專利名稱：一種血栓溶酶高產菌株及血栓溶酶的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，尤其一種血栓溶酶高產菌株及血栓溶酶的制備方法。
背景技術：
急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)等血栓栓塞性疾病的致殘率和致死率都很高，是引起人類死亡的三大疾病之一，嚴重威脅人類生命和健康，目前全世界約有1500萬病人，而且發病率有增無減。血栓的主要成分是血纖維蛋白(Fibrin)。血液凝固與纖維蛋白溶解是一對重要的生理過程，二者相互矛盾又彼此聯系，各受一系列酶促反應的調節。血纖維蛋白的生成是血漿中各凝血因子按一定方式、次序的激活過程和一系列酶促反應的結果，凝血酶 (Thrombin)的生成是中心環節。人血漿中主要依靠纖溶酶(Plasmin)降解纖維蛋白。血漿中的纖溶酶以前體物纖溶酶原(Plasminogen)形式存在，激活血纖維蛋白溶酶原的酶稱為血纖維蛋白溶酶原激活劑(PA)。此外，血漿中還存在抑制各酶活性的抑制因子，在正常的血液中，抑制作用占優勢。在人體正常情況下，凝血系統、纖維蛋白溶解系統及其抑制系統處于平衡狀態，人體既不出血也不形成血栓。在病理情況下，凝血系統功能亢進或纖溶系統功能降低，就形成血栓或有形成血栓的傾向。纖維蛋白溶解與溶血栓密切相關，纖溶酶在人體內含量少，又難提純，所以臨床治療中常用纖溶激活劑和纖溶酶作為外來物增強纖溶作用。因此纖溶酶原激活劑和纖溶酶的研究占有重要地位。溶栓療法是早期急性心肌梗塞和其它血栓栓塞性心血管疾病的有效治療方法，其主要是通過藥物溶解血栓中的主要基質血纖維蛋白，或激活血液中無活性的血漿纖溶酶原，形成有活性的纖溶酶來催化血纖維蛋白的水解，使血栓溶解，血管再通。溶栓療法被譽為20世紀心腦血管學方面的十大發現之一，受到各國的高度重視。國內外已正式批準臨床使用的主要溶栓劑有鏈激酶(str印tokinase，SK)、尿激酶(urokinase-type plasminogen activator, UK, u_PA)、重組組織型纖溶酶原激活劑 (recombinant tissue-type plaminogen activator，rt_PA)，對—甲氧苯甲酉先纖溶 原 IilWi.BS^^LlM'pf(anisoylated plasminogen streptokinase activatorcomplex, APSAC)和重組鏈激酶(recombinant str印tokinase，r_SK)。SK和UK常稱為第一代溶劑， 它們沒有纖維蛋白的特異性；t-PA、rt-PA、APSAC和r_SK稱為第二代溶栓劑，有纖維蛋白的特異性。現有的溶栓藥物療效肯定，明顯降低了 AMI患者的死亡率和致殘率，但還存在許多缺陷，主要表現在初始再灌注延遲或失敗、出血等不良反應，以及再梗死等問題，而且大多數現有溶栓藥物價格昂貴，因此，研制高效、快速、防止再栓塞及減低出血等不良反應的新型溶栓藥物的需求迫切。全球每年所需溶栓劑的潛在市場約20億美元。溶栓藥物的研究開發相當活躍，已成為生物工程和生物醫學領域的一個研究熱點。一方面，對現有溶栓藥物進行改造，以提高其特異性和溶栓效果；另一方面，從不同生物體中尋找新型的、相對廉價有效的溶栓劑也是一個熱點。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了血栓溶酶高產菌株及血栓溶酶的制備方法，本血栓溶酶最適PH接近人體血液pH而且具有較好的pH穩定性的血栓溶酶的制備方法。本發明的目的是通過以下技術方案實現的一種血栓溶酶高產菌株，菌株屬于菊芋小孢根霉菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號， 保藏日期:2010年11月26日，保藏編號No. 4368，分類命名=Rhizopus microsporus var. tuberosus。