專利名稱：一種溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法
技術領域：
本發明涉及一種溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，尤其是利用一種晶膠吸附層 析技術從蛋清中分離溶菌酶(Lysozyme)的方法。
背景技術：
溶菌酶(Lysozyme)又稱胞壁溶解酶，因能夠水解某些細菌中的黏多糖而被廣泛 應用于食品防腐劑、生物工程和抗菌劑等方面。國外報道已經通過動物的體外細胞培養 實驗證實溶菌酶是一種潛在的抗癌藥物。溶菌酶廣泛存在于高等動物組織及分泌物、植物和微生物體內，其中蛋清和哺 乳動物的乳汁是溶菌酶的重要來源。雞蛋作為生產原料優勢在于原料豐富、廉價且雞蛋 清中溶菌酶的含量最高(約3.2%-3.5%)。從蛋清中提取溶菌酶的工業化技術比較復雜， 通常需要幾種技術聯合使用，如重復結晶、鹽析、超濾、陽離子交換層析等。結晶法 是目前工藝上提取蛋清中溶菌酶的首選方法，但需要通過反復結晶精制，其過程繁瑣且 生產周期長。常規陽離子交換樹脂吸附層析溶菌酶，因其介質孔隙尺寸在納米級范圍， 傳質主要通過分子擴散，吸附平衡時間長，過程成本較高。本發明所用的陽離子交換型 晶膠介質層析其傳質利用對流擴散，傳質阻力小，實現了溶菌酶的快速高效分離。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種用晶膠吸附層析技術快速高效提取溶菌酶 的新方法。為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是一種溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，包括如下步驟(1)用pH值6.0 10.5的緩沖溶液稀釋含有溶菌酶的混合液得到上樣液，以 0.1 25cm/min的流速上晶膠床柱，進行吸附；(2)以去離子水或pH值6.0 10.5的緩沖溶液為沖洗液，沖洗掉晶膠內未被吸 附的雜質；(3)用含有0.02 3M堿金屬鹽的pH值6.0 10.5的緩沖溶液為洗脫液，進行 洗脫，收集含溶菌酶的洗脫峰，得到所述的溶菌酶。在所述的晶膠吸附層析分離過程中，通常在上樣前，先以pH值6.0 10.5的緩 沖溶液平衡晶膠床柱。進一步，步驟(1)所述晶膠床柱中的晶膠介質優選為陽離子交換型，其功能基 團為磺酸基。所述的陽離子交換晶膠介質的基質制備方法參照文獻(Yaoetal.，Chem.Eng. Sci.61, 6701-6708，2006)；基質孔內接枝聚合反應及所用陽離子交換功能基團的磺酸基 單體參照專利(CN100413590C)。本發明對上述兩篇文獻做全文引用。進一步，步驟(1)中所述的含有溶菌酶的混合液為雞蛋清或預處理后的雞蛋 清。所述的預處理后的雞蛋清是指先用0.1 1M的鹽酸溶液將蛋清的pH調至6.0-7.0，離心后將其上清液的pH用0.1 1M的氫氧化鈉溶液調至7.0 10.0范圍，再次離心后 的上清液。通常是將含有溶菌酶的混合液稀釋2 10倍，然后低溫攪拌、離心得到上清 液作為上樣液。進一步，步驟⑵中所述沖洗液的流速在0.1 25cm/min。進一步，步驟(3)中的洗脫優選梯度洗脫，洗脫液流速0.2 20Cm/min，先用含 堿金屬鹽0.02 0.15M的pH值6.0 10.5的緩沖溶液進行洗脫，再用堿金屬鹽含量相應 更高(0.15 3M)的pH值6.0 10.5的緩沖溶液進行洗脫，收集含溶菌酶的洗脫峰，得 到所述的溶菌酶。進一步，步驟(3)所述的堿金屬鹽優選NaCl或KC1。本發明所述的pH值6.0 10.5的緩沖溶液可選自下列之一①pH6.0 8.0磷 酸鹽緩沖溶液、②pH 7.1 9.0Tris_鹽酸緩沖溶液、③pH 9.1 10.5碳酸鹽緩沖溶液。本發明在步驟(3)洗脫完畢后，依次用0.1M HC1、1 2M NaCl和去離子水對
使用過的晶膠床柱進行再生。本發明具體推薦所述方法按照如下步驟進行(a)以pH值6.0 10.5的緩沖溶液平衡晶膠床柱；所述晶膠床柱中的晶膠介質 為陽離子交換型，其功能基團為磺酸基；(b)用pH值6.0 10.5的緩沖溶液稀釋雞蛋清或預處理后的雞蛋清得到上樣液， 以0.1 25Cm/min的流速上晶膠床柱，進行吸附；(c)以去離子水或pH值6.0 10.5的緩沖溶液為沖洗液，以0.1 25cm/min的
