專利名稱：綿羊Noggin基因的克隆和慢病毒表達載體的構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及綿羊Noggin基因編碼區的全長cDNA序列的克隆及慢病毒表達載體的構建。
背景技術：
Noggin BMPs (bone morphogenetic proteins,S ) ^白，是從非洲蟾蜍體內分離，能誘導神經組織發生和腹側中胚層背側化。由于它與BMP2和 BMP4具有高度親和力，從而阻止它們與BMP受體的相互作用。因此，BMPs活性受到BMP拮抗蛋白noggin基因的抑制性調節。目前普遍認為，毛囊的發生也是由表皮干細胞引發的。在毛囊的形成過程中，表皮干細胞通過改變他們的極性以及細胞間的相互聯系而啟動這一過程。2003年，由洛克斐勒大學HHMI研究所Elaine Fuchs領導的研究人員發現了兩個信號分子，即WNT及BMP 抑制劑Noggin，能夠影響未成熟的干細胞形成毛囊的過程。在之前的研究中，Fuchs將 beta-catenin基因導入小鼠生產出具有很多毛囊的轉基因老鼠。beta-catenin受Wnt信號通路調節，研究人員證明Wnt能使beta-catenin穩定，而noggin則能阻斷BMP的功能， 產生Lefl。這樣，beta-catenin即可結合并活化Lefl轉錄復合體，下調E-cadherin基因的表達，降低E-cadherin的水平，從而改變細胞的極性以及細胞間相互連接，引發毛囊的起始過程。如果提高E-cadherin的水平，毛囊則不再形成。這就是說，通過來源于不同類型細胞的WNT及noggin兩個影響毛囊形成的信號分子，將細胞外的信號通路與細胞核轉錄因子聯系在一起，共同作用于目標基因，可以重塑細胞間聯系、啟動毛囊的形成。毛發是少數幾個能規律性再生的器官之一，是研究器官再生的主流模式之一，也是目前研究的熱點領域。2008年，來自美國南加州大學鐘正明教授的研究小組發現，毛發(即使是正常小鼠中的毛發)并不是以個體為單位生長，而是波浪式再生的，這說明毛發干細胞不僅受到一個毛囊中微環境的調控，也被鄰近的毛囊、皮膚區間，以及系統激素有等級地進行調控。在分子水平上，BMP和Noggin的表達呈周期性變化。在毛囊生長期，尤其是細胞增殖時，Noggin 表達高、BMP表達低；在退行期和不應期，BMP表達高、Noggin表達低。這些發現表明皮膚宏觀環境(macro-environment)下，BMP和Noggin的周期性表達在毛發干細胞活性機制中發揮關鍵作用。當許多毛發再生的時候，毛發必須在它們其間交換活性信號，在宏觀環境的不同時間位點，這些干細胞活性受到抑制或者促進。研究人員還發現在轉基因小鼠皮膚中過量上表達noggin，毛囊的不應期顯著縮短，而毛囊的再生明顯加快；將該轉基因小鼠的皮膚移植到正常小鼠皮膚則發現，供體和受體皮膚的毛囊會受相互作用影響，其毛囊最終的命運則取決于真皮內BMP的活性；而人為調控皮膚BMP活性即可造成毛囊生長周期的變化。 所以，骨形態發生蛋白(BMP)及其拮抗因子Noggin在控制毛囊活動周期中起重要作用。因此，通過調節Noggin基因的表達干預BMP的活性，能夠影響毛囊生長周期，延長毛囊生長期、加快毛囊循環周期的進程。Andrey的研究還發現，Noggin基因的過量表達還將改變毛囊的大小和毛發的形狀，這些變化無疑對提高毛產量和品質提供了實驗和理論依據。本發明利用RT-PCR技術擴增出綿羊Noggin基因cDNA全長編碼區，進一步構建慢病毒表達載體，利用慢病毒卵周隙注射技術生產轉Noggin基因綿羊，以便進一步分析 Noggin基因在綿羊毛囊生長發育中的作用。
發明內容
本發明的目的在于提供的克隆綿羊Noggin基因的cDNA序列和構建慢病毒表達載體，對分析其在細毛羊毛囊生長發育中的功能有重要的科學價值與實踐意義。本發明的目的是這樣實現的綿羊Noggin基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，1)確定綿羊Noggin基因編碼區的全序列；2)設計克隆Noggin基因全長 cDNA 的 PCR 弓丨物，上游引物 Nl :ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG，下游引物 N2 CGACTCGAGCTAGCACGAGCACTTGCACTC ；上下游引物酶切位點外側含有酶切的保護堿基ATA和 CGA ；3)將目的基因定向克隆于pET41a原核表達載體中，獲得pET41a-N0ggin重組原核表達載體；4)設計將目的基因定向克隆與慢病毒表達載體的引物上游引物Pl :ATAGGATCCGG AGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游引物 P2 :CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAC GAGCACTTGCACTC (包含HA抗體標簽)；將目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表達載體中，獲得Noggin基因慢病毒載體，生產重組病毒，利用慢病毒卵生產轉Noggin基因綿羊力)通過 PCR方法鑒定轉基因羊。