原料包括酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白(大豆分離蛋白、大豆濃縮蛋白及黃豆粉等)、膠原蛋白(魚鱗、豬皮等)、玉米蛋白(DDGS、DDG、玉米淀粉加工后的下腳料等)、大米蛋白(米糟)以及茶蛋白(茶渣)。盡管這些蛋白原料價格相對便宜，但其大部分為工業生產的下腳料及廢棄物，其中的蛋白含量相對較少，且難以被普通的蛋白酶(胃蛋白酶和胰蛋白酶)水解消化，并且蛋白原料中所含的非蛋白組分會影響蛋白的水解、水解產物的風味和質量。為提高產品轉化率、底物原料利用率、改善水解產物的風味和質量(如底物中的糖與蛋白質及多肽的美拉德反應等)，底物的預處理必不可少。 通常要對蛋白原料中的蛋白質進行提純，提高底物的蛋白質純度，盡量的除去其余的雜質。酶是決定底物利用率、產品性能的主要因素，內肽酶可以降低產品中游離氨基酸的相對含量，外肽酶能選擇作用于疏水性氨基酸，去掉或減輕產物中的苦味。為提高底物轉化率，并保證好產品風味與高的產品質量，需要合理的將內肽酶和外肽酶配合使用，但酶的復配使用工藝復雜(對于不同的蛋白底物，需要不同的內肽酶和外肽酶種類，并且還要調整內肽酶和外肽酶的復配比例)，且成本較高。并且在復配過程中，由于不同酶的最適作用條件不同，以及不同酶之間的相互作用，往往會使復配酶解達不到理想的作用效果。因此，本領域還需要提供有效的復合型蛋白水解酶。
發明內容
本發明旨在提供一種有效的復合型蛋白水解酶。在本發明的第一方面，提供了一種弗氏鏈霉菌，所述弗氏鏈霉菌在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 4186。在本發明的第二方面，提供了如上所述的本發明提供的弗氏鏈霉菌菌株和/或其代謝產物的用途，用于制備復合蛋白酶。所述的復合蛋白酶可分解角蛋白、或含有角蛋白的物質，所述的含有角蛋白的物質選自羽毛、獸角、或蹄。在本發明的第三方面，提供了一種用于水解蛋白質的組合物，所述的組合物含有如上所述的本發明提供的弗氏鏈霉菌菌株和/或其代謝產物。較佳地，所述的組合物含有6種蛋白酶，它們的分子量分別為20KDa 士 5KDa、 30KDa士5KDa、35KDa士5KDa、40KDa士5KDa、67KDa士5KDa 和 IOOKDa士5KDa。在本發明的第四方面，提供了一種如上所述的本發明提供的用于水解蛋白質的組合物的制備方法，所述的方法包括步驟(a)在含有如上所述的本發明提供的弗氏鏈霉菌菌株的培養物中分離得到如上所述的本發明提供的用于水解蛋白質的組合物；或(a')在含有如上所述的本發明提供的弗氏鏈霉菌菌株的培養物中將細胞破壁或裂解，在所得到的裂解液中分離得到如上所述的本發明提供的用于水解蛋白質的組合物。在上述制備方法中，所述含有如上所述的本發明提供的弗氏鏈霉菌菌株的培養物中含有角蛋白、大豆分離蛋白、膠原蛋白、和/或谷原蛋白或其水解物；所述的角白包括羽毛、毛發、獸角、和/或蹄。在本發明的第五方面，提供了一種蛋白質的水解方法，所述的方法包括步驟(i)將如上所述的本發明提供的弗氏鏈霉菌菌株和/或其代謝產物和角蛋白和/ 或含有角蛋白的物質在40°C至90°C、pH4至11下進行混合；或(i')將如上所述的本發明提供的用于水解蛋白質的組合物和角蛋白和/或含有角蛋白的物質在40°C至90°C、pH4至11下進行混合；所述的含有角蛋白的物質選自羽毛、毛發、獸角、或蹄。在另一優選例中，所述混合在厭氧條件下進行。本發明提供的水解方法中，在混合前將所述含有角蛋白的物質在小于等于120°C 或/和pH彡10的條件下進行預處理。本發明提供的水解方法中，，在混合中以所加的角蛋白和/或含有角蛋白的物質在5-6小時后至少溶解60%的酶加量。據此，本發明提供了有效的復合型蛋白水解酶。
