惡臭假單胞菌kt2440高效的基因敲除方法

專利名稱：惡臭假單胞菌kt2440高效的基因敲除方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體是涉及一種高效地對惡臭假單胞菌KT2440進行 基因敲除的方法。
背景技術：
惡臭假單胞菌KT2440 (Pseudomonas putida KT2440)是重要的模式環境微生物 菌株，廣泛應用于生理、生態、生物化學、遺傳學等研究，也是表達異源基因的良好宿主菌。 惡臭假單胞菌KT2440的基因組在2002年被解析，也是第一個被美國衛生部重組DNA委員 會認定對環境安全的革蘭氏陰性菌株。惡臭假單胞菌KT2440是迄今遺傳研究闡述得最為 清晰、代謝多樣性研究得最為透徹的腐生假單胞菌，它保留了在環境中生存和發揮功能的 特點，在重要的環境活動如元素循環、生物體和非生物體污染物的降解及在生物催化、生物 排污、生物塑料等方面有很大的發展潛力。通過遺傳操作，使惡臭假單胞菌KT2440為降解 多種環境污染物的“超級工程菌”，將對環境保護和生物防治具有重要意義。基因敲除是菌 株遺傳操作的主要方式，也是進行基因和蛋白功能的研究、闡述生物降解的途徑和調控的 主要方法，因此發展快速、簡便、高效和可以高通量化的基因敲除是充分利用惡臭假單胞菌 KT2440的重要前提。常規的惡臭假單胞菌KT2440基因敲除方法是利用菌株本身所具有的recA重組系 統。首先利 用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增待敲除的靶基因上游和下游的同源基因，克隆測 序正確后，隨后將抗性基因克隆至上下游的同源基因中間，接著克隆至不能在惡臭假單胞 菌KT2440中自我復制的“自殺”載體中。將重組質粒轉化至惡臭假單胞菌KT2440，在抗生 素的抗性作用之下，菌株本身所具有的recA重組系統催化同源片段之間的同源重組而將 重組質粒整合至基因組，最后通過重組質粒上所攜帶的編碼蔗糖6-果糖轉移酶的sacB基 因所行使的負篩選作用，在含10%蔗糖的培養基中促使再發生一次同源重組而去除整合至 基因組上的質粒骨架部分，如此抗性基因取代靶基因而實現了基因敲除。此方法雖然行之有效，但克隆、測序多個步驟耗時、耗力，也增加了實驗的費用。也 未見采用此方法實現大片段基因敲除的報道，此方法還有著需要特殊的載體、難以高通量 化等等缺點。重組工程是上世紀八十年代末興起而逐漸成熟的一種DNA克隆和修飾的基因工 程技術。它利用重組酶催化的DNA片段之間的同源重組而形式作用。目前所廣泛使用的重 組酶是來自于lambda噬菌體的exo，bet和gam基因，exo (reda) 基因編碼DNA 5’ ->3 外切酶，其作用于雙鏈DNA得到3’端突出的DNA分子，bet (redb)基因編碼DNA單鏈結合 蛋白，其結合在突出的DNA分子上，Bet兼有重組酶活性，即可催化同源片段之間發生同源 重組。gam(redg)基因編碼抑制內源性核酸酶的Gam蛋白，Gam可保護外源的、轉化至所研 究的宿主菌中的雙鏈DNA片段免受內源性DNA酶的降解。在大腸桿菌中同源片段的長度可短至36個堿基對，這使得通過簡便易行的PCR的 手段來獲得線性雙鏈DNA分子并用于轉化大腸桿菌而實現基因敲除成為可能。Datsenko等研究人員于2000年報道了利用重組工程手段來實現大腸桿菌的基因敲除(Datsenko，K. Α. and B. L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(12) : 6640-5)。他們 將通過PCR獲得的、兩側含有同源臂(即與靶基因上下游5’端或3’端序列一致的一段堿基 序列)的抗性基因電轉化至經L-阿拉伯糖誘導而表達重組酶的大腸桿菌細胞中，通過一步 抗性篩選直接得到了靶基因敲除的大腸桿菌突變株。此研究產生了廣泛而深遠的影響，促 進了重組工程的研究和開發。 重組工程在常規的基因克隆和修飾方法難以進行或效率極低(如DNA片段過大、 難以尋找合適的酶切位點、DNA凝膠回收難以進行等等)時有著顯著的優勢。重組工程避免 了電泳、紫外照射(可引入異常突變)、凝膠回收、DNA連接、轉化、克隆篩選等等煩瑣耗時的 操作步驟，可實現高效的基因克隆和修飾。重組工程已逐漸成為常規基因克隆和修飾手段。重組工程最初是在大腸桿菌的遺傳操作中發生、發展和成熟，研究人員不斷地將 此技術運用于更多地用重要研究價值和實際應用價值的微生物菌種中，多數取得了令人滿 意的效果。但在不同的微生物中，同源片段的長度需加以調整，且需開發出不同的誘導和表 達重組酶的系統。