所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，以反轉錄的cDNA為模板，利用特異性引物m和N2進行PCR反應，其反應體系為2uL cDNA模板，2.5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO，IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調整至 25uL;其 PCR 反應條件為94°C 4min，94°C 30s, 64 °C 30s, 72 °C lmin，;35 個循環， 72°C IOmin ；取反應液5uL經瓊脂糖凝膠電泳檢測確認，將綿羊Noggin基因的擴增產物及 pET41a載體同時進行BamH I-Xho I雙酶切，分別回收純化酶切后的PCR產物和pET41a載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產物和pET41a載體，轉化E. coli DH5 α ；利用卡納霉素和藍白斑標記進行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，陽性克隆質粒進行序列鑒定后，命名為pEI^la-Noggin。所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，構建表達載體，生產慢病毒，生產轉 Noggin基因綿羊其構建載體以pET41a-N0ggin為模板，利用特異性引物Pl和P2進行PCR反應； 其反應體系為luL pET41a-Noggin，2. 5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO, IUTaqSI (寶生物，Pfu)，用 ddH20調整至 25uL ；其 PCR 反應條件為94°C 4min，94°C 30s，64°C 30s, 72°C lmin,35 個循環，72°C IOmin ；取反應液 5uL 經瓊脂糖凝膠電泳檢測確認，將綿羊Noggin基因的擴增產物及pLex慢病毒載體同時進行BamH IAhoI雙酶切，分別回收純化后的PCR產物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的 PCR產物和pLEX載體，轉化E. coli DH5 α ；利用氨芐青霉素進行平板篩選，并以PCR法、限制性酶切法鑒定，并送由上海生物工程有限公司測序鑒定，新載體命名為pLEX-noggin ；其細胞培養條件37°C，5%的CO2,培養基采用DMEM+10 %的胎牛血清， 每IOcm面積中鋪2-2. 5X IO6個細胞，保證第2天細胞在完全培養液中匯合度達到70-80% ；其Lipectamine 2000脂質體轉染加入1. 5ml預熱的Opti-MEM培養基后，按下列比例加入轉染載體(plex-noggin)12ug、包裝質粒(pSPAX》9ug、包膜質粒(pMD2G) 3. 5ug、 輕輕混勻，同時將50ul的脂質體加入到1. 5ml opti-MEM培養基，室溫放置5min后，將上述稀釋好的DNA與脂質體混合，混合物置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養基清洗待轉染細胞一次，將脂質體和DNA復合物加入細胞，將細胞培養板放回37°C培養箱中孵育，2-4小時后，移去脂質體和DNA復合物，在每個培養皿中加入IOml新鮮的培養液，重新將細胞培養板放回37°C培養箱中培養，4 后收集病毒；其收集病毒細胞培養上清液，將細胞上清用0. 45um過濾器過濾，收集過濾液，采用clontech公司的病毒滴度測定試劑盒(lenti-χ qrt-PCR Titration Kit)測定滴度，滴度大于106IFU/ml，超速低溫離心濃縮，將濃縮后的病毒分裝至1. 5ml的印pendorf中，置于液氮或者_70°C保存備用。