專利名稱：一種污泥中志賀氏菌的快速定量檢測方法
技術領域：
本發明公開了一種針對污泥環境中志賀氏菌的快速定量檢測方法，屬于生物技術 中病原菌檢測技術領域。
背景技術：
志賀氏菌屬(幼i^^h)細菌通稱痢疾桿菌，在引發我國感染性腹瀉病的各原菌所 占比例中居首位，是一類具有高度感染性和危害嚴重的革蘭氏陰性腸道致病菌。每年全球 有1. 6億人因此菌感染患病，約有110萬人死亡，絕大多數為5歲以下兒童。由于生活污水 中含有許多病原微生物，例如來自腸道的細菌、病毒、原生動物、寄生蟲等，這些微生物絕大 部分都將隨污水處理進入剩余污泥，在污泥的農業土地利用過程中，通過污染地表水、地下 水、形成氣溶膠等多種途徑而擴散到環境中。這些隨污泥進入環境中的病原微生物對人體 健康和環境安全造成了巨大的潛在威脅，因此，準確快速地檢測污泥中的志賀氏菌，對防止 志賀氏菌傳播擴散具有十分重要的意義。志賀氏菌的檢測通常采用食品衛生微生物學檢驗國家標準(GB4789. 5 - 2003)，即 利用鑒別培養基結合生理生化鑒定。但這種方法應用于污泥樣品檢測時，一方面由于污泥 組成復雜、含有大量微生物而對檢測的靈敏度產生干擾，另一方面存在檢測周期長、漏檢率 高、程序復雜、所需試劑繁多等缺點。目前也有其他專利報道了志賀氏菌的檢測方法，例如 華南農業大學發明的一種志賀氏菌的檢測用引物及檢測方法(CN101845493A)和曹際娟發 明的飼料中沙門氏菌和志賀氏菌檢測試劑盒及其檢測方法(CN101624624A)，但是均不能滿 足污泥樣品中志賀氏菌快速定量檢測的要求。本發明通過MPN方法結合特異性PCR檢測志賀氏菌。MPN計數是一種應用概率理 論來估算細菌濃度的方法。將待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到將少量(如1 mL)的稀釋 液接種到新鮮培養基中沒有或極少出現生長繁殖。根據沒有生長的最低稀釋度與出現生長 的最高稀釋度，采用“最大或然數”理論，可以計算出樣品單位體積中細菌數的近似值。具體 地說，菌液經多次10倍稀釋后，一定量菌液中細菌可以極少或無菌，然后每個稀釋度取3— 5次重復接種于適宜的液體培養基中。培養后，將有菌液生長的最后3個稀釋度(即臨界級 數)中出現細菌生長的管數作為數量指標，由最大或然數表上查出近似值，再乘以數量指標 第一位數的稀釋倍數，即為原菌液中的含菌數。以往研究者往往通過相應稀釋法測數統計表(如GB/T 4789. 38-2008中用MPN 計數大腸桿菌數量使用了大腸桿菌MPN檢索表)查得細菌近似值。而本發明應用了 MPN Calculator軟件，一方面應用此軟件使得計數更為簡單方便，另一方面MPN檢索表只限于 3-4個稀釋度，而MPN Calculator軟件能達到7個稀釋度，且稀釋度選擇并不需要像MPN檢 索表那樣標準化，每個稀釋度下的重復管數也可以不同。
發明內容
本發明的目的本發明的目的是提供一種能夠快速定量檢測污泥中志賀氏菌的方法，滿足污泥樣品中志賀氏菌快速定量檢測的要求。本發明的技術方案一種污泥中志賀氏菌的快速定量檢測方法，檢測步驟如下； (1)污泥樣品的梯度稀釋和前增菌培養取城市剩余污泥樣品混勻，稱取3g城市剩余
污泥到盛有27mL GN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5-lOmin，混合均勻得泥水混合 物；取0. 5mL GN增菌液稀釋混勻的泥水混合物加入到經過滅菌的4. 5mL GN增菌液中得到 各個稀釋梯度，設5-7個稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個稀釋度設3-5個重復樣，于 37°C培養18-24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液。(2)選擇性增菌培養移取步驟(1)所得各管中菌液0. 5mL加入到志賀氏菌增菌肉 湯中，37°C培養18-24h。(3)DNA提取移取步驟(2)所得各管中菌液2mL加入到IOmL離心管中，IOOOOg離 心3 min，棄去上清液；再加入ImL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，IOOOOg離心3 min，棄 去上清液；加入10 μ L超純水，液氮冷凍和沸水浴反復凍融3次，然后IOOOOg離心3min取 上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短時間內4°C保存，長時間-20°C保存。