圖1是本發明菌株的菌體及孢子染色圖。圖2是本發明菌株的平板菌落圖。圖3是本發明菌株的菌體生長曲線。圖4是本發明菌株發酵過程中角蛋白酶活力增長曲線。圖5是本發明菌株發酵過程中發酵液上清的SDS-PAGE圖；其中M為分子量標記(Molecular Mark)，1為M小時發酵液上清，2為32小時發酵液上清，3為36小時發酵液上清，4為40小時發酵液上清，5為44小時發酵液上清，6為48小時發酵液上清，7為52小時發酵液上清，8為56小時發酵液上清，9為60小時發酵液上清， 10為64小時發酵液上清。圖6是本發明菌株產生的復合蛋白酶對羽毛的分解實驗圖；其中A是酶解前，B是酶解3小時，C是酶解6小時，D是酶解9小時。圖7顯示了本發明菌株分泌的復合蛋白酶對角蛋白、膠原蛋白、酪蛋白和大豆分離蛋白底物的最適反應PH ；其中A是對角蛋白底物的，B是對膠原蛋白底物的，C是對酪蛋白底物的，D是對大豆分離蛋白底物的。圖8顯示了本發明菌株分泌的復合蛋白酶對角蛋白、膠原蛋白、酪蛋白和大豆分離蛋白底物的PH穩定性；其中A是對角蛋白底物的，B是對膠原蛋白底物的，C是對酪蛋白底物的，D是對大豆分離蛋白底物的。圖9顯示了本發明菌株分泌的復合蛋白酶對角蛋白、膠原蛋白、酪蛋白和大豆分離蛋白底物的最適反應溫度；其中A是對角蛋白底物的，B是對膠原蛋白底物的，C是對酪蛋白底物的，D是對大豆分離蛋白底物的。圖10顯示了本發明菌株分泌的復合蛋白酶對角蛋白、膠原蛋白、酪蛋白和大豆分離蛋白底物的熱穩定性；其中A是對角蛋白底物的，B是對膠原蛋白底物的，C是對酪蛋白底物的，D是對大豆分離蛋白底物的。圖11顯示了硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鈉和硫酸鉀對本發明菌株分泌的復合蛋白酶活力的影響；其中A是硫酸鎂的，B是氯化鈣的，C是硫酸鈉的，D是硫酸鉀的。圖12顯示了硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鈉和硫酸鉀對復合蛋白酶活力的影響；其中A是硫酸鈉的，B是硫酸鉀的，C是氯化鈣的，D是硫酸鎂的。圖13是本發明菌株分泌的復合蛋白酶分離純化后所得主要組分的SDS-PAGE圖； 其中1為分子量標記(Molecular Mark)，2為純化樣品MQ5，3為純化樣品MQ2，4為純化樣品MQl，5為純化樣品MQ3，6為純化樣品MQ4，7為純化樣品MQ6。圖14是羽毛角蛋白酶解液凝膠色譜圖(Superdex Peptide 10/300GL)。圖15是羽毛角蛋白酶解液質譜圖。圖16是膠原蛋白酶解液凝膠色譜圖(Superdex 75 10/300GL)。圖17是大豆分離蛋白酶解液凝膠色譜圖(Superdex Peptide 10/300GL)。圖18是大豆分離蛋白酶解液質譜圖。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，找到了一種能夠分泌復合蛋白酶的弗氏鏈霉菌菌株(保藏號為CGMCC No. 4186)，發明人又稱其為Sti^ptomyces fradiae FB201或 FB201。多種試驗表明，本發明提供的弗氏鏈霉菌菌株具有強的蛋白水解能力，能在比較短的時間內分解天然產物中的多種硬蛋白，如角蛋白、膠原蛋白、大豆分離蛋白、谷原蛋白及茶蛋白等，并且該菌種具有高的蛋白酶組合物表達水平。因而，發明人通過該種微生物還分泌得到了一種酶組合物——復合蛋白酶，該酶組合物同樣具有強的蛋白水解能力，有很好的PH穩定性和熱穩定性，有高的比活力，并且同時具有外肽酶和內肽酶活性。基于此完成了本發明。如本文所用，術語“本發明的弗氏鏈霉菌菌株”、“本發明提供的弗氏鏈霉菌菌株”、 “復合蛋白酶的產生菌Mi^ptomyces fradiae FB201 ”、或“FB201 ”可互換使用，都是指分類命名為弗氏鏈霉菌(Sti^ptomyces fradiae)的菌種，該菌株屬于鏈霉菌屬，保藏于位于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2010年9月17日，保藏號為 CGMCC No. 4186。