所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，轉基因羊的鑒定，采集臍帶和皮膚組織，利用酚-氯仿法提取基因組DNA，通過PCR方法鑒定轉基因羊；PCR上游引物 CACCAAAATCAACGGGACTT,下游引物CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACGA GCACTTGCACTC ;PCR 反應體系(25 μ L) :PCR Mix 12. 5 μ L，引物(lOpmol/μ L)各 0· 5 μ L， DNA 模板 600ng, ddH20 補至 25 μ L ；PCR 反應程序95 V 5min ；95 °C 30sec ；60 °C 30sec ； 720C lmin，35 個循環；72°C 7min。所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，根據GenBank已經公布的人 (NM_0(^450)，小鼠(NM_008711)和牛(XM_582573)的Noggin基因編碼區的保守序列，利用 01igo6. 0設計一對PCR引物，其引物由上海生物工程公司合成。所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，選用的試劑盒、藥劑均為市售產品。本發明構思是確定綿羊Noggin基因編碼區的全序列，設計克隆Noggin基因全長 cDNA的PCR引物，通過RT-PCR技術，從綿羊胎兒腦組織克隆綿羊Noggin基因全長cDNA，確定綿羊Noggin基因編碼區cDNA序列；將目的基因定向克隆于pET41a原核表達載體中，獲得pET41a-N0ggin重組原核表達載體；特別是該發明構建Noggin基因慢病毒載體，生產重組病毒，利用慢病毒卵周隙注射技術生產轉Noggin基因綿羊，具有重要的實踐價值，彰顯技術進步。
本發明對照附圖作進一步說明。附圖1為綿羊Noggin基因PCR擴增結果；如圖所示M為150bp marker, 1為擴增到的noggin基因。附圖2為綿羊Noggin基因原核表達結果；如圖所示重組pET41-NogginSDS-PAGE 檢測1，3，5. pET41_Noggin 誘導后，2，4， 6. pET41-Noggin 誘導前，7. pET41 空載體。附圖3 為重組 pLEX-NogginWestern blot 檢測結果；如圖所示綿羊Noggin基因真核表達結果1，2pLEX_Noggin，3. pLEX空載體。圖4為轉Noggin細毛羊臍帶，皮膚組織PCR檢測結果；如圖所示轉基因羊鑒定的PCR結果第一排為臍帶，第二排為相對應的皮膚組
具體實施例方式本發明對照實施例作進一步說明。
實驗過程(1)實驗樣品采集與總RNA提取采集妊娠3個月的羊胚胎，快速分離腦組織，裝入凍存管中并迅速置于液氮中保存備用；取IOOmg組織樣在液氮中研碎，然后按照杭州博日RNA提取試劑盒說明書進行提取。(2)引物設計利用01igo6. 0設計的兩對(N1，N2和P1，P2)PCR引物，由上海生物工程公司合成。(3) RT-PCR對綿羊胚胎腦組織RNA進行反轉錄，反轉錄方法參照說明書；以反轉錄的cDNA 為模板，利用特異性引物W和N2進行PCR反應，其反應體系為2uL cDNA模板，2.5uL 10XPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO，IUTaq酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調整至 25uL。PCR 反應條件為94°C 4min，94°C 30s，64°C 30s, 72°C lmin, 35個循環，72°C IOmin ；反應結束，取反應液5uL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認其產物。(4)克隆和測序將綿羊Noggin基因的擴增產物及pEI^la載體同時進行BamHI-XhoI雙酶切，分別回收純化酶切后的PCR產物和pET41a載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產物和 pET41a載體，轉化E. coli DH5 α ；利用卡納霉素和藍白斑標記進行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，陽性克隆質粒進行序列鑒定分析后命名為pET41a-N0ggin。