一種血栓溶酶的制備方法，其特征在于制備方法的步驟是(1)挑取菊芋小孢根霉菌CGMCC No. 4368，接種于種子培養基中，在^_32°C、 150-170r/min條件下培養10_1濁，得到種子培養液；(2)將種子培養液以20%的接種量接種于發酵培養基上，28-32°C、170-175r/min 培養50-70h，至產酶高峰期，得到發酵培養液；(3)將上述發酵培養液低溫高速離心除菌體，上清即為血栓溶酶粗酶液；所述種子培養基與發酵培養基內包括碳源、氮源、水，pH自然。而且，所述步驟(1)前還包括將保藏的菊芋小孢根霉菌株進行活化，將活化出菌株用于種子培養。而且，所述碳源為糊精、麩皮或淀粉中的一種或兩種以上的組合物，所述氮源為銨鹽、硝酸鹽、豆粕、牛肉浸膏、蛋白胨或酵母浸膏中的一種或兩種以上的混合物。而且，所述碳源優選糊精，其加入量為培養基總重量的1. 0-1. 5%。而且，所述氮源為優選豆粕和蛋白胨作為組合氮源，其加入量為培養基總重量的 2%，其中蛋白胨既作為氮源，又作為誘導物。 而且，所述血栓溶酶粗酶液，經飽和度為70 %的硫酸銨水溶液進行鹽析，對沉淀物質進行除鹽，然后真空冷凍干燥機制成粉末，即得到血栓溶酶粗酶粉。而且，所述種子培養基的優選成分為每IL水含如下重量份數的成分糊精15-25 份、蛋白胨10-20份、pH自然，所述發酵培養基的優選成分為每IL水含如下重量份數的成分糊精5-15份、蛋白胨15-25份、豆粕15-25份。而且，所述血栓溶酶粗酶液中血栓溶酶的最適酶作用溫度為37°C，最適酶作用pH 為 7. 0。本發明的優點和積極效果是1、本發明的菊芋小孢根霉及其變異菌株能夠有效的產生本發明的血栓溶酶，涉及的菌株使用的碳源是選用微生物菌種中可利用的且適于發酵產生血栓溶酶的碳源，其氮源則選擇蛋白胨和豆粕，其中蛋白胨既可以作為氮源，又可以作為誘導物，豆粕的原料來源廣泛，為大規模生產提供便利條件。2、本發明菌株菊芋小孢根霉產生的血栓溶酶最適酶作用溫度為37°C，與人體體溫基本一致，作為治療心腦血管疾病的口服藥劑有較大的優勢，該酶在37°C保溫4h酶活力仍保存80 %，47 V和52 °C下保溫4h酶活力均保存35 %，57 °C下保溫4h后仍有一定酶活，說明該酶具有一定的耐熱性。3、本發明菌株菊芋小孢根霉產生的血栓溶酶最適作用pH為7. 0，且該酶最穩定的 PH范圍是6-8，與人體血液的pH 7. 35-7. 45相適應，該血栓溶酶在此pH和37°C保溫Mh， 酶活力保存80%以上。4、本發明菌株菊芋小孢根霉產生的血栓溶酶在4 < pH < 11范圍內酸性或堿性條件引起的酶活性降低是可以部分恢復的，具有一定程度的可逆性。
圖1為本發明血栓溶酶的反應溫度和相對酶活的關系圖；圖2為本發明血栓溶酶的反應pH和相對酶活的關系圖；圖3為本發明血栓溶酶在不同作用時間下各種溫度的殘余酶活的圖；圖4為本發明血栓溶酶在不同作用溫度下的殘余酶活的圖；圖5為本發明血栓溶酶在不同pH下處理后殘余酶活的圖；圖6為本發明血栓溶酶在pH處理后調整pH與不調整pH的比較圖；圖7為本發明血栓溶酶在不同金屬離子存在下相對酶活的圖。
具體實施例方式以下將本發明的內容通過下列的較優的實施例作進一步的闡述，但這些實施例并不限制本發明的保護范圍。1、菊芋小孢根霉菌種Cq-I的分離將酒曲樣本置于無菌研體中，加入IOmL無菌水，研磨成均勻的懸浮液，通過以 PDA培養基作為初篩底物，纖維蛋白作為復篩底物，透明圈作為篩選標記，進行微生物菌種的培養、分離和篩選，獲得了一批產血栓溶酶的微生物菌株，并從中分離出1株高產血栓溶酶產生菌株，編號為Cq-Ι，分類為Miizopus，該菌具有產生血栓溶酶的優良特性，該菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號CGMCC No. 4368。