發明內容
針對上述問題，本發明提供了一種通過重組工程的方法來實現惡臭假單胞菌 KT2440高效快捷的基因敲除的方法。在本發明提供了一種運用簡便快捷的重組工程法來實現惡臭假單胞菌KT2440基 因敲除。含待敲除靶基因上下游的抗性基因的獲得是通過重疊一延伸PCR來獲得的。首 先分別采用PCR的方法擴增待敲除靶基因上游的同源基因、抗性基因和下游的同源基因， 分別在上游同源基因和抗性基因之間、抗性基因和下游基因之間設計重疊的堿基序列。將 所得的三個片段合并后作為模板，再用兩側的引物擴增得到融合的DNA片段。運用這種重 疊一延伸PCR技術可快速地獲得用于轉化至惡臭假單胞菌KT2440的線性DNA分子。在設 計基因敲除的引物時，考慮到待敲除的靶基因兩側的基因分布情形，實現靶基因的讀碼框 內敲除，使得靶基因敲除后所留下的卡那霉素抗性基因不造成極性效應，即不破壞靶基因 的相鄰基因的表達。本發明所采用的技術方案包括以下步驟
(1)通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應的手段擴增而獲得左右兩側分別為待敲除的靶基 因上下游各500個堿基對的同源基因、中間為卡那霉素抗性基因的DNA片段；
(2 )將含重組酶基因的質粒pLS512轉化至惡臭假單胞菌KT2440中，制成電轉化感受態 細胞；
(3)將步驟(1)的得到的DNA片段電轉化至以終濃度為2mM間甲基苯甲酸誘導重組酶 表達的步驟(2)的惡臭假單胞菌KT2440電轉化感受態細胞中，通過重組酶介導的同源片段 之間的同源重組，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接獲得了靶基因敲除的突變株。在得到的突變株中，可能會殘余微量的重組酶表達載體pLS512，對此，可通過濃度 為10%的蔗糖負篩選作用去除突變株中殘余的PLS512質粒。PLS512中含有編碼蔗糖6-果 糖轉移酶的sacB基因，sacB基因為負篩選標記，通過在培養基中添加濃度為10%的蔗糖去除含sacB基因的重組酶表達載體。重組酶基因選擇是來自于lambda噬菌體的exo，bet和gam，將這三個基因從lambda噬菌體DNA中擴增后，克隆至常規的高拷貝大腸桿菌克隆載體pBluescript KS(-)， 待測序正確后，從重組質粒上酶切回收，隨后與編碼6-果糖基轉移酶的sacB基因一起克隆 至可在惡臭假單胞菌KT2440中呈游離形式存在的、可自主復制的載體ρJB866之上，最終得 到重組酶表達載體PLS512。pLS512中重組酶基因置于受間甲基苯甲酸誘導的Pm啟動子之 下，這樣保證了重組酶短暫的、嚴謹性的誘導表達，避免了過分表達重組酶而導致的異常重 組的發生。sacB基因起到負篩選標記的作用，在含10%蔗糖培養基的情況下，sacB基因編 碼的6-果糖基轉移酶催化蔗糖形成對菌株有毒害的聚蔗糖，因此含有sacB基因表達的菌 株不能生存。如此可有效地去除突變株中殘余的微量PLS512，獲得具有良好遺傳背景的突 變株。優選實施例中的敲除惡臭假單胞菌KT2440基因組中的1. Okb, 7. 3kb和9. 3kb三 個實驗充分證明了本發明方法較常規所使用的方法的優越性即簡便、快捷和可同時進行 多個基因敲除的高通量操作。類似的，可采取與基因敲除同樣的策略實現基因敲入和基因 突變等等研究。


圖1是11910個堿基對的間甲基苯甲酸誘導重組酶表達的質粒pLS512的圖譜。其 中
469-598是受間甲基苯甲酸誘導的Pm啟動子序列； 599-1015是編碼抑制內源性核酸酶的gam基因的開放閱讀框序列； 1021-1806是編碼DNA單鏈結合蛋白的bet基因的開放閱讀框序列； 1803-2483是編碼DNA 5’ ->3外切酶的exo基因的開放閱讀框序列； 2491-3912是編碼6-果糖基轉移酶的基因的sacB基因的開放閱讀框序列； 4349-4958是雙向終止子區域；
5009-6157是調節基因trfA的開放閱讀框序列，trfA為質粒復制所必須；
6555-7080是質粒的復制子區域；
7654-8853是四環素抗性基因tetA的開放閱讀框序列；
8959-9609是調節基因tetR的開放閱讀框序列，tetR為tetA表達所必須；
10064-10174 RK2是質粒結合轉移功能片段
