專利名稱：一種提高畢赤酵母重組蛋白表達量的方法
技術領域：
本發明涉及一種新的提高重組蛋白的表達的方法，屬于生物工程領域。
背景技術：
巴斯德畢赤酵母表達系統是目前最優秀、應用最廣泛的外源基因表達系統之一。 巴斯德畢赤酵母表達系統作為真核表達系統，有許多其它蛋白表達系統所不具備的優點。 可對表達的蛋白進行加工折疊和翻譯后修飾，從而使表達出的蛋白具有生物活性，具有強 有力的乙醇氧化酶(AOXl)基因啟動子，可嚴格調控外源蛋白的表達，營養要求低，培養基 廉價，生長快，與昆蟲、哺乳動物等高等真核細胞相比，易于進行操作和培養。巴斯德畢赤酵 母對需氧生長有強的偏好，這一生理學特性使它能高密度發酵生長，表達量高，有利于工業 放大生產。巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分離和 純化。表達的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的內源蛋白少，外源蛋白分離純化簡便；外源基 因通過質粒整合到基因組上，基因工程菌株遺傳穩定性好；胞內表達蛋白的分選和區域化， 增加了表達蛋白的穩定性，減少表達產物對宿主菌的毒害作用；糖基化程度低，與釀酒酵母 相比，巴斯德畢赤酵母不產生過度的糖基化；所分泌的糖蛋白的免疫原性較低，更利于臨床 應用。高密度發酵是畢赤酵母提高蛋白表達量的一種重要策略，發酵工藝是高密度發酵 的一個重要因素。但是高密度發酵過程中，各種條件難以控制，酵母細胞內部自由基積累嚴 重，容易導致酵母死亡，進而影響了外源蛋白表達。褪黑激素(Melatonin)，又名黑素細胞凝集素，為腦白金的主要有效成分，是存在 于從藻類到人類等眾多生物中的一種荷爾蒙，它在生物中的含量水平隨每天的時間變化而 變化。褪黑素最大的特點應該是，它是迄今發現的最強的內源性自由基清除劑。褪黑素的 基本功能就是參與抗氧化系統，防止細胞產生氧化損傷。在這方面，它的功效超過了已知的 所有體內物質。所以通過褪黑激素的清除自由基功能作用于酵母細胞，使得酵母處于更優 狀態，從而可以提高外源蛋白的表達量。
發明內容
本發明的目的在于提供一種提高重組蛋白表達的方法。從而可以使得通過高密度 發酵，生產外源蛋白的效率更高。本發明所述的提高重組蛋白表達的方法主要為在工程菌發酵表達外源重組蛋白 的過程中定時加入一定濃度的褪黑激素。本發明所說定時加入褪黑激素是指每隔一定的時間，其時間跨度可以為lh-Mh， 重復這一操作，周期性執行，直至發酵結束。本發明所說的一定濃度是指按發酵液的總量，褪黑激素在發酵液中的濃度為Ing/ ml-ΙΟΟμ g/ml，最佳的濃度為 lOng/ml-Ι μ g/ml。本發明的優點是利用了褪黑激素很強的自由基消除劑的優點，有效克服了畢赤酵
3母在高密度發酵時因環境脅迫導致的自由基積累以及進一步的對蛋白表達量的影響。
圖1、IL2-HSA在不同溶度褪黑素誘導下蛋白表達量的SDS-PAGE分析M 低分子量標準；0:沒有用褪黑激素處理的樣品；1 0.001yg/ml褪黑激素處 理的樣品；3 0.01 μ g/ml褪黑激素處理的樣品；4 0.1 μ g/ml褪黑激素處理的樣品； 5 1μ g/ml褪黑激素處理的樣品；6 10 μ g/ml褪黑激素處理的樣品；7 100 μ g/ml褪 黑激素處理的樣品。圖2、IFNii-HSA大瓶(500ml)不同溶度褪黑素誘導下蛋白表達量的SDS-PAGE分 析M 低分子量標準；0 沒有用褪黑激素處理的樣品；1 0. 001 μ g/ml褪黑激素處理的樣 品；3 0.01 μ g/ml褪黑激素處理的樣品；4 0. 1 μ g/ml褪黑激素處理的樣品；5 Iyg/ ml褪黑激素處理的樣品；6 10 μ g/ml褪黑激素處理的樣品；7 100 μ g/ml褪黑激素處 理的樣品。實施例1表達白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的工程菌GSl 15/pPIC9K-IL2-HSA由本室構 建保存，該重組畢赤酵母甲醇利用表型為mut+。