(5)原核表達將測序后的質粒DNA及空載體分別轉化BL21(DE!3)感受態細胞，在含有卡納霉素(50ug/mL)的LB固體培養基中37°C培養過夜；挑取單克隆菌落接種到含有卡納霉素 (50ug/mL)的LB液體培養基，37°C震蕩培養過夜；然后將培養物按1 100的比例接種于新鮮的含有卡納霉素(50ug/mL)的LB液體培養基，37°C搖震培養至0P_ = 0. 4-0. 6時，加入IPTG(終濃度lmmol/L)37°C誘導培養4h后，按常規方法離心收集菌體，用200uLPBS重懸菌體，并加入200uL 2 X SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，100°C變性lOmin，進行SDS-PAGE和 Western-blot,分析目的蛋白的表達。(6)構建noggin基因的慢病毒表達載體，生產高滴度慢病毒，利用慢病毒卵周隙注射技術生產轉Noggin基因綿羊；a、構建慢病毒表達載體以pET41a-N0ggin為模板，利用特異性引物Pl和P2進行 PCR 反應，其反應體系為2uL cDNA 模板，2. 5uL 10XPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)， 上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO, IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調整至 25uL。PCR 反應條件為94°C 4min,94°C 30s, 64°C 30s, 72°C lmin, 35 個循環，72°C IOmin ；取反應液 5uL經瓊脂糖凝膠電泳檢測確認。將綿羊Noggin基因的擴增產物及pLEX慢病毒載體同時進行BamHIAho I雙酶切，分別回收純化后的PCR產物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶
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7連接酶切后的PCR產物和pLD(載體，轉化E. coli DH5a ；利用氨芐青霉素進行平板篩選， 并以PCR法、限制性酶切法鑒定，并送由上海生物工程有限公司測序鑒定，新載體命名為 pLEX-noggin ；將綿羊Noggin基因的擴增產物及pLex慢病毒載體同時進行BamH I/Xho I雙酶切，分別回收純化后的PCR產物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產物和 pLEX載體，轉化E.coli DH5a ；利用氨芐青霉素進行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，新載體命名為pLEX-noggin ；b、在細胞中包裝重組慢病毒步驟第1日J93T細胞培養和鋪板293Τ細胞培養條件，37°C，5%的CO2，培養基采用DMEM+10%的胎牛血清，每IOcm 面積中鋪2-2. 5X IO6個細胞，保證第2天細胞在完全培養液中匯合度達到70-80% ；第2 日Lipectamine 2000 脂質體轉染首先，在聚丙烯管里準備脂質體和DNA復合物；加入1. 5ml預熱的Opti-MEM培養基后，按下列比例加入目的載體及病毒包裝載體。輕輕混勻。室溫放置；轉染載體(plex-noggin)12ug包裝質粒(pSPAX》9ug包膜質粒(pMD2G)3. 5ug在使用Lipectamine 2000之前先輕輕混勻脂質體；而后，在另一個管中加入 1. 5ml室溫的Opti-MEM培養基，再加入50ul Lipectamine 2000，輕輕混勻后室溫放置，室溫放置5min后；將上述稀釋好的DNA與脂質體混合，混合物置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養基清洗待轉染細胞一次，將脂質體和DNA復合物加入細胞；將細胞培養板放回37°C培養箱中孵育，2-4小時后，移去脂質體和DNA復合物，在每個培養皿中加入 IOml新鮮的培養液，重新將細胞培養板放回37°C培養箱中培養；第4日收集病毒收集含病毒的細胞培養上清液。將細胞上清用0. 45um過濾器過濾，收集過濾液； 采用clontech公司的病毒滴度測定試劑盒(lenti-xqrt-PCR TitrationKit)測定滴度，滴度大于106IFU/ml，超速低溫離心濃縮，保證濃縮后的病毒滴度大于109IFU/ml，將濃縮后的病毒分裝至1. 5ml的^pendorf中，置于液氮或者_70°C保存備用；C、利用慢病毒卵周隙注射生產轉基因羊。