10714-11679是調節基因xylS的開放閱讀框序列，xylS為Pm活性所必須； 質粒圖上的Xbal，NsiI, EcoRI等為限制性酶切位點，括號內的數字表示限制性酶切位 點在質粒上的相對位置。圖2是擴增同源基因和抗性基因的重疊一延伸聚合酶鏈式反應(OE-PCR)以及此 片段用于惡臭假單胞菌KT2440基因敲除示意圖。基因表示待敲除的靶基因；上游和下游表示靶基因上游和下游的同源基因，Pl和 P2為擴增靶基因上游同源基因的引物，P3和P4為擴增卡那霉素抗性基因片段的引物，P5 和P6為擴增靶基因下游同源基因的引物，P2和P3、P4和P5含有重疊的堿基以利于重疊一 延伸PCR反應的進行；PCR表示聚合酶鏈式反應；重疊區以含斜線的方框表示；粗線條表示基因組上靶基因兩側片段。首先以Pl至P6為引物，PCR擴增出上游同源基因、卡那霉素抗 性基因和下游同源基因，隨后以三個片段為模板，Pl和P6為引物以重疊一延伸PCR擴增出 三個片段融合的DNA產物。DNA產物電轉化經2mM間甲基苯甲酸誘導重組酶表達的惡臭假 單胞菌KT2440/pLS512的電轉化感受態細胞，在卡那霉素的篩選作用下，經過轉化的DNA與 惡臭假單胞菌KT2440的基因組上的靶基因兩側的同源基因發生同源重組，卡那霉素抗性 基因取代了靶基因，最終獲得靶基因敲除的突變株。圖3是實施例2中PP_3948基因敲除所得突變株的基因型分析的凝膠電泳結果
1.DL2000 分子量標準2. 0，1. 0，0. 75，0. 5，0. 25，0. 1 kb ；
2.以變株的基因組為模板，擴增得到2.2kb片段；
3.以原株的基因組為模板，擴增得到2.25 kb片段；
4.2. 2 kb 以 PstI 酶切得到 0. 9kb 和 1. 3kb ；
5.2. 25 kb 以 PstI 酶切得到 0. 7kb 和 1. 5kb。圖4是實施例3中PP_1384基因敲除所得突變株的基因型分析的凝膠電泳結果
1.DL2000 分子量標準2. 0，1. 0，0. 75，0. 5，0. 25，0. 1 kb ；
2.以變株的基因組為模板，擴增得到2.1kb片段；
3.2. 1 kb 以 PstI 酶切得到 0. 3，0. 6kb 和 1. 2kb ；
4.2. 1 kb 以 NcoI 酶切得到 0. 8kb 和 1. 3kb ；
(注在所使用的PCR條件下，引物從原株KT2440的基因組中不能擴增出產物，故未加 原株的PCR結果)。圖5是實施例4中PP_2064基因敲除所得突變株的基因型分析的凝膠電泳結果
1.DL2000 分子量標準2. 0，1. 0，0. 75，0. 5，0. 25，0. 1 kb ；
2.以變株的基因組為模板，擴增得到2.1kb片段；
3.2. 1 kb 以 NcoI 酶切得到 0. 9kb 和 1. 2kb ；
4.2. Ikb 以 PstI 酶切得到 0. 8kb 和 1. 3kb ；
(注在所使用的PCR條件下，引物從原株KT2440的基因組中不能擴增出產物，故未加 原株的PCR結果)。
具體實施例方式在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常 理解的含義。下面結合具體的實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施 例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相 同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。實施例中所用到的菌株和質粒，均為已公開的 菌株和質粒
1. Escherichia coli DH10B。基因型 F crA D (mrr-hsdMS-mcrBC) f80 d7acZDM15 D7acX74 deoR reckl araD139D (ara, leu) 7697 galM gaVk rpsL end Al nupQ. ο 文獻Life Technologies, Inc. Focus, 1990, 12:19。購自美國 Invitrogen 公司。2. Pseudomonas putida KT2440。文獻Nelson KE, Weinel C, Paulsen IT et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environ Micr obiol 2002, 4:799—808。* 自 _ 國 The Institute for Genomic Research 的 Karen Nelson 博士。