流速沖洗掉晶膠內未被吸附的雜質；(d)用含有0.02 3M堿金屬鹽的pH值6.0 10.5的緩沖溶液為洗脫液，進行 梯度洗脫，先用含堿金屬鹽0.02 0.15M的pH值6.0 10.5的緩沖溶液進行洗脫，再用 堿金屬鹽含量相應更高的pH值6.0 10.5的緩沖溶液進行洗脫，洗脫液流速0.2 20cm/ min,收集含溶菌酶的洗脫峰，得到所述的溶菌酶；所述的堿金屬鹽為NaCl或KC1;(e)依次以0.1M HC1、1 2M NaCl和去離子水對晶膠床柱進行再生。與現有溶菌酶分離技術相比，本發明提供的方法特色是利用晶膠層析實現了溶 菌酶的直接分離。晶膠層析方法是一種新型生物分離技術，可在高流速、低背壓下從 含目標生物分子的復雜料液中直接提取目標物。與常規粒狀介質不同，晶膠介質為整體 狀其內部有大量尺寸在數十至數百微米的孔隙，溶菌酶在晶膠內的吸附主要利用對流傳 質，具有傳質阻力小，吸附容量大和層析分離高效等優點。本方法將現有溶菌酶分離工 藝過程中的重復鹽析、結晶、超濾、陽離子交換層析等多個結合或復雜的步驟簡化為通 過晶膠吸附層析一步實現。本發明方法的價值主要體現在工藝過程簡單，處理量大，得到的溶菌酶純度 高，且晶膠介質再生方便，可重復使用，是一種低成本的溶菌酶分離純化方法。
具體實施例方式以下結合具體實施例來說明本發明的技術方案，但本發明的保護范圍并不僅限 于此實施例1
用0.02M的磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)直接稀釋雞蛋清(以本地市場購買的雞 蛋為原料收集其中的雞蛋清，下同)，在2°C下攪拌過夜然后4°C離心，離心后的上清液 作為待分離用的料液(溶菌酶的含量2.5mg/ml)。料液溶質中溶菌酶(Lysozyme)占總 溶質的3.4% (重量百分比)、卵清蛋白(Ovalbumin)占60% (重量百分比)、伴清蛋白 (Ovotransferrin)占13% (重量百分比)、其它雜質占23.6% (重量百分比)，下同。選擇 內徑16mm、高120mm的陽離子交換晶膠層析柱(孔徑10 100 u m，孔隙率65% )。用磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)平衡晶膠床柱，將lOOmL料液以3Cm/min流速上晶 膠床柱，用流動式紫外檢測器監測層析過程(UV 280nm)。在3Cm/min流速下用250mL 磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)沖洗床柱內未被吸附的雜質。然后，用300mL含有0.05M NaCl 的磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)進行洗脫，以除去被吸附在晶膠中的雜質，洗脫流速2cm/ min ；以200mL含有0.5M NaCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)進行洗脫，收集溶菌酶的洗 脫峰，洗脫流速2cm/min。用SDS-PAGE (Bio-rad 的 Mini-PROTEAN Tetra Cell 電泳系統，分離膠濃度
12%,濃縮膠濃度4%，考馬斯亮藍R-250染色液濃度0.1%，脫色液為水50% (W/W)、 乙醇40%(W/W)、乙酸10% (W/W)的混合溶液)對收集的溶菌酶進行分析，下同。得 到溶菌酶的收率85%，純度98%。實施例2用0.05M的Tris-鹽酸緩沖溶液(pH 9.0)直接稀釋雞蛋清，在2°C下攪拌5小時 然后在4°C下離心，離心后的上清液作為待分離用的料液(溶菌酶的含量lmg/ml)。用 Tris-鹽酸緩沖溶液(pH 9.0)，對內徑10mm、高120mm的晶膠床柱(孔徑5 140 y m， 孔隙率82%)進行平衡。將70mL料液以2cm/min流速上入晶膠床柱。