(1)從保存了高表達菌株的平板上挑取一單菌落，置于裝有IOmLYPD培養基的 50mL搖瓶中，于30°C、200rpm培養24h。(2)將YPD培養基中培養了 24h的菌體以1 100 的比例接種于裝有200mL BMGY培養基的IOOOmL搖瓶中，30°C、200rpm培養48h。期間每4h 取ImL菌懸液，用紫外分光光度計檢測菌濃(菌濃以A_為計數單位)，繪制生長曲線。(3)重復步驟(1)和(2)，待菌體長至36h的時候，將200mL BMGY培養基中的菌體 靜置4 6h，待菌體沉淀至瓶底，緩緩倒掉上清。加入滅菌過的BMMY培養基IOOmL,充分振 蕩均勻，按每瓶15ml分成8瓶，加入1.5%甲醇(ν/ν)進行誘導表達，同時加入不同濃度的 褪黑激素(0. 001 μ g/ml、0· 01 μ g/ml、0· 1 μ g/ml、1 μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ml、1000 μ g/ ml。)，一瓶不加褪黑激素，其他后處理相同。其后每24h再加入相應濃度的褪黑激素。誘 導表達3d。SDS-PAGE電泳檢測不同處理的表達情況(圖1)。實施例2表達β干擾素-人血清白蛋白融合蛋白的工程菌GS115/pPIC9K-IFNi3_HSA由本 室構建保存，該重組畢赤酵母甲醇利用表型為mut+。(1)從保存了高表達菌株的平板上挑取一單菌落，置于裝有IOmLYPD培養基的 50mL搖瓶中，于30°C、200rpm培養24h。(2)將YPD培養基中培養了 24h的菌體以1 100 的比例接種于裝有200mLBMGY培養基的IOOOmL搖瓶中，30°C、200rpm培養48h。期間每4h 取ImL菌懸液，用紫外分光光度計檢測菌濃(菌濃以A_為計數單位)，繪制生長曲線。(3)重復步驟(1)和(2)，待菌體長至36h的時候，將200mL BMGY培養基中的菌體 靜置4 6h，待菌體沉淀至瓶底，緩緩倒掉上清。加入滅菌過的BMMY培養基IOOmL,充分振 蕩均勻，按每瓶15ml分成8瓶，加入1.5%甲醇(ν/ν)進行誘導表達，同時加入不同濃度的 褪黑激素(0. 001 μ g/ml、0· 01 μ g/ml、0· 1 μ g/ml、1 μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ml、1000 μ g/ ml。)，一瓶不加褪黑激素，其他后處理相同。其后每24h再加入相應濃度的褪黑激素。誘 導表達3d。SDS-PAGE電泳檢測不同處理的表達情況(圖2)。
權利要求
1.一種新的提高重組蛋白的表達的方法，該方法為在利用酵母表達外源蛋白的過程中 定時加入微量的褪黑激素。其特征在于，在畢赤酵母高密度發酵過程中加入了低濃度的褪黑激素。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，其中所說的定時加入微量的褪黑激素是在畢 赤酵母發酵液中每隔一定時間(Ih-Mh)加入，周期性執行這一操作直至發酵結束。
3.如權利要求2所述，其特征在于，設定的褪黑激素濃度范圍為Ing/ml-lOOyg/ml。
4.如權利要求3所述，其特征在于，設定的褪黑激素最佳濃度為lOng/ml-lyg/ml。
全文摘要
本發明涉及一種新的提高重組蛋白的表達的方法。在正常重組畢赤酵母的工藝流程的基礎上，加入微量的退黑激素可以大大提高重組蛋白的表達。該方法使得重組酵母菌高密度發酵時由于供氧不均衡等脅迫帶來的酵母內部自由基積累得到降低，改善了高密度發酵過程中因自由基帶來的對酵母本身的損傷，從而改善了酵母本身的生理狀況。使用退黑激素后，重組蛋白的表達量得到了很大程度的提高。
文檔編號C12N1/19GK102120979SQ201010580240
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月9日 優先權日2010年12月9日
發明者張大成, 朱瑞宇, 辛鑫, 金堅, 陳蘊, 雷楗勇 申請人:江南大學