3. pBluescript II KS(-) 。tj^ :Alting_Mees MA, Short Jl. pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res. 1989，17(22) :9494.購自美國 Novagen 公 司。4. pEXlOOTlink。文獻Quenee L, Lamotte D, Polack B. Combined sacB-based negative selection and cre-lox antibiotic marker recycling for efficient gene deletion in pseudomonas aeruginosa. Biotechniques. 2005, 38 (1) : 63-7.來自法國 Centre Hospitalier Universitaire 的 Benoit Polack 教授。5. pJB866。文獻:Blatny JM, Brautaset Τ, Winther-Larsen HC, et al. Improved broad-host-range RK2 vectors useful for high and low regulated gene expression levels in gram-negative bacteria. Plasmid. 1997, 38 (1) : 35-51.來自 H 威 Norwegian University of Science and Technology 的 Svein Valla 教授。6. pKD4。 文 獻Datsenko ΚΑ, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K—12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA. 2000，97(12) : 6640-5.來自美國 Purdue 大學 Barry Wanner 的教授。7. pGEM-T easy，購自美國 Promega 公司。實施例1.間甲基苯甲酸誘導重組酶表達的質粒的構建 1.大腸桿菌DHlOB的電轉化感受態的制備和DNA轉化
自平板上接種新鮮劃線培養的單菌落至2ml LB液體培養基中37°C振蕩過夜，以1/50 體積轉至50 ml LB,振蕩培養至菌體OD6tltl約為0.6。將菌液倒入預冷的離心管，冰浴10分 鐘，4°C，5000rpm離心5分鐘，棄上清。以10%的甘油洗滌沉淀兩次，最后懸浮于200ml的 10%甘油中，50ml每管分裝。將溶解于TE緩沖液或雙蒸水的DNA加至50ml冰上融化的DHlOB的電轉化感 受態細胞中，輕彈混勻。將混合液轉移至冰上預冷的Imm電轉杯中，電擊轉化。電轉化條件 200 Ω，1800 V，Bio-Rad公司Gene Pulser IIk電轉化儀。加Iml LB液體培養基至電轉杯， 吹打混勻，將溶液轉移至一個無菌的1. 5ml eppendorf管中，37°C振蕩培養60分鐘后，轉化 液涂布在相應抗生素的抗性平板上，37°C培養。挑取單菌落，在含相應抗生素的液體培養基 中培養，提取質粒進行酶切和測序鑒定。LB培養基的組成(％):蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，固體培養時加1. 5% (w/v)的瓊脂。115。C 滅菌 20min。TE緩沖液的組成IOmM三羥甲基氨基甲烷的鹽酸鹽，ImM 二胺四乙酸的二鈉鹽，pH 8. O。聚合酶鏈式反應(PCR)
設立50ml的PCR反應體系，分別加入 37. 7 ml dd H2O ；5 ml IOXPCR反應緩沖液；
4 ml 25 mM MgCl2 ；
1 ml 10 mM dNTP ；
0. 5 ml上游引物(終濃度0. 5mM)；
0. 5 ml下游引物(終濃度0. 5mM)；
1 ml模板(質粒50ng，基因組DNA 200ng)；
