專利名稱：K88大腸桿菌不同血清型的pcr特異性檢測和分型鑒別方法
技術領域：
本發明涉及同種細菌不同血清型的檢測方法，具體涉及K88大腸桿菌三種血清型 K88ab、K88ac以及K88ad的特異性檢測和分型鑒別方法。
背景技術：
產腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenic五coh·，ETEC)是人及動物腹瀉病的主要 病原。ETEC的主要致病因子分為細菌粘附素和腸毒素兩部分，病原致病菌通過前者黏附到 易感宿主腸道上皮細胞并定殖，進而釋放腸毒素導致腹瀉。絕大多數新生仔豬和剛斷奶豬 的腹瀉病就是由表達K88粘附素性菌毛的ETEC病原致病菌導致的。K88菌毛有三種血清型， 即K88ab，K88ac和K88ad，它們在豬腸道上皮細胞結合性能上有所不同，即對于不同的易感 宿主受體有特異的結合特性。目前臨床上對K88大腸桿菌的血清型檢測和鑒定首先利用抗 共同的a單因子血清進行玻板或試管凝集試驗確認陽性反應并鑒定為K88大腸桿菌后，再 分別與抗b、c、d三種不同抗原表位的單因子血清進行玻板或試管凝集試驗，依據與各自單 因子反應，最后鑒定為K88大腸桿菌相應的血清型即K88ab，K88ac或K88ad。用于凝集試 驗的a因子制作相對簡易，而b、c、d三種不同抗原表位的單因子血清制備過程卻甚為繁瑣， 耗時耗力，成本不菲。值得注意的是許多標準株和絕大多數臨床分離株都需要篩選特殊的 培養基并需要在實驗室連續培養傳代并在適宜的環境下(如溫度、PH值等)，其K88粘附素 才能較為充分表達，而未經上述方法處理的菌株其粘附素在體外培養條件下不能達到一定 程度的表達，因而采用單因子血清進行玻板或試管凝集試驗檢測K88粘附素，尤其是特異 性檢測和分型鑒別三種血清型K88ab、K88ac以及K88ad時，因K88大腸桿菌與相應單因子 血清不能產生肉眼可見的凝集反應，基于檢測菌毛的玻板或試管凝集試驗和應用受到很大 限制。
發明內容
本發明的目的在于提供一種快速、簡便、特異性強、適合臨床使用的PCR特異性檢 測方法，對臨床分離到的K88細菌進行血清型檢測和分型鑒定。本發明的原理與K88菌毛生物合成相關的多肽共有十種，分別從FaeA到FaeJ (FaeA^FaeJ),由操縱子基因fae(包括A J 一組共10個基因族)編碼(faeA、faeB基因NCBI 檢索號為X77671 ；faeC基因NCBI檢索號為AF450247 ；faeD基因NCBI檢索號為X56002 ； faeE、faeF、faeG 基因的 NCBI 檢索號為 Zl 1699 S46307 ；faeH、fael、faej 基因的 NCBI 檢 索號為Z11700 S46743)。其中FaeG為K88菌毛的粘附素和主要亞單位，并且含有與易感 宿主小腸細胞特異受體相結合位點。已知的基因序列信息和比較分析表明，K88ab、K88ac、 K88ad三種血清型的基因序列差異僅存在于基因faeG上。鑒于基因faeG的上述特有特征， 在基因faeG的保守區域設計上下游共用引物用于檢測K88大腸桿菌，上游引物為AM005和 下游引物為AM006 ；采用同樣一致的上游引物AM005，而在多變區域設計三組分別針對K88
3三個血清型特異的下游引物FM007 (ab)、FM008 (ac)、FM009 (ad)，用于檢測K88三個不同 血清型大腸桿菌。通過制備各種待檢細菌的DNA模板用于PCR檢測，分別采用一對共用上 下游引物和三對不同的下游引物在合適的PCR參數和體系下分別同時進行PCR擴增試驗， 根據擴增出與預期大小相一致的條帶，最后鑒定為K88大腸桿菌和對應不同血清型K88ab、 K88ac或K88ad的大腸桿菌。本發明所采用的技術方案是包括以下步驟
(1)K88大腸桿菌PCR特異性檢測以SEQID NO 1和SEQ ID NO 2的序列為引物，對 待測樣本DNA模板進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，出現750bp條帶的為待測樣 本為K88大腸桿菌；
(2)分型鑒別以步驟1確定為K88大腸桿菌的待測樣本的DNA為模板，分別用下述3 對引物進行PCR擴增