(4) PCR擴增及擴增產物檢測PCR為50 μ L反應體系取步驟(3)所得DNA模板 1 μ L，含 MgCl2 的 10XPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/L 的 dNTPs 4. 0 μ L，均為 20mmol/L 的引 物PI、P2各0. 5 μ L，5U/ μ L的rTaq酶0. 25 μ L，加入滅菌雙蒸水至50 μ L ；PCR反應條件 94°C預變性5min ；94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸lmin，經30個循環；最后72°C延 伸 IOmin0延伸后的擴增產物用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統進行拍照，產生特 異性擴增條帶的即為陽性，不產生特異性條帶的即為陰性。所述特異性引物為
Pl :5’ -CATGGCTGGAAAAACTCAGTGC-3‘； P2 :5， -CTCATACTTCTGCTCTTCTGCC-3，。(5)用MPN計數軟件計算結果根據凝膠成像系統拍照結果，確定最大或然數MPN 結果，用MPN Calculator軟件計算得出污泥中最大可能的志賀氏菌含量。所述GN增菌液的配置配方為胰蛋白胨20.0g，葡萄糖l.Og，甘露醇2.0 g，檸 檬酸鈉5. 0g，去氧膽酸鈉0.5 g，磷酸氫二鉀4.0 g，磷酸二氫鉀1.5g，氯化鈉5.0 g， 蒸餾水定容至1000mL。按上述成分配置溶液，加熱使其溶解，調整pH7.0，115°C高壓滅菌 15min。所述志賀氏菌增菌肉湯的配置配方為胰蛋白胨20. Og;磷酸氫二鉀2. Og;磷酸 二氫鉀2.0 g;氯化鈉5.0 g;葡萄糖1.0 g;吐溫80 1.5 g。按上述配方混合均勻，加熱 溶解于蒸餾水中定容IOOOmL,調整pH7. 0，121 °C高壓滅菌15min，冷至50_55°C時，每225mL 培養基中加入1支無菌新生霉素溶液(含新生霉素125g)，混勻。本發明的有益效果本發明所提供的檢測方法能克服傳統的微生物培養檢測方法 存在的檢測周期長、步驟繁瑣、費時費力等缺點，使檢測時間大大縮短到2-3天，操作步驟 和勞動強度也大為縮減，達到省時省力、快速靈敏的要求。本發明通過MPN方法結合特異性 PCR檢測，既實現了污泥樣品中志賀氏菌定量檢測的需要，采用選擇性增菌培養和特異性 PCR檢測的方法，避免了其他微生物的干擾，提高了檢測的靈敏度和特異性。本發明為制定 和改進城市剩余污泥處理處置以及應用標準等方面具有重要的理論價值和實際指導意義。
圖1污泥樣品中志賀氏菌特異性PCR擴增結果。圖2MPN Calculator初始化時顯示結果。圖3輸入脫水前實驗數據計算后MPN Calculator顯示結果。圖4輸入脫水后實驗數據計算后MPN Calculator顯示結果。
具體實施例方式實施例1測定江蘇無錫某污水處理廠二沉池脫水前后剩余污泥中志賀氏菌的數
量
1、樣品的梯度稀釋和前增菌培養稱取某污水處理廠二沉池脫水前后剩余污泥樣品各 3. OOg污泥到到盛有27mL GN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5-lOmin，使混合均勻。 取0. 5mL GN增菌液稀釋混勻的泥水混合物加入到滅菌的4. 5mL GN增菌液中得到6個稀釋 梯度，每個稀釋度設三個重復，于37°C培養18h。2、選擇性增菌培養包括將增菌培養后的菌液各試管取0. 5mL懸液加入到志賀氏 菌增菌肉湯中，37°C培養24h。3、DNA提取過程包括將步驟(2)取2mL培養好的菌液到IOmL離心管中，IOOOOg 離心3 min，棄去上清液；再加入ImL無菌PBS，輕輕吹打均勻，IOOOOg離心3 min，棄去上 清液。加入10 μ L超純水，液氮冷凍和沸水浴反復凍融3次，然后IOOOOg離心3min取上清 液，完成DNA提取。短時間內使用4°C保存，長時間使用需用-20°C保存。4、PCR擴增及擴增產物檢測PCR為50 μ L反應體系10 X PCR buffer (含MgCl2) 5 μ L, dNTPs (2. 5mmol/L) 4. 0 μ L，引物 P1、P2 (20mmol/L)各 0. 5 μ L，DNA 模板 1 μ L,rTaq 酶(5U/ μ L) 0. 