0.3ml Ex-Taq 聚合酶(5U/ml)。PCR反應程序為首先在97° C變性處理5分鐘，循環的條件為97° C 45秒， 60° C 1分鐘，72° C 1-2分鐘(視目的產物大小而定)，共30個循環。最后在72 ° C延 伸10分鐘。使用儀器為Bio-rad公司的PTC-200型號的PCR儀。反應完畢后，以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠中加入20 mg/ml的溴化乙錠的。 PCR產物沉淀回收加1/10體積3M pH 5. 2醋酸鈉及2倍體積冰乙醇，混勻，_80°C冷凍5 min，13200 rpm離心10分鐘，棄上清， 加500 ml 70%乙醇洗滌，13200 rpm離心5分鐘，棄 上清，室溫至干，加適量體積的無菌水溶解。質粒構建
設計引物 NRl 5' - GGGGAGCTCCATGGATATTAATACTGAAACTG-3，，(SEQ ID NO. 1) ；NR2 5，-GGGTCTAGAGTCATCGCCATTGCTCCCCAAATAC -3，，(SEQ ID NO. 2)。以 lambda 噬菌體 DNA (購自大連寶生物公司)為模板，PCR擴增出1. 9kb的重組酶基因(gam，exo和bet)片段， 以SacI和XbaI酶切后克隆至pBluescript II KS(-)的SacI和XbaI位點，得到重組克隆 PNcRed0設計引物SAKl 5' - GGGTCTAGATTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3，，(SEQ ID N0. 3)； SAK2 5' - GGGGGATCCGGCAACTTTATGCCCATGCAAC-3，，(SEQ ID N0. 4)。以 pEXlOOTlink 為 模板，PCR擴增出1. 9kb的sacB基因片段，以XbaI-BamHI酶切后克隆至pBluescript II KS(-)的XbaI和BamHI位點，得到重組克隆pKsacB。NcoI和XbaI酶切pNcRed，分離1. 9kb的重組酶基因片段；XbaI和BamHI酶切 pKsacB，分離1. 9kb的sacB基因片段。兩片段和以AflIII和BamHI酶切并通過堿性磷酸 酯酶去磷酸化的載體PJB866相連。NcoI和AflIII為同尾酶，二者所作用于DNA所產生的 粘性堿基末端相連后，二個的酶切位點均消失。經四環素抗性篩選，提質粒酶切驗證，最終 得到間甲基苯甲酸誘導重組酶表達的質粒PLS512。pLS512的質粒圖譜如說明書附圖中的 圖1所示。實施例2.惡臭假單胞菌KT2440基因組PP_3948基因1. Okb片段的敲除
1.惡臭假單胞菌KT2440電轉化感受態細胞的制備和PLS512的轉化
從儲存于_70°C的惡臭假單胞菌KT2440凍存管中劃線至LB固體培養基，過夜培養，挑 取單菌落至2ml EM液體培養基中30°C振蕩過夜，以1/50體積轉至50 ml EM培養基，振蕩 培養至菌體0D_約為0. 6。將菌液倒入預冷的離心管，冰浴10分鐘，4°C，7000rpm離心5分 鐘，棄上清。以冰冷的3 mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，pH=7. 0)液洗滌菌體3次，菌體 濃縮300倍，50ml分裝并用于一次電轉化。pLS512的轉化將溶解于TE緩沖液的pLS512加至50ml的感受態細胞，輕彈混 勻。將混合液轉移至冰上預冷的Imm電轉杯中，電擊轉化。電轉化條件1. 2 kV，200 Ω，Bio-Rad公司Gene Pulser IIk電轉化儀。電轉化后，以1 mL SOC培養基懸浮，轉至15 ml 聚丙烯離心管，30°C振蕩培養培養2 h，涂布至含10mg/ml四環素的LB平板。EM培養基的組成(％):蛋白胨2g，酵母膏5g，氯化鈉5g，葡萄糖5g，pH7. 3，115°C 滅菌20min。

SOC培養基的組成(％)蛋白胨2. Og ；酵母提取物0. 5g ；氯化鈉0. 05g,氯化鉀 0. 019g，pH 7. O。115°C滅菌20min。使用前加入單獨無菌的IM氯化鎂溶液1ml，單獨無菌 的IM硫酸鎂溶液Iml和過濾除菌的20%葡萄糖溶液2ml。誘導重組酶表達的惡臭假單胞菌KT2440/pLS512的電轉化感受態細胞的制備和 DNA轉化
自含10mg/ml四環素的LB平板上挑取KT2440/pLS512單菌落，接至2ml含10mg/ml四 環素的EM液體培養基中30°C振蕩過夜，以1/50體積轉至相同培養基，振蕩培養至菌體0D_ 約為0. 2時，加入終濃度為2mM的間甲基苯甲酸，繼續培養至0D600約為0.6。后續的操作 與KT2440電轉化感受態細胞的制備和DNA的轉化的方法相同。3. PP_3948 基因敲除