第1對上游引物序列如SEQ ID NO :1，下游引物序列如SEQ ID NO 3 ； 第2對上游引物序列如SEQ ID NO :1，下游引物序列如SEQ ID NO 4 ； 第3對上游引物序列如SEQ ID NO :1，下游引物序列如SEQ ID NO 5 ； 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，根據出現500bp條帶所對應的引物來判斷待測樣本血清
型
由第1對引物擴增出500bp條帶的，待測樣本血清型為K88ab ； 由第2對引物擴增出500bp條帶的，待測樣本血清型為K88ac ； 由第3對引物擴增出500bp條帶的，待測樣本血清型為K88ad。本發明的優點在于
1.用于檢測不同血清型K88ab、K88ac和K88ad標準株和臨床分離株，該PCR檢測方法 得出的分型結果準確無誤，且沒有假陽性和相互交叉反應的發生。2.從細菌培養、制備細菌染色體DNA模板用于PCR分型檢測到獲取結果，整個過程 只需要18個小時，操作方法也很簡便，可同時檢測多個樣品，能夠滿足臨床快速診斷和一 次檢測大量樣品的要求。3.該檢測方法所需的試劑及設備成本較低，設計合成的檢測引物-20°C可以長期 保存，能多次使用。
圖1 K88大腸桿菌標準株的PCR分型檢測
泳道1、6為K88ab標準株C83901，泳道2、7為K88ac標準株C83902,泳道3、8為K88ad 標準株C83903，泳道4、9為K99標準株，泳道5、10為987P標準株；所有泳道均用AM005作 為上游引物，泳道廣5均用AM006作為下游引物，泳道6、分別用MF007、MF008、MF009作為 下游引物，泳道9用MF007作為下游引物，泳道10用MF008作為下游引物。圖2 三種MF引物的特異性
泳道廣3為K88ab標準株C83901，泳道4 6為K88ac標準株C83902，泳道7 9為K88ad 標準株C83903 ；所有泳道均用AM005作為上游引物，泳道1、4、7用MF007作為下游引物，泳 道2、5、8用MF008作為下游引物，泳道3、6、9用MF009作為下游引物。
具體實施例方式本發明的PCR檢測方法所用引物的核苷酸序列如下
AM005 (SEQ ID NO :1):5，-GGTGATTTCAATGGTTCGGTC-3，(21bp)，對應三種血清型相同 的上游保守區域
AM006 (SEQ ID NO :2):5，-AATGCTACGTTCAGCGGAGCG-3，(21bp)，對應三種血清型相同 的下游保守區域
MF007 (SEQ ID NO :3):5，-TGCAGCACCCGAAACAGTCGTCGT-3，(24bp)，對應 ab 血清型特 異的下游區域
MF008 (SEQ ID NO :4):5，-CCCAGCCGACGATTCAGAACCCCT-3，(24bp)，對應 ac 血清型特 異的下游區域
MF009 (SEQ ID NO :5):5，-TGCAGAATTCTGAACATTCGTCGG-3，(24bp)，對應 ad 血清型特 異的下游區域。本發明檢測方法過程如下
1. 制備待檢樣品的染色體DNA模板將待檢細菌單菌落接種于LB液體培養基中， 過夜振搖培養12h，離心棄除含LB培養基的上清液，用超純水洗滌兩次后用100 μ 1超純水 懸浮于指形管中，置于100°C沸水中水浴5分鐘，4°C 10000rpm/min離心10分鐘，取50 μ 1 上清做PCR模板。2. PCR擴增及產物檢測50μ 1擴增體系包含了 IXPCR緩沖液，0. 2mM dNTP， 上下游引物各1πιΜ，5μ 1待檢樣品PCR模板以及1單位的商品化rTaq酶。擴增循環參數為 94°C 預變性 4min; 94 °C 30s, 56 °C 30s，72°C lmin，25 個循環；72°C 延伸 lOmin。取 5μ1 PCR產物在1. 2%瓊脂糖膠中以90V恒定電壓電泳40min，溴乙錠EB染色，以DL2000 DNA MarkerCTAKARA公司)為標準分子量分析結果，能擴增出預期大小為750bp和500bp左右條 帶的PCR產物，它們分別為K88大腸桿菌和對應于相應的不同血清型K88ab、K88ac或K88ad 大腸桿菌。實施例1: K88大腸桿菌標準株的檢測和分型鑒別
