專利名稱：一種檢測登革1型病毒的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，具體涉及包含核酸、酶或微生物的測定或檢驗方法的 檢測試劑。
背景技術：
登革病毒屬黃病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，可導致登革熱(DF)、登革出血熱 (DHF)和登革休克綜合征(DSQ。登革病毒病每年約有5-10千萬人感染，已成為全球公共衛 生關注的焦點之一。本病感染潛伏期為2 15天，平均5 6天，通常3 5天，發病前盡 管體內有病毒存在，而前驅癥狀卻不明顯。登革熱表現為突然起病，畏寒、迅速發熱等癥狀。 登革出血熱有典型登革熱表現，2 4病日內可見散在出血點。病情進展中有鼻腔、牙齦、消 化道、泌尿道或子宮等任何一個以上器官的較大量出血，常見肝腫大，腦出血的病例也有發 現。異常嚴重出血的病例可導致死亡。登革休克綜合征具有DHF表現的少數病人，在發熱 過程中或熱退后，病情突然加重，出現皮膚濕冷、脈數弱、煩燥或昏迷，血壓下降出現休克或 脈壓低于2. 67Kpa(20mm汞柱以下)等危象，甚至血壓和脈搏測不出，病情兇險，病死率高。登革熱的診斷目前主要采取病毒分離定型以及血清中特異性IgM、IgG抗體測定 的方法。但由于患者早期抗體陽性率低，往往要7-10d后IgM抗體才能達到一個較高的水 平，因此在早期診斷中受到一定的限制。近年來發展起來的熒光定量RT-PCR技術可實現早 期診斷，而且與常規PCR相比，熒光定量PCR方法更靈敏，且不需要電泳分析，同時因加入特 異的熒光標記探針可對PCR擴增產物進行實時檢測，因而更省時、特異，減少了交叉污染， 并能精確地對多個樣本進行定量分析。在以往的研究中有在登革1型病毒3’非編碼區(3’ NC)、NS5區、衣殼蛋白(C)區 域設計引物探針。目前一般認為3’NC和NS5區設計的引物探針敏感性較差；C區保守性較 差，設計出來的引物探針容易受到其它三型登革病毒的干擾；E區變異性很大，會出現假陰 性或者敏感性較差。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種登革1型病毒的熒光定量PCR檢測試劑盒， 該試劑盒對登革1型病毒具有特異性和敏感性好的優點。本發明解決上述問題的技術方案具體是一種檢測登革1型病毒的熒光定量PCR 試劑盒，該試劑盒由定量陽性模板、一對特異性擴增登革1型病毒NS2A區域的引物、熒光探 針、熒光定量聚合酶I^remix Ex Taq 和參比染料ROX Reference Dye II組成，其特征在 于(1)所述的引物是特異性擴增登革1型病毒NS2A區域的引物，其中，上游引物序列為5，-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3，(SEQNO. 1)，下游引物序列為5，-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3，(SEQNO. 2)；(2)所述的熒光探針序列為
5，FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3，(SEQ NO. 3),其中FAM為標記在探針5’端的熒光基團，Eclipse為標記在探針3’端的熒光淬 滅基團；(3)所述的定量陽性模板為含有下列DNA片段的pMDIS-T重組質粒GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAGATGCTGATGACTGGAACACTGGCTGTTTTCCTCCTTCTTATAAT GGGACAACTGA(SEQ NO. 4)。本發明所述的特異性擴增登革1型病毒NS2A區域的引物可以由本領域常用的方 法合成。本發明所述的熒光探針可以由本領域常用的方法合成。本發明所述的熒光定量聚合酶I^remix Ex Taq 由Takara公司提供、參比染料 ROXReference Dye II 由 Takara 公司提供。本發明所述的定量陽性模板的構建方法是將DNA片段SEQ NO. 4插入到質粒載體 中構建重組質粒得到。上述方法中，所述的質粒載體是T克隆載體，如pMD19-T載體；所述的將DNA片段 SEQ NO. 4插入到質粒載體的方法為本領域的常規方法，具體的步驟和工藝參數視所選的質 粒載體而定。登革病毒非結構蛋白NS2A可能參與多聚蛋白的水解過程，本發明人通過Clustal W2對不同株的登革病毒基因進行比對，發現四型登革病毒在NS2A基因處的差別較大，而且 與其它黃熱病毒之間也存在很大差別，同時登革1型病毒型內的NS2A基因則比較保守，本 發明試劑盒正是通過檢測這段序列來判斷病人是否被登革1型病毒感染，擴增的引物序列 為SEQ NO. 1和SEQ N0. 2，其位置如
圖1示。本發明所述的試劑盒的使用方法為(1) Real-time PCR，反應體系如下表1本發明試劑盒Real-Time PCR反應體系
權利要求
1. 一種檢測登革1型病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒由定量陽性模板、一對特異 性擴增登革1型病毒NS2A區域的引物、熒光探針、熒光定量聚合酶ft~emiX Ex Taq 和參比 染料ROX Reference Dye II組成，其特征在于(1)所述的引物是特異性擴增登革1型病毒NS2A區域的引物，其中， 上游引物序列為5，-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3，，下游引物序列為5’ -TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3，；(2)所述的熒光探針序列為5’ FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3，，其中FAM為標記在探針5’端的熒光基團，Eclipse為標記在探針3’端的熒光淬滅基團；(3)所述的定量陽性模板為序列為SEQNO. 4的DNA片段的pMD19_T重組質粒，GATGAG ATCCAGATGGAGTAGAAAGATGCTGATGACTGGAACACTGGCTGTTTTCCTCCTTCTTATAATGGGACAACTGA。
全文摘要
本發明屬于生物化學領域，提供一種檢測登革1型病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有特異性擴增登革1型病毒NS2A區域的引物5’-GATGAGATCCAGATGGAGTAGAAAG-3’(SEQ NO.1)，5’-TCAGTTGTCCCATTATAAGAAGGAG-3’(SEQ NO.2)；和熒光探針5’FAM-ACAGCCAGTGTTCCAGTCATCAGCA-Eclipse3’(SEQ NO.3)。該試劑盒對登革1型病毒具有良好的敏感性和特異性，重復性很好，完全適用于登革1型病毒的臨床檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102108420SQ20101057521
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月3日 優先權日2010年12月3日
發明者萬成松, 曹虹, 朱利, 熊建英, 趙衛, 馬丹娟 申請人:南方醫科大學