設計引物PCR擴增含同源片段的卡那霉素抗性基因。R401 5' -GC CGGCGCCGCCGGCCGCAATATC，(SEQ ID NO. 5 ) ；R4O 2 5‘ -CCGGTTCGCTT GCTGTCCATACAGCGAGGTACGGATGCCAGT，(SEQ ID NO. 6 ) ；R403 5' -CA CTGGCATCCGTACCTCGCTGTATGGACAGCA AGCGMCCGG, (SEQ ID NO. 7);R404 5' -CTGCACCGCACG CGACAGCAGCATCAGAAGAACTCGTCA AGA AG, (SEQ ID NO. 8);R405 5' -CTTCTTGACGAGTTCTTCT GATGCTGCTGTC GCGTGCGGTGCAG, (SEQ ID NO. 9)； R406 5'-GGGCCGGGTATGCGGCTGC CATTG, (SEQ ID NO. 10)。R402與R403有43個堿基對的重疊，R404與R405有44個堿基對的重 疊，均以反向互補的形式呈現。以惡臭假單胞菌KT2440基因組DNA為模板，R401和R402為引物，PCR擴增得到 PP_3948基因上游500bp的DNA片段；R405和R406為引物，PCR擴增得到PP_3948基因下 游500bp的DNA片段。以含卡那霉素抗性基因的pKD4質粒為模板，R403和R404為引物， PCR擴增得到0. 9kb的卡那霉素抗性基因片段。分別凝膠回收這三個片段，各20ng的三個 片段為模板，R401和R406為引物，通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應(OE-PCR)擴增得到三個 片段融合的1.9kb的DNA片段。轉化2mg的1. 9kb的DNA片段，在卡那霉素抗性篩選之下，得到抗性轉化子。經三 次實驗，平均可獲得210個轉化子。在沒有加間甲基苯甲酸進行誘導的對照實驗中，沒有或 僅有一兩個抗性轉化子的出現，這表明間甲基苯甲酸誘導表達的重組酶所催化的同源重組 是得到重組菌株的決定因素。設計引物以菌落PCR的方法來驗證卡那霉素抗性敲入至基因組所得 變株的基因型。R407 5' -GGCCCCAAGTACGGCTGCGGC, (SEQ ID N0. 11) ；R408 5，-CCACGCGGGTACGCCACTTC, (SEQ ID N0. 12。R407 位于 R401 上游 lOObp，R408 位于 R406 下游200p。隨機挑取10個抗性菌落，以其基因組為模板，R407和R408為引物，PCR擴增 發現所用的菌落均得到2. 2 kb的擴增片段，而以原株的基因組為模板擴增得到2. 25 kb片 段。2.2吐和2.25 kb兩個片段的酶切結果與預期完全一致。擴增同源片段和抗性基因的重疊一延伸聚合酶鏈式反應(OE-PCR)以及此片段用于惡臭假單胞菌KT2440基 因敲除示意圖見圖2。PP_3948基因敲除的實驗結果圖見圖3。隨機挑取兩個變株的擴增產物，克隆至pGEM-T easy后，測序發現序列與預期完全 一致。證明惡臭假單胞菌KT2440基因組中PP_3948基因中1. Okb的片段被敲除。從重組菌株中的消除
PLS512中sacB基因編碼6-果糖基轉移酶，此酶催化蔗糖為對假單胞菌有毒害作用的 果聚糖，含有PLS512的菌株不能在含有蔗糖的培養基上生長，因此在蔗糖的負篩選作用下 可得到PLS512消除的菌株。將含有pLS512的重組菌株劃線于含10%蔗糖的LB固體平板上，30°C培養過夜，挑 取單菌落至LB液體培養基中培養至對數生長期，以1χ10_6稀釋后涂布LB固體平板，隨機挑 取30個單菌落至無抗LB平板和含四環素的抗性LB平板，過夜培養發現所有的菌落均只能 在無抗LB平板上生長，而不能在含四環素抗性的LB平板上生長，這些四環素敏感性菌株即 為PLS512消除的菌株。實施例3.惡臭假單胞菌KT2440基因組PP_1384至PP_1388 7. 3kb片段的敲除 誘導重組酶表達的惡臭假單胞菌KT2440/pLS512的電轉化感受態細胞的制備和DNA轉
