專利名稱：用于轉基因玉米品系mir604常溫檢測的lamp引物組的制作方法
技術領域：
本發明涉轉基因玉米品系檢測領域，提供了利用常溫擴增技術對轉基因玉米品系 MIR604的檢測，適用于口岸檢驗檢疫機構應用。
背景技術：
伴隨著轉基因技術的迅猛發展，全球農業生物技術的產業化速度也隨之大大加 快，轉基因作物的推廣種植面積逐年遞增，然而，由于目前對轉基因產品的安全性尚無定 論，各國政府和消費者普遍對此采取謹慎的態度，紛紛出臺一系列法規對轉基因產品的貿 易加以限制，要求對轉基因作物及其加工產品進行標識。因此，建立完善的轉基因農產品及 食品檢測體系顯得尤其重要。轉基因涉及的作物種類繁多，包括大豆、玉米、小麥、棉花、番茄、馬鈴薯等，而每個 轉基因品系在轉基因和育種過程中采取的策略不同，造成每個品系都有獨特的基因組插入 位置及邊界序列，目前我國對轉基因玉米品系采取審批制度，未經允許的玉米品系禁止進 入我國，而目前對具體玉米品系的檢測的檢測方法還在研究過程中，因此需要設計特異的 品系檢測方法，滿足進出境轉基因產品品系鑒定的需求。由于普通PCR方法、實時熒光PCR檢測方法需要變溫過程及其相應的快速升降溫 及溫度控制，也就需要價格高昂的專用PCR設備，昂貴的儀器設備以及嚴重的污染問題(假 陽性率高)，限制了 PCR檢測方法的推廣。而現場檢測要求降低對儀器的依賴，等溫擴增 方法可以解決目前轉基因生物安全檢測對儀器依賴程度高的缺陷和不足，滿足現場檢測需要。本發明應用LAMP引物恒溫擴增技術運用于轉基因玉米品系MIR604的快速檢測， 可以免除高昂的儀器投入，便于基層及現場檢測使用，同時對其他轉基因品系的快速檢測 也具有很重要的借鑒意義。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供用于檢測轉基因玉米品系MIR604的LAMP引物組。本發明用于檢測轉基因玉米品系MIR604的LAMP引物序列為F35' -ACGCCAGATCACACATGGA-3‘B35’ -GCCAATTCCTGCAGCGTT-3 ‘FIP 5' -AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCTTTTGGCAGCTAGCCGAGCA-3'BIP 5‘ -AGGGAGTCACGTTATGACCCCCTTTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAA-3‘LF 5，-GCGTGCGCAGAGCGCC-3，LB 5’ -GCCGATGACGCGGGACAA-3’用上述引物組隊待測樣品DNA進行恒溫擴展，若結果產生梯狀DNA條帶，則該樣品 含有轉基因玉米品系MIR604，若擴增結果沒有出現條帶，則該樣品中不含有轉3
基因玉米品系MIR604。與現有技術相比，本發明的進步在于檢測儀器簡單，無需昂貴的PCR儀投入，只 需簡單的水浴鍋即可，降低了實驗室投入，適合基層實驗室推廣使用。
附圖1. LAMP引物組恒溫擴增結果。泳道為轉基因玉米品系MIR604，均能擴增出梯 狀DNA條帶，泳道為對照，而未出現條帶。M為DL2000Marker，5泳道為MIR604，11泳道為陰性對照，1.其余泳道為其他玉米轉基因品系
具體實施例方式lamp引物設計1 AAGAGAAGAA MATTCGTCC ATGGGGCCAC GGCCTCTTCT GCAGGCATTT GGCATGTGM61 GGAACCCGAA CCAGTGMTG GAGATGGACG GATGCTGCTC AGATACGCAG TCMACCTGC121 CGGCGAMTT ACGGGGGGAG CTGGCTGGCT GGCTGGCTGG ACGCCAGATC ACACATGGATF3181AGAAGGCGGG
241 AAACGACAAT CTGATCATGAggcg ctctgcgcac gc AATTCAACGCGGAGAATT AAGGGAGTCA CGTTATGACCCCC gccgatgGACGCGGCAC GGCAGCTAGC CGAGCA F2IFlCBlC301 Iacgcgggaca a|gccgtttta cgtttggaac tgacagaacc gcaacgctgc aggaattggcLBB2B3361 CGCAGCGGCC ATTTAAATCA ATTGGGCGCG CCGAATTCGA GCTCGGTACA AGCTTGCACA421 TGACAACAAT TGTAAGAGGA TGGAGACCAC AACGATCCAA CAATACTTCT GCGACGGGCTF3 :ACGCCAGATCACACATGGAB3 :GCCAATTCCTGCAGCGTTFIP = F1C+F2 :AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCTTTTGGCAGCTAGCCGAGCABIP = B1C+B2 :AGGGAGTCACGTTATGACCCCCTTTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAALF :GCGTGCGCAGAGCGCCLB :GCCGATGACGCGGGACAA試劑和設備水浴鍋，引物由上海英俊生物技術有限公司合成，Bst DNA聚合酶購自NEB，甜菜堿 (Betaine)、DNTPmix 購自 Sigma,，標本來源本發明說采用的玉米品系樣品59122、GA21、3272、M0N863、MIR604、NK603、TC1507、 BT11、DBT418、M0N810 等購自 SIGMA,4