如本文所用，術語“本發明的酶組合物”、或“復合蛋白酶，，可互換使用，都是指經 FB201分泌得到的具有酶解蛋白質作用的多種酶的組合。本發明所述的弗氏鏈霉菌菌株FB201是通過以下方法獲得(1)菌株的分離與篩選從養雞廠周圍富含羽毛的土壤中采樣，以羽毛粉瓊脂平板進行富集篩選，即先用無菌水將土壤樣品制成菌懸液，然后再以不同的稀釋度涂平板， 30°C培養3天；挑選有明顯透明圈的單菌落，用羽毛粉瓊脂斜面劃線分離純化3-5次，純化后的菌株用改良后的高氏1號培養基進行擴培，分別取擴培后的菌株接入以羽毛粉為唯一碳源和氮源的液體培養基(1%羽毛粉，0. 05% NaCl,0. 03% K2HPO4,0. 04% KH2PO4,0.01% MgSO4 ·7Η20 ；ρΗ7. 2-7. 5)中，37°C、150rpm培養2-3天，進行進一步的篩選；取搖瓶發酵后的培養液上清，以偶氮角蛋白為底物，用歐洲標準法(如Tomarelli RM,Charney J(1949)The use of azoalbumin as a substrate in the colorimetric determination of peptic and tryptic activity. J Lab Clin Med 34 =428-433)測定角蛋白酶活力，挑選出高酶活的菌株；(2)將以上篩選出的高酶活菌株在改良高氏1號培養基斜面上進行富集培養，收集孢子，用無菌的磷酸鹽緩沖液制成孢子懸液，然后用NTG進行誘變處理，用羽毛粉瓊脂平板篩選出正突變的菌株，用羽毛粉瓊脂斜面劃線分離純化3-5次，再用搖瓶發酵進行復篩， 最終分離篩選到角蛋白酶的高產菌株；(3)篩選得到的角蛋白酶高產菌株，其所分泌的角蛋白酶是一種復合酶，對多種不同的蛋白質底物都表現出很好的水解能力。并且若在發酵過程中加入相應的蛋白質底物作誘導，可明顯提高發酵所產復合蛋白酶液對該種蛋白底物的酶活力和水解能力。分離篩選所用的培養基為羽毛粉瓊脂(g/L)=NH4Cl 0. 5，NaCl 0. 5，K2HPO4 0. 3，KH2PO4 0. 4，MgSO4 ·7Η200· 1， 酵母膏0. 1，羽毛粉10，瓊脂20 (ρΗ7. 2-7. 5)。改良高氏1號培養基(g/L) =KNO3 1，可溶性淀粉10，玉米淀粉5，糊精5，K2HPO4 0. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，NaCl 0. 5，FeSO4 0. 01，瓊脂 20 (ρΗ7· 2-7. 4)。搖瓶發酵培養基(g/L)=K2HPO4 · 3H20 1. 4，KH2PO4 0. 35，MgSO4 · 7H20 0. 5，CoCL2lOppm，羽毛 10 (pH7. 0-7. 2)。菌株的初步鑒定根據《放線菌的分類和鑒定》、《鏈霉菌鑒定手冊》以及《微生物學實驗手冊》對其進行形態特征、培養特征和生理生化測定等方面的初步鑒定。菌株為革蘭氏陽性放線菌，氣絲淡洋紅至肉桂褐，孢子絲直、柔曲至螺旋型，孢子卵圓形、長圓形、柱形，表面光滑，不產生黑色素。能在14-42°C溫度范圍內生長，最適生長溫度為31-35°C，生長pH為5-11，最適生長pH為7-8。蔗糖硝酸鹽瓊脂氣絲落英淡粉色和粉色，基絲無色和微黃色，在大部分培養基內無可溶色素。克氏合成1號瓊脂氣絲荷花白色，基絲麥芽糖黃色，可溶色素無和淡黃色。葡萄天冬素瓊脂氣絲落英淡粉色，基絲微黃色。高氏合成1號瓊脂氣絲荷花白色、淺粉色，基絲淡黃色。淀粉合成瓊脂氣絲微白色，基絲無色。瓦氏肉湯瓊脂氣絲白色，基絲無色或風帆黃色。高氏有機2號瓊脂氣絲無或很少，微白色，基絲微黃色或淡銹色。馬鈴薯瓊脂氣絲粉白色或粉色，基絲淺風帆黃色或山雞褐色，可溶色素芒果棕色或淡栗棕色。馬鈴薯塊無氣絲，基絲橙色，無可溶色素。明膠液化，無色素。牛奶凝固并迅速胨化。淀粉水解。