化同實施例2。設計引物PCR擴增含同源片段的卡那霉素抗性基因。KSDl 5'-GTCGACGA AGTTGCGGTTGATG, (SEQ ID NO. 13) ；KSD2 5' -CCGGTTCGCTTGCTGTC CATATGATCGGCCTTGTTGCMAAGC, (SEQ ID NO. 14)； KSD3 5' -GCTTTT GCAACAAGGCCGATCATATG GACAGCAAGCGAACCGG,(SEQ ID NO. 15);KSD4 5' - GAC AAAACAAGGTATTCCCGTGTCAGAAGAACTCG TCAAGAA G,(SEQ ID NO. 16);KSD5 5' -CTTCTTGACGAGTTCTTCTGACACGGGMTA CCTTGTTTTGTC, (SEQ ID NO. 17)； KSD6 5'-GCGTGCCGACATTGGGTCG AAC，(SEQ ID NO. 18)。KSD2 與 KSD3之 間以及KSD4與KSD5之間均有43個堿基對的重疊，且均以反向互補的形式呈現。以惡臭假單胞菌KT2440基因組DNA為模板，KSDl和KSD2為引物，PCR擴增得到 PP_1384基因上游500bp的DNA片段；KSD5和KSD6為引物，PCR擴增得PP_1388基因下游 500bp的DNA片段。以含卡那霉素抗性基因的pKD4質粒為模板，KSD3和KSD4為引物，PCR 擴增得到0. 9kb的卡那霉素抗性基因片段。分別凝膠回收這三個片段，以分別為20ng的這 三個片段為模板，KSDl和KSD6為引物，通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應(OE-PCR)擴增得到 三個片段融合的1. 9kb的DNA片段。轉化2mg的DNA片段，在卡那霉素抗性篩選之下，得到抗性轉化子。經三次實驗， 平均可獲得156個轉化子。在沒有加間甲基苯甲酸進行誘導的對照實驗中，沒有或僅有一 兩個抗性轉化子的出現，與實施例2相同，這表明了間甲基苯甲酸誘導表達的重組酶所催 化的同源重組是得到重組菌株的決定因素。設計引物以菌落PCR的方法來驗證卡那霉素 抗性敲入至基因組所得變株的基因型。KSD7:5'- TGAAACCGGAACGGGCATCGAG, (SEQ ID NO. 19);KSD8 5' - AGGGTGATCAGAGCGAAGTCC, (SEQ ID NO. 20)。KSD7 位于 KSDl 上游 lOObp， KSD8 位于 KSD6 下游 100bp。隨機挑取10個抗性菌落，以其基因組為模板，KSD7和KSD8為引物，PCR擴增發現 所用的菌落均得到2.1 kb的擴增片段，而以原株的基因組為模板不能擴增出產物。2.1 kb 酶切結果與預期完全一致。PP_1384至PP_1388之間7. 3kb片段敲除的實驗結果圖見圖4。隨機挑取兩個變株的擴增產物，克隆至pGEM-T easy后，測序發現序列與預期完全一致。證明惡臭假單胞菌KT2440基因組中PP_1384至PP_1388之間的7. 3kb片段被完全 的敲除。pLS512從重組菌株中的消除同實施例2。實施例4.惡臭假單胞菌KT2440基因組PP_2064至PP_2069 9. 3kb片段的敲除 誘導重組酶表達的惡臭假單胞菌KT2440/pLS512的電轉化感受態細胞的制備和DNA轉
化同實施例2。 設計引物PCR擴增含同源片段的卡那霉素抗性基因。KAEl 5'-TGTGTCTG CGCTTATGAATCG, (SEQ ID NO. 21) ；KAE2 5'-CCGGTTCGCTTGCTGTCC ATACATGCACAGCTCCGATCACAGG, (SEQ ID NO. 22) ；KAE3 5' - CCTGT GATCGGAGCTGTGCATG TATGGACAGCAAGCGAACCGG,(SEQ ID NO. 23) ；KAE4 5' - CGACCTTTGAGCGACAATCGTGTCAGAA GAACTCGTCAAG AAG，(SEQ ID NO. 24) ；KAE5 5' - CTTCTTGACGAGTTCTTCTGACACGATTGTCG CTCAAAGGTCG, (SEQ ID NO. 25) ；KAE6 5' -TGATCCTGTACGAACTCGCC G, (SEQ ID N0. 26)。 KAE2與KSD3之間以及KAE 4與KAE 5之間均有43個堿基對的重疊，且均以反向互補的形 式呈現。以惡臭假單胞菌KT2440基因組DNA為模板，KAEl和KAE2為引物，PCR擴增得到 PP_1384基因上游500bp的DNA片段；KAE5和KAE 6為引物，PCR擴增得PP_1388基因下游 500bp的DNA片段。以含卡那霉素抗性基因的pKD4質粒為模板，KAE3和KAE4為引物，PCR 擴增得到0. 9kb的卡那霉素抗性基因。