編碼 玉米品系_1591222GA21332724M0N8635MIR6046NK6037TC15078BTll9DBT41810M0N810實施例1、轉基因玉米品系MIR604LAMP引物檢測方法DNA提取50mg左右玉米粉末，用Qiagen Dneasy Plant Mini Kit試劑盒提取 DNA。反應體系每反應的混合液總體積為25 μIO^ThermoPolBuffer 2· 5 μ 1IOmM DNTPmix1 μ 15Μ Betaine5 μ 110 μ M FIP2μ 110 μ M BIP2μ 110 μ M F3v0. 5μ 110 μ M Β30. 5μ 110 μ M LF1 μ 110 μ M LB1 μ 18U/1 Bst 酶1 μ 1DD H2O8μ 1模板DNA0. 5μ 1_25 μ 1反應程序63°C水浴鍋反應lh。結果5泳道樣品為轉基因玉米品系MIR604，擴增出現梯狀特異性條帶，結果表 明本發明引物對的特異性強，對其它轉基因玉米品系59122、GA21、3272、M0N863、M0N810、 NK603、TC1507、BT11、DBT418等等玉米品系沒有非特異性條帶出現。序列表<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列
<400>1ACGCCAGATCACACATGGA 19<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2GCCAATTCCTGCAGCGTT 18<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>3AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCTTTTGGCAGCTAGCCGAGCA 41<210>1<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>4AGGGAGTCACGTTATGACCCCCTTTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAA 45<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>5GCGTGCGCAGAGCGCC 16<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6GCCGATGACGCGGGACAA 18權利要求
1.一種用于轉基因玉米品系MIR604檢測的LAMP引物組，其特征在于，序列為 F3 :5， -ACGCCAGATCACACATGGA-3，B3 :5’ -GCCAATTCCTGCAGCGTT-3‘FIP :5’ -AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCTTTTGGCAGCTAGCCGAGCA-3’ BIP :5’ -AGGGAGTCACGTTATGACCCCCTTTTGCGGTTCTGTCAGTTCCAA-3’ LF :5’ -GCGTGCGCAGAGCGCC-3， LB :5’ -GCCGATGACGCGGGACAA-3’
2.一種用于轉基因玉米品系MIR604檢測的常溫擴增方法，其特征在于，用權利要求1 中的LAMP引物組對待測樣品進行DNA擴增，擴增條件63°C 1小時，如果電泳結果產生特異 梯狀譜帶，則該樣品含有轉基因玉米品系MIR604，如果結果沒有出現特異梯狀譜帶，則樣品 中不含有轉基因玉米品系MIR604。
3.基于權利要求1和權利要求2的用于轉基因玉米品系MIR604核酸檢測試劑盒。
全文摘要
用于檢測轉基因玉米品系MIR604的常溫擴增用LAMP核酸引物，上述LAMP擴增用核酸引物包含FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物、LF引物和LB引物，本發明的LAMP檢測體系具有良好的特異性、靈敏度，能快速、方便、高效的檢測轉基因玉米品系MIR604，滿足口岸及基層實驗室對轉基因玉米品系MIR604檢測的需要。
文檔編號C12Q1/68GK102051416SQ201010566578
公開日2011年5月11日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者劉躍庭, 廖芳, 張裕君, 賀艷, 鄭文杰 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心