專利名稱：一種鑒別鵝品種的方法
技術領域：
本發明涉及一種鵝品種鑒別方法，特別涉及通過微衛星熒光標記全自動基因分型 技術鑒別鵝品種的方法，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
我國是世界養鵝大國，年出欄量占世界的70%，我國也是世界鵝品種資源最豐富 的國家之一，擁有26個地方品種資源，近年來，隨著市場經濟的不斷發展，在鵝的生產與經 營、新品種培育和品種權益保護以及流通加工等領域急需快速高效的鵝品種鑒定方法，目 前鑒定家禽品種主要有形態鑒定、同工酶鑒定、簡單重復序列(Simple sequence repeat, SSR)鑒定等。然而上述方法均存在不同程度的局限性，如形態特征易受環境影響，可靠性 差；同工酶、SSR標記分辨率較低，對于親緣關系較近的品種間往往無法區分，其重復性也 差。微衛星熒光標記全自動基因分型技術是新近發展起來的一項檢測技術，該技術是利用3 種不同顏色的熒光染料標記微衛星引物，可以將多種不同熒光標記和不同擴增片段的產物 在同一加樣孔中電泳，并且可將待測產物與內在分子量標準同時上樣，通過序列凝膠電泳， GeneMapper軟件進行圖像分析，精確計算出微衛星等位基因片段大小。
發明內容
本發明目的在于提供一種鵝品種鑒別的方法，其主要通過微衛星熒光標記全自動 基因分型技術對鵝品種進行鑒定。本發明以DNA全自動基因分析儀為平臺，結合熒光-多重PCR技術，采用 GeneScan-500標準，對不同鵝品種個體進行掃描，獲得不同品種特有等位基因，構建鵝STR 標準遺傳圖譜，根據待檢測樣本的STR圖譜與標準圖譜比較，鑒定待測樣本的品種真實性。本發明的技術方案包括如下步驟(1)鵝短串聯重復序列(short tandem repeats, STR)標準遺傳圖譜構建提取來自國家級保種場的鵝品種基因組DNA，將下述10對STR引物，采用熒光標 記，結合多重PCR技術對基因組DNA進行擴增，通過ABI 3730XLDNA全自動基因分析儀對不 同個體進行掃描，以GeneScan-500為標準內參，利用GeneMapper 4. 0軟件進行圖像分析， 精確測量出微衛星等位基因片段大小，獲得不同品種特有等位基因，并構建不同品種鵝的 STR標準遺傳圖譜；第1對引物序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示；第2對引物序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示；第3對引物序列如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示；第4對引物序列如SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8所示；第5對引物序列如SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10所示；第6對引物序列如SEQ ID NO 11禾口 SEQ ID NO 12所示；第7對引物序列如SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14所示；
第8對引物序列如SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16所示；第9對引物序列如SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 18所示；第10對引物序列如SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20所示；(2)待檢測樣本的STR圖譜的獲得提取待檢測樣本的鵝品種基因組DNA，采用上述相同引物進行多重PCR擴增和掃 描，獲得檢測樣本的鵝品種得STR圖譜；(3)待檢測樣本的品種鑒定將待檢測樣本的STR圖譜與標準圖譜相比較，鑒定待測樣本的品種真實性。本發明相比于現有的鑒定方法，其具有快速、準確、可重復性好、成本低等優點。
圖1是皖西白鵝的STR標準遺傳圖譜。圖2是浙東白鵝STR標準遺傳圖譜。圖3是四川白鵝STR標準遺傳圖譜。圖4是太湖鵝STR標準遺傳圖譜。圖5是獅頭鵝STR標準遺傳圖譜。圖6是豁眼鵝STR標準遺傳圖譜。圖7是武岡銅鵝STR標準遺傳圖譜。圖8是馬崗鵝STR標準遺傳圖譜。圖9烏鬃鵝STR標準遺傳圖譜。圖中各編號對應的位點為1 :1-1 ；2 =II-I ；3 :111_3 ；4 :11_2 ；5 =III-I ；6 :111_2 ； 7 11-3 ；8 :IV-3 ；9 :IV-2 ；10 :IV_1。