2、菊芋小孢根霉Cq-I的保藏，以及長期保藏的菌種的活化保藏該菌采用常規的斜面傳代保藏法，具體方法是將分離出的菌種接種于霉菌基本培養基斜面的表面，28°C培養5天，再于4°C下保藏，每3到4個月轉接一次，或者添加15%甘油制成液體菌種，-70°C超低溫保藏可達6個月，或者利用真空冷凍干燥法將本發明菌種制成干粉菌種，低溫和常溫保藏可達1年以上。活化長期保藏的菌種依照如下方法進行活化，將長期保藏的菊芋小孢根霉菌種接種于霉菌基本培養基或者PDA培養基等其他適于霉菌生長的培養基表面，培養5天。 本步驟優先選用PDA培養基，其配方為去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加IOOOmL水煮沸lh， 用雙層紗布濾成清液。補水至IOOOmL,然后加入20g葡萄糖完全溶解，pH自然。加入瓊脂 20g。3、利用菊芋小孢根霉生產血栓溶酶的方法如下(1)將長期保藏的菊芋小孢根霉菌種CGMCC No. 4368經過活化，將活化出菌株用于血栓溶酶的發酵培養；
(2)挑取上述菌株，接種于60mL/250mL種子培養基中，28°C、150r/min條件下培養 llh，得到種子培養液；種子培養基成分為糊精20g、蛋白胨15g、蒸餾水1000mL、pH自然。(3)將種子培養液以20%的接種量接種于發酵培養基上J8°C、170r/min培養 60h，至產酶高峰，得到富含血栓溶酶的培養液；發酵培養基成分為糊精10g、蛋白胨20g、豆粕20g、蒸餾水1000mL、pH自然。(4)將上述培養液在4°C、8000r/min條件下離心15min，棄去固形物，上清即為粗酶液，將得到的粗酶液，以飽和度為70%的硫酸銨進行鹽析，對沉淀物質進行除鹽，然后真空冷凍干燥機制成粉末，即得到粗酶粉。在上述實驗中涉及的種子培養基和發酵培養基，其中的培養基的營養源，可廣泛使用通常用于生產的營養源，碳源、氮源以及產酶誘導劑的說明如下碳源選用微生物菌種可利用的、適于發酵產生本發明的血栓溶酶的碳源即可， 例如，可使用糊精、麩皮、淀粉等。本發明中優選糊精，其用量為1. 0-1. 5%，葡萄糖對產酶有一定的葡萄糖抑制效應。氮源只要是可作為氮源同化的含氮物質即可，例如，可用銨鹽、硝酸鹽、豆粕、牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏等，用量根據其它營養成分的不同而定。本發明中，優選豆粕和蛋白胨作為組合氮源，其用量均在2%。產酶誘導劑蛋白胨在本發明里既作為氮源，又作為誘導物。4、以下是對本實驗產生的血栓溶酶的理化性質進行檢測分析(1)血栓溶酶酶活的測定方法方法平板溶圈法溶液A :0. 2g血纖維蛋白原溶于50ml巴比妥(pH7. 8)溶液中。溶液B 0. 25g瓊脂糖溶于50ml醫用生理鹽水，加熱溶解。溶液A在45°C水浴鍋中保溫5min，溶液B在45°C水浴鍋中保溫30min，然后加入 200U/ml的凝血酶1ml，混勻。分別取5ml溶液A和5ml溶液B鋪在平板上混勻，即為血纖維蛋白平板。用尿激酶標準品做纖溶酶活性標準曲線，37°C保溫他，標準曲線采用指數回歸，其方程Y = ο. 1052e4 013x,R2 = 0. 9965 ；式中Y為酶活力，X為溶圈直徑。取待測樣品10 μ L點在血纖維蛋白平板上，37°C保溫他后測定溶圈直徑，通過上述回歸方程計算待測樣品酶活力。(2)作用溫度對血栓溶酶活性的影響最適作用溫度的確定，是參照實施例4所述的酶活力檢測方法，在27-57°C范圍內，以5°C為間隔，測定溫度對酶活力的影響。以所測得酶活力最高的溫度下的酶活力值為對照，設定其相對酶活力為100%，則反應溫度和相對活性的關系如圖1所示。結果表明，在 27V _37°C范圍內，隨溫度的升高，酶反應速度加快，酶活力升高；高于37°C，酶活力下降。 其最適作用溫度為37°C，明顯表現出作為口服藥品的活性優勢。(3)作用pH對血栓溶酶活性的影響最適作用pH的確定，參照實施例4所述的酶活力檢測方法進行，配制pH值為 2. 