(7)轉基因羊的鑒定采集轉基因羊的臍帶和皮膚組織，利用酚-氯仿法提取基因組DNA ；通過PCR方法鑒定轉基因羊，PCR反應體系(25yL) :PCR Mix 12.5yL，引物 (lOpmol/μ L)各 0· 5 μ L，DNA 模板 600ng, ddH20 補至 25 μ L ；PCR 反應程序95 "C 5min ；95 "C 30sec ；60 "C 30sec ；72 "C lmin，35 個循環； 72 0C 7min ；上游引物CACCAAAATCAACGGGACTT(pLEX 載體自帶引物)，下游引物CGACTCGAGCT AAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACGAGCACTTGCACTC。
權利要求
1.綿羊Noggin基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，其特征在于1)確定綿羊Noggin基因編碼區的全序列；2)設計克隆Noggin基因全長cDNA 的 PCR 弓丨物，上游弓丨物 Nl :ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游弓丨物 N2 CGACTCGAGCTAGCACGAGCACTTGCACTC ；上下游引物酶切位點外側含有酶切的保護堿基ATA和 CGA ；3)將目的基因定向克隆于pET41a原核表達載體中，獲得pET41a-N0ggin重組原核表達載體；4)設計將目的基因定向克隆與慢病毒表達載體的引物上游引物Pl :ATAGGATCCGG AGGCATGGAGCGCTGCCCCAG,下游引物 P2 :CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCAC GAGCACTTGCACTC (包含HA抗體標簽)；將目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表達載體中，獲得Noggin基因慢病毒載體，生產重組病毒，利用慢病毒卵生產轉Noggin基因綿羊力)通過 PCR方法鑒定轉基因羊。
2.依據權利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，其特征在于以反轉錄的cDNA為模板，利用特異性引物m和N2進行PCR反應，其反應體系為2uL cDNA模板，2.5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO, IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調整至 25uL ；其 PCR 反應條件為94°C 4min,94°C 30s， 64°C 30s, 72°C lmin，35個循環，72°C IOmin ；取反應液5uL經瓊脂糖凝膠電泳檢測確認，將綿羊Noggin基因的擴增產物及pET41a載體同時進行BamH I-Xho I雙酶切，分別回收純化酶切后的PCR產物和pET41a載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR產物和pET41a載體，轉化E. coli DH5a ；利用卡納霉素和藍白斑標記進行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，陽性克隆質粒進行序列鑒定后，命名為pET41a-N0ggin。
3.依據權利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，其特征在于構建表達載體，生產慢病毒，生產轉Noggin基因綿羊其構建載體以pET41a-N0ggin為模板，利用特異性引物Pl和P2進行PCR反應；其反應體系為luL pET41a-Noggin，2. 5uL IOXPCR buffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物 (IOmM)各 luL，IuL DMSO, IUTaq 酶(寶生物，Pfu)，用 ddH20 調整至 25uL ；其 PCR 反應條件為94°C 4min，94°C 30s，64°C 30s, 72°C lmin, 35 個循環，72°C IOmin ；取反應液 5uL 經瓊脂糖凝膠電泳檢測確認；將綿羊Noggin基因的擴增產物及pLex慢病毒載體同時進行BamH I/ XhoI雙酶切，分別回收純化后的PCR產物和pLEX載體，利用T4DNA連接酶連接酶切后的PCR 產物和pLEX載體，轉化E.coli DH5a ；利用氨芐青霉素進行平板篩選，并以PCR法、限制性酶切法鑒定，并送由上海生物工程有限公司測序鑒定，新載體命名為pLEX-noggin ；其細胞培養條件37°C，5%的CO2,培養基采用DMEM+10%的胎牛血清，每IOcm面積中鋪2-2. 