纖維素上生長，硝酸鹽還原， 不產生類黑色素和h2S。利用葡萄糖、D-果糖、蔗糖、以及D-半乳糖、D-甘露糖、麥芽糖、淀粉、甘油、乙酸鈉、檸檬酸鈉，不利用D-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖、棉子糖、肌醇、甘露醇以及乳糖、D-山梨醇、草酸鈉。對該菌的16s rRNA進行了測定(上海生工)，并通過使用BLAST和多序列比對程序CLUSTAL W比對該菌的16s rRNA序列和在GenBank中的參考序列。結果顯示，其16s rRNA 的堿基序列與 Sti^ptomyces fradiae NBRC 12176、NBRC13439 和 NBRC 3360 等之間具有99%的一致性。基于所選菌株的形態、生理生化特性和16s rRNA的研究結果，確定該菌株為Streptomyces fradiae的一個新的亞種。菌株的發酵用冷凍管保存的菌懸液或試管斜面接裝有50ml種子培養基的250ml三角瓶中，置于恒溫搖床上30°C、200rpm培養17_20h后，全部接入裝有2. 5L發酵培養基的5L的發酵罐中，37°C、150rpm發酵2-3d。發酵液離心，收集上清液，即為復合蛋白酶液，置于4°C保存。所用培養基為種子培養基(g/L)可溶性淀粉5，玉米淀粉2. 5，糊精5，K2HPO4 · 3Η201· 4，KH2PO4 0. 35，MgSO4 · 7Η20 1，NaCl 0· 5，蛋白胨 20，酵母粉 2，CaCO3 0. 5，CoCL2 IOppm(ρΗ7· 2)。發酵培養基(g/L)=K2HPO4 · 3H20 1. 4，KH2PO4O. 35，MgSO4 · 7H20 0. 5，CoCL2 lOppm, 羽毛 10 (pH7. 0-7. 2)。另一方面，本發明篩選到的弗氏鏈霉菌菌株FB201及由其產生的復合蛋白酶均有良好的活性，故而由該微生物得到的酶組合物，對各種蛋白質，尤其對角蛋白或含角蛋白的物質也具有良好的體外活性。因此，由該微生物分離出來的酶組合物也可以使用。FB201所產生的粗酶液是一種復合蛋白酶，具有很好的復合蛋白酶性質及強的蛋白水解能力，其最適PH為9. 0左右，最適溫度為50°C，具有很好的pH穩定性和熱穩定性。在不同的PH條件下保溫1小時后，在pH5. 0至pH9. 0的范圍內殘余酶活在80%以上，在pH3. 0 至pHl 1.0的范圍內，殘余酶活在50%以上；在pH8. 5至pH9. 5的范圍內50°C作用1小時， 殘余酶活在70%以上，60°C作用Ih，殘余酶活約為20%。本發明所得到的菌株還可用來分離編碼角蛋白酶的基因及、或用來插入另一種微生物中編碼的角蛋白酶的基因。在這種情況下，關系到相似的按經驗實施或可實施的方法， 其中將源自該菌株編碼角蛋白酶的基因嵌入到大腸桿菌、芽孢桿菌或酵母中，然后培育，以獲取角蛋白酶。不論是本發明提供的弗氏鏈霉菌菌株，還是用本發明的酶組合物，都不僅可以處理不溶性的蛋白質，而且也可以處理可溶性蛋白質。分解可進行得很完全。在一般情況下， 酶解除了會產生個別氨基酸外，大部分的酶解產物均為具有生物活性的短肽。用本發明的酶組合物及本發明的方法水解蛋白質，尤其是硬蛋白(如角蛋白、大豆分離蛋白、谷原蛋白、膠原蛋白等)，所產生的低聚肽及寡肽具有很好的理化性質和生物活性，并且無苦味產生。本發明的酶組合物，可從含本發明提供的弗氏鏈霉菌菌株的培養物中分離掉培養基殘余物，并在必要時，加以濃縮而得到。也可從含有該微生物菌株的培養物中洗去細胞而得到酶組合物。為了得到所述種類的酶組合物，在菌種培養或發酵過程中加入相應的蛋白質底物，以產生誘導作用，則更為有利。本發明的酶組合物可以含有一種或多種酶，并且具有蛋白酶活性，同時具有以下的一些酶學特性最適溫度值(pH9. 0時)在40-70°C范圍內，尤其在50°C時。最適pH值(溫度50°C時)在pH7. 0至pHll.O的范圍內，尤其在pH9. 0處。pH8. 5至pH9. 5的范圍內，50°C作用1小時，殘余酶活在70%以上；60°C作用1小時，殘余酶活約為20%。溫度45°C至55°C，在pH5.0至pH9.0的范圍內作用1小時，殘余酶活在80%以上； 在PH3.0至pHll.O的范圍內作用1小時，殘余酶活在50%以上。經過分離純化證明，該復合蛋白酶體系中至少有6種不同的蛋白酶分子， SDS-PAGE及凝膠分子篩表明其分子量分別約為20KDa、30KDa、35KDa、40KDa、67KDa和 IOOKDa0下列抑制劑在所述濃度下對酶活力的抑制效果如下