8-11. 8的廣范圍的緩沖液作為溶劑，以0. 6為間隔，測定pH對酶活力的影響。以所測得酶活力最高的PH條件下的酶活力值為對照，設定其相對酶活力為100%，則作用pH和相對活性的關系如圖2所示。人體血液的pH在7. 35-7. 45之間，該酶最適作用pH為7. 0，表現出治療優勢。(4)血栓溶酶的溫度穩定性依照實施例3獲得血栓溶酶粗酶液，分別在27、32、37、42、47、52、57°C下保溫 30min、lh、2h、4h，然后按照上述實施例4所述的酶活力測定方法對殘余酶活里進行測定。 以未進行保溫處理的酶活力值作為對照，設定其相對酶活力為100%，則此時的處理溫度和殘余活力關系如圖3和圖4所示。結果可見，該酶在37°C下比較穩定，37°C保溫4h酶活力保存80 %，47 V和52 °C下保溫4h酶活力均保存35 %，57 °C下保溫4h后仍有一定酶活，說明該酶具有較好的耐熱性。(5)血栓溶酶的pH穩定性需配制pH3、4、5、6、7磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH8、9巴比妥鈉-鹽酸緩沖液， PHlO硼砂-氫氧化鈉緩沖液，pHll磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液和pH12氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液，濃度均為0. 02M。依照實施例3獲得血栓溶酶粗酶液，以1 1分別與PH3-12 的緩沖液進行混合，均勻混合后置37°C恒溫箱下保溫2h、4h、12h、Mh，調整酶液pH為7. 0， 然后按照上述實施例4所述的酶活力測定方法對殘余酶活力進行測定。以未進行處理的酶活力值作為對照，設定其相對酶活力為100%，則不同處理pH和殘余活力關系如圖5所示。 本發明所獲得的血栓溶酶的PH穩定性曲線是典型的鐘罩形曲線，該酶最穩定的pH范圍是 6-8，37°C保溫Mh，酶活力保存80%以上，可見該酶的pH穩定性很好。(6) pH對血栓溶酶引起的失活的可逆性為了考察pH對根霉纖溶酶引起的失活是否可逆，還進行了纖溶酶在不同pH值 37°C保溫一定時間后，不調整pH為7.0，而直接測定纖溶酶活力的實驗。圖6顯示纖溶酶在不同PH值37°C保溫一定時間后，不調整pH為7. 0，直接測定的纖溶酶活力與調整pH為7. 0 測定的纖溶酶活力的差別。圖6表明，pH大于4、小于11范圍內酸性和堿性條件引起的酶活性降低是可以部分恢復的，具有一定程度的可逆性。這些實驗結果說明PH對血栓溶酶活性的影響一方面是酶的空間結構改變，引起酶活力降低；另一方面PH值影響酶活性部位催化基團的解離狀態，使血纖維蛋白的分解反應速率下降；此外可能還影響酶活性部位結合基團的解離狀態，使血栓溶酶對血纖維蛋白的結合能力下降。(7)金屬離子對血栓溶酶活性的影響金屬離子對血栓溶酶活性影響的測定，用去離子水配制lOmmol/L和lmmol/L的 NaCUKCl, CaCl2、MnS04、AlCl3、CuSO4、FeSO4、ZnSO4溶液，取血栓溶酶酶液與同體積的不同濃度金屬離子溶液混合，放入37°C恒溫箱中保溫18h，測定其酶活力，用血栓溶酶與去離子水混合作對照，設定其相對酶活力為100%，則不同離子對酶活性的影響如圖7所示。結果顯示，除了 CuSO4和SiSO4抑制血栓溶酶的活性之外，其他金屬離子都對酶有一定的激活作用，其中NaCl、CaCl2和MnSO4的作用較為明顯，且當金屬離子濃度為lOmmol/L時的激活作用比lmmol/L時要高。通過本發明如上的闡述，得到后面實施例的進一步驗證，得知本發明血栓溶酶的酶學特性。作為本發明血栓溶酶的產生菌種，既可為本發明所保護的菌種，也可為自然篩選的原始菌株，或為保護菌株通過自然變異或人工誘導變異的變異菌株，通過本發明所述的方法，均可實現本發明闡述的技術效果。