具體實施例方式1、鵝STR標準遺傳圖譜構建(1)不同鵝品種基因組DNA的提取(樣本量)取自國家水禽種質資源基因庫現保存的9個地方鵝品種，各品種隨機抽取60只， 其中公、母各30只。9個鵝品種(皖西白鵝，WX;浙東白鵝，ZD、四川白鵝，SC ；太湖鵝，TH;獅 頭鵝，ST ；豁眼鵝，HY ；武岡銅鵝，WG ；馬崗鵝，MG和烏鬃鵝，WZ)。每只鵝翅下靜脈采血2 3ml,0. 5%肝素鈉抗凝，置冰盒帶回實驗室，低溫低速離心5min小心去除上層血漿，-20°C 低溫保存血細胞。①取紅細胞20ul于1. 5mL Eppendorf管中，加入500mL禽血裂解液，5 μ L RNase A (20 μ g/ μ L)，10 μ L 10 % SDS，10 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL)，混勻，55 °C 水浴過夜；②加入等體積Tris飽和酚，搖20min后，12000rpm離心IOmin ；③轉移出上清液，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25 24 1，V/V/V)，搖15min 后，12000rpm 離心 IOmin ；④重復步驟③一次；⑤抽提上清液中加入等體積氯仿異戊醇(24 1，V/V)搖15min，12000rpm離心 IOmin ；
⑥抽提上清液中加入2倍體積的冰無水乙醇，輕搖、沉淀DNA。⑦7500rpm離心5min，小心傾倒出乙醇；⑧70%乙醇洗滌2次。自然干燥，加300 μ L TE溶解。待DNA完全溶解后，采用NanoDrop ND-1000濃度測定儀檢測樣本DNA的濃度和純 度，并將其稀釋到lOOng/yL分裝備用。DNA原液_20°C長期保存。(2) STR引物的篩選、熒光標記及PCR擴增在已報道的鵝微衛星引物序列的基礎上，篩選出10對多態性豐富、擴增效率好的 微衛星引物，對每對STR引物上游引物5’端分別用FAM(藍色)，HEX(綠色)和TAMRA(黑 色)三種熒光染料進行標記，引物避光保存。根據微衛星擴增片段大小的范圍和引物熒光 標記顏色的差異，對篩選出的引物進行組合試驗。其組合依據是每三種顏色熒光為一組，該 組內熒光PCR擴增產物片段大小相差50bp以上。根據篩選出的10對STR引物信息，這樣 的組合共有4個。根據分組情況進行多重PCR的擴增，10對熒光標記微衛星引物其組合情 況及PCR反應條件如表1所示。表1. 10對熒光標記微衛星引物其組合情況及PCR反應條件
權利要求
一種鑒別鵝品種的方法，其特征在于其步驟如下(1)鵝STR標準遺傳圖譜構建提取來自國家級保種場的鵝品種基因組DNA，將下述10對STR引物，采用熒光標記，結合多重PCR技術對基因組DNA進行擴增，通過ABI 3730XLDNA全自動基因分析儀對不同個體進行掃描，以GeneScan 500為標準內參，利用GeneMapper 4.0軟件進行圖像分析，精確測量出微衛星等位基因片段大小，獲得不同品種特有等位基因，并構建不同品種鵝的STR標準遺傳圖譜；第1對引物序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；第2對引物序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；第3對引物序列如SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示；第4對引物序列如SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示；第5對引物序列如SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示；第6對引物序列如SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示；第7對引物序列如SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示；第8對引物序列如SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示；第9對引物序列如SEQ ID NO17和SEQ ID NO18所示；第10對引物序列如SEQ ID NO19和SEQ ID NO20所示；(2)待檢測樣本的STR圖譜的獲得提取待檢測樣本的鵝品種基因組DNA，采用上述相同引物進行多重PCR擴增和掃描，獲得檢測樣本的鵝品種得STR圖譜；(3)待檢測樣本的品種鑒定將待檢測樣本的STR圖譜與標準圖譜相比較，鑒定待測樣本的品種真實性。
2.根據權利1所述的鑒別鵝品種的方法，其特征在于所述的ABI3730XL DNA全自動 基因分析儀掃描的條件為上樣總體積為13yL，其中上樣液高質量的去離子甲酰胺10ul， GS-500標準內參0. 5μ L。
全文摘要
本發明公開了一種鑒別鵝品種分子生物學方法。本發明在已有研究報道的基礎上，篩選出多態性豐富的微衛星引物，以ABI 3730XLDNA全自動基因分析儀為平臺，結合熒光-多重PCR技術，采用GeneScan-500標準，對不同鵝品種個體進行掃描，獲得不同品種特有等位基因，構建鵝STR標準遺傳圖譜，根據待檢測樣本的STR圖譜與標準圖譜比較，鑒定待測樣本的品種真實性。本方法具有產量高、成本低、快速簡便等優點，為科學評價和鑒定鵝品種遺傳特性提供一條可靠的技術途徑，為保護鵝育種產權和規范種鵝市場提供技術保障。
文檔編號C12Q1/68GK101985660SQ20101057401
公開日2011年3月16日 申請日期2010年12月6日 優先權日2010年12月6日
發明者喬娜, 張揚, 徐琪, 段修軍, 趙文明, 陳國宏 申請人:揚州大學