K88ab、K88ac和K88ad三種血清型大腸桿菌標準株分別為C83901株、C83902株和 C83903株，分別購自中國獸藥監察所菌種保藏中心；K99、987P大腸桿菌標準株用于陰性對 照設置，商品化購置于中國獸藥監察所菌種保藏中心，由本實驗室保存。以ΑΜ005/ΑΜ006 —對上下游引物，Κ88大腸桿菌三種血清型標準株均可擴增出預 期為750bp左右大小的條帶，而K99及987P標準株無任何條帶，其它多種大腸桿菌和沙門 氏菌等革蘭氏陰性細菌也無任何條帶，表明AM005/AM006適用于K88菌毛基因的特異性檢 測；以AM005與對應K88不同的血清型的下游引物MF配對時，K88標準株能擴增出預期為 500bp左右的條帶，分別相對應于單一血清型(K88ab、K88ac或K88ad的一種)，而K99及 987P標準株無任何條帶。如圖1所示。值得注意的是，引物MF007、MF008和MF009分別特異性地對應K88ab、K88ac和 K88ad三種血清型，任一 K88標準血清型大腸桿菌用其他兩種MF引物與AM005配對使用時， 無法擴增出500bp的特異性條帶。如圖2所示。實施例2 臨床分離株的檢測和分型鑒別
從我們收集和鑒定的223株腸道腹瀉大腸桿菌菌株，進一步在實驗室體外培養和連續
5傳代(至少10代以上)，對上述所有菌株通過K88a單因子血清進行凝集試驗確認陽性反應 并鑒定為K88，共計23株，進一步分別與抗b、c、d三種不同抗原表位的單因子血清進行試 管凝集試驗鑒定，確定血清型K88ab為5株，K88ac為12株，K88ad為6株。在PCR檢測和 分型鑒別上述23株大腸桿菌試驗中，全部采用雙盲試驗。試驗中，先用引物AM005/AM006 進行PCR檢測。結果23株分離株中所有菌株均擴增出750bp的條帶，表明帶有K88菌毛基 因。再用AM005和不同的三個下游引物MF分別對這23株K88細菌進行分型檢測，結果5 株細菌有為K88ab血清型，12株為K88ac血清型，6株為K88ad，結果與單因子血清凝集試 驗鑒定相同。
權利要求
一種K88大腸桿菌不同血清型的PCR特異性檢測和分型鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟(1)K88大腸桿菌PCR特異性檢測以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的序列為引物，對待測樣本DNA模板進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，出現750bp 條帶的為待測樣本為K88大腸桿菌；(2)分型鑒別以步驟1確定為K88大腸桿菌的待測樣本的DNA為模板，分別用下述3對引物進行PCR擴增第1對上游引物序列如SEQ ID NO1，下游引物序列如SEQ ID NO3；第2對上游引物序列如SEQ ID NO1，下游引物序列如SEQ ID NO4；第3對上游引物序列如SEQ ID NO1，下游引物序列如SEQ ID NO5；擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，根據出現500bp 條帶所對應的引物來判斷待測樣本血清型由第1對引物擴增出500bp 條帶的，待測樣本血清型為K88ab；由第2對引物擴增出500bp 條帶的，待測樣本血清型為K88ac；由第3對引物擴增出500bp 條帶的，待測樣本血清型為K88ad。
全文摘要
本發明涉及K88大腸桿菌不同血清型的檢測方法。該方法是先對待測樣本進行PCR特異性檢測，出現750bp條帶的為待測樣本為K88大腸桿菌，再分別用3對特異性引物對K88大腸桿菌DNA進行PCR擴增，根據擴增產物的500bp條帶判斷血清型。本發明的方法不僅分型結果準確無誤，且沒有假陽性和相互交叉反應的發生，還具有操作簡便，可同時檢測多個樣品，成本較低的優點。
文檔編號C12Q1/68GK101979664SQ201010574869
公開日2011年2月23日 申請日期2010年12月6日 優先權日2010年12月6日
發明者包文斌, 吳圣龍, 姚豐華, 朱軍, 朱國強, 朱春紅, 朱曉芳, 王建業, 羊揚, 舒燕, 郁磊 申請人:揚州大學