作為上述變異菌株的研制方法，包括常規物理誘變，如紫外線輻射、離子注入、激光輻照等各種射線處理；化學誘變，如硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)等化學誘變劑處理，以及用常規血栓溶酶產生菌篩選培養基及方法優選出生產性能優異的菌種等。另外，也可通過分子生物學技術，從原始菌株或誘變菌株中獲取血栓溶酶基因，通過shuffling等手段獲得突變基因，以原核微生物，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等作為基因受體菌構建基因工程生產菌株，也可作為本發明的血栓溶酶產生菌種。
權利要求
1.一種血栓溶酶高產菌株，其特征在于菌株屬于菊芋小孢根霉菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號No. 4368。
2.—種血栓溶酶的制備方法，其特征在于制備方法的步驟是(1)挑取菊芋小孢根霉菌CGMCCNo. 4368，接種于種子培養基中，在28-32 V、 150-170r/min條件下培養10_1濁，得到種子培養液；(2)將種子培養液以20%的接種量接種于發酵培養基上，28-32°C、170-175r/min培養 50-70h，至產酶高峰期，得到發酵培養液；(3)將上述發酵培養液低溫高速離心除菌體，上清即為血栓溶酶粗酶液；所述種子培養基與發酵培養基內包括碳源、氮源、水，PH自然。
3.根據權利要求2所述的微生物血栓溶酶的制備方法，其特征在于所述步驟(1)前還包括將保藏的菊芋小孢根霉菌株CGMCC No. 4368進行活化，將活化出菌株用于種子培養。
4.根據權利要求2所述的微生物血栓溶酶的制備方法，其特征在于所述碳源為糊精、 麩皮或淀粉中的一種或兩種以上的組合物，所述氮源為銨鹽、硝酸鹽、豆粕、牛肉浸膏、蛋白胨或酵母浸膏中的一種或兩種以上的混合物。
5.根據權利要求4所述的微生物血栓溶酶的制備方法，其特征在于所述碳源優選糊精，其加入量為培養基總重量的1. 0-1. 5%。
6 根據權利要求4所述的微生物血栓溶酶的制備方法，其特征在于所述氮源為優選豆粕和蛋白胨作為組合氮源，其加入量為培養基總重量的2%，其中蛋白胨既作為氮源，又作為誘導物。
7.根據權利要求2所述的微生物血栓溶酶的制備方法，其特征在于所述血栓溶酶粗酶液，經飽和度為70 %的硫酸銨水溶液進行鹽析，對沉淀物質進行除鹽，然后真空冷凍干燥機制成粉末，即得到血栓溶酶粗酶粉。
8.根據權利要求2或4所述的微生物血栓溶酶的制備方法，其特征在于所述種子培養基的優選成分為每IL水含如下重量份數的成分糊精15-25份、蛋白胨10-20份、pH自然，所述發酵培養基的優選成分為每IL水含如下重量份數的成分糊精5-15份、蛋白胨 15-25份、豆粕15-25份。
9.根據權利要求2所述的微生物血栓溶酶的制備方法，其特征在于所述血栓溶酶粗酶液中的血栓溶酶的最適酶作用溫度為37°C，最適酶作用pH為7. 0。
全文摘要
本發明涉及一種血栓溶酶高產菌株及血栓溶酶的制備方法，菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號No.4368；制備血栓溶酶的步驟為(1)活化菌株；(2)種子培養；(3)發酵培養；(4)分離純化。本發明所涉及的絲狀小孢根霉來源于酒曲中，產酶穩定，原料來源廣泛，生產成本低廉；所獲得的血栓溶酶對急性心肌梗死，腦梗死，肺血栓栓塞癥等具有良好的治療效果，血栓溶酶源自酒曲，安全性好，毒副作用小，因此適合開發成口服類溶栓劑。
文檔編號C12N1/14GK102154112SQ20101057174
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月3日 優先權日2010年12月3日
發明者劉建軍, 戚薇, 曹興南, 杜連祥, 王海寬, 羅宇東 申請人:天津科技大學