于5cm/min流速下用200mL的 Tris-鹽酸緩沖溶液(pH 9.0)沖洗床柱后，依次用350mL含0.03M KC1的Tris-鹽酸緩沖 溶液(pH 9.0)，300mL含2M KC1的Tris-鹽酸緩沖溶液(pH 9.0)進行洗脫，收集溶菌酶 洗脫峰，洗脫流速4cm/min。得到溶菌酶收率90%，純度94%。實施例3先用0.1 1M的鹽酸溶液將雞蛋清的pH調至6.0，離心后將其上清液的pH用 0.1 1M的氫氧化鈉溶液調至8.0范圍，再次離心后的上清液即為預處理后的雞蛋清。用0.05M磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)稀釋預處理后的雞蛋清，在4°C下離心，離心 后的上清液作為待分離用的料液(溶菌酶的含量1.5mg/ml)。用0.05M磷酸鹽緩沖溶液 (pH 7.0)，對內徑26mm、高150mm的晶膠床柱(孔徑50 200 u m，孔隙率92% )進 行平衡。將165mL料液以6cm/min流速上入晶膠床柱。于6cm/min流速下用450mL去離 子水沖洗床柱后，依次用200mL含0.1M KC1的0.05M磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)，360mL 含1.0M KC1的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)進行洗脫，收集溶菌酶洗脫峰，洗脫流速5cm/ min。得到溶菌酶收率76%，純度87%。實施例40.01M碳酸鹽緩沖溶液(pH 10)直接稀釋雞蛋清，在2°C下攪拌8小時然后在4°C 下離心，離心后的上清液作為待分離用的料液(溶菌酶的含量2mg/ml)。用碳酸鹽緩沖溶液(pH 10)對內徑55mm、高120mm的晶膠床柱(孔徑60 300 u m，孔隙率78% )
進行平衡。將2.2L料液以lOcm/min流速上入晶膠床柱。于8cm/min流速下用3L碳酸鹽緩 沖溶液(pH 10)沖洗床柱后，依次用2.5L含O.lMNaCl的碳酸鹽緩沖溶液(pH 10)，2.8L 含1.5MNaCl的碳酸鹽緩沖溶液(pH 10)進行洗脫，收集溶菌酶洗脫峰，洗脫流速10cm/ min。得到溶菌酶收率93%，純度92%。實施例5用0.02M的磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)直接稀釋雞蛋清，在2°C下攪拌6小時然后 在4°C下離心，離心后的上清液作為待分離用的料液(溶菌酶的含量2mg/ml)。用0.02M 的磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)對內徑150mm、高280mm的晶膠床柱(孔徑20 160 u m， 孔隙率98%)進行平衡。將16L料液以20cm/min流速上入晶膠床柱。于15cm/min流速下用40L的磷 酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)沖洗床柱后，依次20L用含0.08M NaCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.0)，12L含2MNaCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)進行洗脫，收集溶菌酶洗脫峰，洗脫流 速6cm/min。得到溶菌酶收率87%，純度90%。
權利要求
1.一種溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，包括如下步驟(1)用PH值6.0 10.5的緩沖溶液稀釋含有溶菌酶的混合液得到上樣液，以0.1 25cm/min的流速上晶膠床柱，進行吸附；(2)以去離子水或pH值6.0 10.5的緩沖溶液為沖洗液，沖洗掉晶膠內未被吸附的 雜質；(3)用含有0.02 3M堿金屬鹽的pH值6.0 10.5的緩沖溶液為洗脫液，進行洗脫， 收集含溶菌酶的洗脫峰，得到所述的溶菌酶。