權利要求
1.一種弗氏鏈霉菌，其特征在于，所述弗氏鏈霉菌在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 4186。
2.權利要求1所述的弗氏鏈霉菌和/或其代謝產物的用途，其特征在于，用于制備復合蛋白酶。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的復合蛋白酶可分解角蛋白、或含有角蛋白的物質，所述的含有角蛋白的物質選自羽毛、獸角、或蹄。
4.一種用于水解蛋白質的組合物，其特征在于，所述的組合物含有如權利要求1所述的弗氏鏈霉菌和/或其代謝產物。
5.如權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述的組合物含有6種蛋白酶，它們的分子量分別為 20KDa±^(Da、30KDa±^(Da、3^(Da±^(Da、40KDa±^(Da、67KDa±^(Da 和 IOOKDa士5KDa。
6.一種權利要求4或5任一所述的組合物的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(a)在含有如權利要求1所述的弗氏鏈霉菌的培養物中分離得到權利要求4或5任一所述的組合物；或(a')在含有如權利要求1所述的弗氏鏈霉菌的培養物中將細胞破壁或裂解，在所得到的裂解液中分離得到權利要求4或5任一所述的組合物。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述含有如權利要求1所述的弗氏鏈霉菌的培養物中含有角蛋白、大豆分離蛋白、膠原蛋白、和/或谷原蛋白或其水解物；所述的角蛋白包括羽毛、毛發、獸角、和/或蹄。
8.一種蛋白質的水解方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(i)將如權利要求1所述的弗氏鏈霉菌和/或其代謝產物和角蛋白和/或含有角蛋白的物質在40°C至90°C、pH4至11下進行混合；或(i')將如權利要求4或5所述的組合物和角蛋白和/或含有角蛋白的物質在40°C至 90°C、pH4至11下進行混合；所述的含有角蛋白的物質選自羽毛、毛發、獸角、或蹄。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，在混合前將所述含有角蛋白的物質在小于等于120°C或/和pH彡10的條件下進行預處理。
10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，在混合中以所加的角蛋白和/或含有角蛋白的物質在5-6小時后至少溶解60%的酶加量。
全文摘要
本發明公開了一種復合蛋白酶及其制備方法和用途。本發明還公開了產生該復合蛋白酶的新的弗氏鏈霉菌菌株。該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.4186。本發明還公開了該微生物的獲得方法及其用途。
文檔編號C12N1/14GK102229890SQ20101059088
公開日2011年11月2日 申請日期2010年12月15日 優先權日2010年12月15日
發明者葉秀云, 張洋, 林晶, 羅鋆林, 陳萍, 靳偉剛 申請人:福建福大百特科技發展有限公司