分別凝膠回收這三個片段，以分別為20ng的這三個 片段為模板，KAEl和KAE6為引物，通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應(OE-PCR)擴增得到三 個片段融合的1. 9kb的DNA片段。轉化2mg的DNA片段，在卡那霉素抗性篩選之下，得到抗性轉化子。經三次實驗， 平均可獲得92個轉化子。在沒有加間甲基苯甲酸進行誘導的對照實驗中，沒有或僅有一兩 個抗性轉化子的出現，與實施例2和實施例3相同，這表明了間甲基苯甲酸誘導表達的重組 酶所催化的同源重組是得到重組菌株的決定因素。設計引物以菌落PCR的方法來驗證卡那霉素抗性敲入至基因組所得 變株的基因型。KAE7 :5，-GATTGGGTCGTTCAGGCAGTAG，(SEQ ID N0. 27) ；KAE8 5' -TGCTGCGCGAACTGATCCTGG, (SEQ ID N0. 28)。KAE7 位于 KAE 1 上游 lOObp，KAE8 位于 KAE 6 下游 100bp。隨機挑取10個抗性菌落，以其基因組為模板，KAE 7和KAE 8為引物，PCR擴增發 現所用的菌落均得到2.1 kb的擴增片段，而以原株的基因組為模板不能擴增出產物。2.1 kb酶切結果與預期完全一致。PP_2064至PP_2069之間的9. 3kb片段敲除的實驗結果圖見 圖4。隨機挑取兩個變株的擴增產物，克隆至pGEM-T easy后，測序發現序列與預期完全 一致。證明惡臭假單胞菌KT2440基因組中PP_2064至PP_2069之間的9. 3kb片段被完全 的敲除。pLS512從重組菌株中的消除同實施例2。
權利要求
1.一種惡臭假單胞菌KTM40高效的基因敲除方法，其特征在于，包括以下步驟(1)通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應的手段擴增而獲得左右兩側分別為待敲除的靶基 因上下游各500個堿基對的同源基因、中間為卡那霉素抗性基因的DNA片段；(2 )將含重組酶基因的質粒pLS512轉化至惡臭假單胞菌KTM40中，制成電轉化感受態 細胞；(3)將步驟(1)的得到的DNA片段電轉化至以終濃度為2mM間甲基苯甲酸誘導重組酶 表達的步驟(2)的惡臭假單胞菌KTM40電轉化感受態細胞中，通過重組酶介導的同源片段 之間的同源重組，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接獲得了靶基因敲除的突變株。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于將步驟(3)得到的靶基因敲除的突變株通過 濃度為10%的蔗糖負篩選作用去除突變株中殘余的質粒PLS512。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，重組酶基因是來自于lambda噬菌體的exo， bet和gam基因，重組酶基因是克隆在受間甲基苯甲酸誘導的啟動子之下，含重組酶基因的 質粒pLS512游離于惡臭假單胞菌KTM40的基因組。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，重組酶表達載體中含有編碼蔗糖6-果糖轉 移酶的sacB基因，sacB基因為負篩選標記，通過在培養基中添加濃度為10%的蔗糖去除含 sacB基因的重組酶表達載體。
全文摘要
本發明涉及一種通過重組工程手段對惡臭假單胞菌KT2440進行基因敲除的方法。具體方法是首先通過重疊－延伸聚合酶鏈式反應的手段擴增而獲得左右兩側分別為待敲除的靶基因上下游各約500個堿基對的同源基因，中間為卡那霉素抗性基因的DNA片段。再將此DNA片段電轉化至以終濃度為2mM間甲基苯甲酸誘導重組酶表達的惡臭假單胞菌KT2440電轉化感受態細胞中，通過重組酶介導的同源片段之間的同源重組，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接獲得了靶基因敲除的突變株。本發明所述方法簡便快捷，可成為在生物降解有機化合物等方面有著重要應用價值的環境微生物惡臭假單胞菌KT2440的遺傳操作手段。
文檔編號C12N15/54GK102071185SQ20101057520
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月6日 優先權日2010年12月6日
發明者宋杰, 尚廣東, 楊運文, 高九彩 申請人:南京師范大學