2.如權利要求1所述的溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，其特征在于步驟(1)中所述 的含有溶菌酶的混合液為雞蛋清或預處理后的雞蛋清；所述的預處理后的雞蛋清是指先 用0.1 IM的鹽酸溶液將蛋清的pH調至6.0-7.0，離心后將其上清液的pH用0.1 IM 的氫氧化鈉溶液調至7.0 10.0范圍，再次離心后的上清液。
3.如權利要求1所述的溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，其特征在于所述晶膠床柱中 的晶膠介質為陽離子交換型，其功能基團為磺酸基。
4.如權利要求1所述的溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，其特征在于步驟(2)中所述 沖洗液的流速在0.1 25cm/min。
5.如權利要求1所述的溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，其特征在于步驟(3)中的 洗脫為梯度洗脫，洗脫液流速0.2 20cm/min，先用含堿金屬鹽0.02 0.15M的pH值 6.0 10.5的緩沖溶液進行洗脫，再用堿金屬鹽含量相應更高的pH值6.0 10.5的緩沖 溶液進行洗脫，收集含溶菌酶的洗脫峰，得到所述的溶菌酶。
6.如權利要求1所述的溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，其特征在于所述的堿金屬鹽 為 NaCl 或 KCl。
7.如權利要求1所述的溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，其特征在于所述的緩沖溶液 選自下列之一①pH 6.0 8.0磷酸鹽緩沖溶液、②pH 7.1 9.0Tris_鹽酸緩沖溶液、 ③pH 9.1 10.5碳酸鹽緩沖溶液。
8.如權利要求1 7之一所述的溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，其特征在于依次用 0.1MHC1、1 2M NaCl和去離子水對步驟(3)使用過的晶膠床柱進行再生。
9.如權利要求1所述的溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，其特征在于所述方法按照如 下步驟進行(a)以pH值6.0 10.5的緩沖溶液平衡晶膠床柱；所述晶膠床柱中的晶膠介質為陽 離子交換型，其功能基團為磺酸基；(b)用pH值6.0 10.5的緩沖溶液稀釋雞蛋清或預處理后的雞蛋清得到上樣液，以 0.1 25cm/min的流速上晶膠床柱，進行吸附；(C)以去離子水或pH值6.0 10.5的緩沖溶液為沖洗液，以0.1 25cm/min的流速 沖洗掉晶膠內未被吸附的雜質；(d)用含有0.02 3M堿金屬鹽的pH值6.0 10.5的緩沖溶液為洗脫液，進行梯度 洗脫，先用含堿金屬鹽0.02 0.15M的pH值6.0 10.5的緩沖溶液進行洗脫，再用堿 金屬鹽含量相應更高的pH值6.0 10.5的緩沖溶液進行洗脫，洗脫液流速0.2 20cm/ min,收集含溶菌酶的洗脫峰，得到所述的溶菌酶；所述的堿金屬鹽為NaCl或KCl;(e)依次用0.1MHCL 1 2M NaCl和去離子水對晶膠床柱進行再生。
全文摘要
本發明公開了一種溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，包括如下步驟(1)用pH值6.0～10.5的緩沖溶液稀釋含有溶菌酶的混合液得到上樣液，以0.1～25cm/min的流速上晶膠床柱，進行吸附；(2)以去離子水或pH值6.0～10.5的緩沖溶液為沖洗液，沖洗掉晶膠內未被吸附的雜質；(3)用含有0.02～3M堿金屬鹽的pH值6.0～10.5的緩沖溶液為洗脫液，進行洗脫，收集含溶菌酶的洗脫峰，得到所述的溶菌酶。本發明方法的價值主要體現在工藝過程簡單，處理量大，得到的溶菌酶純度高，且晶膠介質再生方便，可重復使用，是一種低成本的溶菌酶分離純化方法。
文檔編號C12N9/36GK102021158SQ20101056772
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者姚克儉, 沈紹傳, 贠軍賢 申請人:浙江工業大學