5 X IO6個細胞，保證第2天細胞在完全培養液中匯合度達到70-80% ；其Lipectamine 2000脂質體轉染加入1. 5ml預熱的Opti-MEM培養基后，按下列比例加入轉染載體(plex-noggin)12ug、包裝質粒(pSPAX》9ug、包膜質粒(pMD2G) 3. 5ug、輕輕混勻，同時將50ul的脂質體加入到1. 5ml opti-MEM培養基，室溫放置5min后，將上述稀釋好的DNA與脂質體混合，混合物置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養基清洗待轉染細胞一次，將脂質體和DNA復合物加入細胞，將細胞培養板放回37°C培養箱中孵育， 2-4小時后，移去脂質體和DNA復合物，在每個培養皿中加入IOml新鮮的培養液，重新將細胞培養板放回37°C培養箱中培養，4 后收集病毒；其收集病毒細胞培養上清液，將細胞上清用0. 45um過濾器過濾，收集過濾液，采用clontech公司的病毒滴度測定試劑盒(lenti-χ qrt-PCR Titration Kit)測定滴度，滴度大于106IFU/ml，超速低溫離心濃縮，將濃縮后的病毒分裝至1. 5ml的印pendorf中，置于液氮或者_70°C保存備用。
4.依據權利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，其特征在于轉基因羊的鑒定，采集臍帶和皮膚組織，利用酚-氯仿法提取基因組DNA，通過PCR方法鑒定轉基因羊；PCR 上游引物CACCAAAATCAACGGGACTT，下游引物CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTC GTATGGGTAGCACGAGCACTTGCACTC ；PCR 反應體系(25 μ L) :PCR Mix 12. 5 μ L，引物(lOpmol/ μ L)各 0· 5 μ L，DNA 模板 600ng, ddH20 補至 25 μ L ；PCR 反應程序:95 V 5min ；95°C 30sec ； 60°C 30sec ；72°C lmin，35 個循環；72°C 7min。
5.依據權利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，其特征在于根據 GenBank 已經公布的人(ΝΜ_00Μ50)，小鼠(ΝΜ_008711)和牛(ΧΜ_582573)的 Noggin 基因編碼區的保守序列，利用01igo6. 0設計一對PCR引物，其引物由上海生物工程公司合成。
6.依據權利要求1所述基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，其特征在于選用的試劑盒、藥劑均為市售產品。
全文摘要
本發明的綿羊Noggin基因的克隆和慢病毒表達載體的構建，確定綿羊Noggin基因編碼區的全序列；設計克隆Noggin基因全長cDNA的PCR引物，上游引物N1ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG，下游引物N2CGACTCGAGCTAGCACGAGCACTTGCACTC；其引物酶切位點外側含有保護堿基ATA和CGA；將目的基因克隆于pET41a原核表達載體中，獲得pET41a-Noggin重組載體；設計將目的基因定向克隆與慢病毒表達載體的引物上游引物P1ATAGGATCCGGAGGCATGGAGCGCTGCCCCAG，下游引物P2CGACTCGAGCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGCACGAGCACTTGCACTC(包含HA抗體標簽)；將目的基因定向克隆于pLEX慢病毒載體中，獲得Noggin基因慢病毒載體，生產重組病毒，生產轉Noggin基因綿羊；通過PCR方法鑒定其轉基因羊。
文檔編號C12N15/867GK102181447SQ20101058002
公開日2011年9月14日 申請日期2010年12月9日 優先權日2010年12月9日
發明者劉明軍, 張寧, 張雪梅, 李文蓉, 賀三剛 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心