25 μ L，滅菌雙蒸水加至50 μ L。PCR反應條件94°C預變性5min ；94°C變性 30s, 55°C退火30s，72°C延伸lmin，經30個循環；最后72°C延伸lOmin。PCR擴增產物鑒定取擴增產物1 μ L，力Π 5 μ L的6 X buffer,混勻，點樣到每20mL 瓊脂糖含1 μ L Goldview的1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，以2000bp Maker作為標準分子參照，以 電壓120 V于IXTAE電泳緩沖液中電泳30min，然后利用凝膠成像系統進行拍照。5、MPN計數根據凝膠成像系統拍照結果，將產生特異性擴增條帶的為陽性，不產 生特異性條帶的為陰性，以出現陽性和陰性反應所對應的稀釋度，記錄試驗結果(見表1、 2)，將實驗數據輸入MPN Calculator軟件，計算樣品中志賀氏菌的含量。 表1脫水前剩余污泥中志賀氏菌MPN結果
權利要求
一種污泥中志賀氏菌的快速定量檢測方法，其特征在于檢測步驟如下 (1)污泥樣品的梯度稀釋和前增菌培養取城市剩余污泥樣品混勻，稱取3g城市剩余污泥到盛有27mL GN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5 10min，混合均勻得泥水混合物；取0.5mL GN增菌液稀釋混勻的泥水混合物加入到經過滅菌的4.5mL GN增菌液中得到各個稀釋梯度，設5 7個稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個稀釋度設3 5個重復樣，于37℃培養18 24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；(2)選擇性增菌培養移取步驟(1)所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養18 24h；(3)DNA提取移取步驟(2)所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3 min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3 min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短時間內4℃保存，長時間 20℃保存；(4)PCR擴增及擴增產物檢測PCR為50μL反應體系取步驟(3)所得DNA 模板1μL，含MgCl2的10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L的dNTPs 4.0μL，均為20mmol/L的引物P1、P2各0.5μL，5U/μL的rTaq酶0.25μL，加入滅菌雙蒸水至50μL；PCR反應條件94℃預變性5min；94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，經30個循環；最后72℃延伸10min；延伸后的擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統進行拍照，產生特異性擴增條帶的即為陽性，不產生特異性條帶的即為陰性；所述特異性引物為P15’ CATGGCTGGAAAAACTCAGTGC 3’；P25’ CTCATACTTCTGCTCTTCTGCC 3’；(5)用MPN計數軟件計算結果根據凝膠成像系統拍照結果，確定最大或然數MPN結果，用MPN Calculator軟件計算得出污泥中最大可能的志賀氏菌含量。
全文摘要
一種污泥中志賀氏菌的快速定量檢測方法，屬于生物技術中病原菌檢測技術領域。本發明依次包括以下步驟(1)污泥樣品的梯度稀釋及前增菌培養；(2)選擇性增菌培養；(3)DNA提取；(4)PCR擴增及擴增產物檢測；(5)利用MPN計數軟件計算得出結果。本發明采用MPN法和特異性PCR檢測相結合的方法，實現了污泥中志賀氏菌的快速定量檢測，選擇性增菌和特異性PCR能避免其他微生物的干擾，提高檢測的靈敏度和特異性。本發明還具有縮短檢測時間、提高檢測效率和增大檢測樣品量的優點。
文檔編號C12Q1/68GK101993954SQ20101056688
公開日2011年3月30日 申請日期2010年12月1日 優先權日2010年12月1日
發明者劉和, 王燕, 符波, 陳燕 申請人:江南大學