專利名稱：用于苜蓿疫霉根腐病菌常溫快速檢測的lamp引物組的制作方法
技術領域：
本發明涉植物保護領域，提供了針對苜蓿疫霉根腐病菌的常溫快速檢測方法，適 用于口岸檢驗檢疫機構應用。
背景技術：
紫花苜蓿是豆科、苜蓿屬多年生草本植物，是世界上種植最多的牧草品種.由 于其適應性廣、產量高、品質好等優點，素有“牧草之王”的美稱。苜蓿根腐病是導致紫 花苜蓿產量損失的主要病害之一，導致該病的病原物為苜蓿根腐病菌(Wiytophthora medicaginis Ε. Μ. Hans. etD. P. Maxwell)，屬于藻物界、卵菌門、卵菌綱、腐霉目、腐霉科、疫 霉屬，能寄生苜蓿屬植物、鷹嘴豆、獼猴桃、胡蘿卜等等多種重要的經濟作物，其中紫花苜 蓿、鷹嘴豆是其主要的寄主，苜蓿疫霉根腐病菌在各大洲都有分布，范圍包括日本、巴基斯 坦、土耳其、希臘、加拿大、美國阿根廷、澳大利亞、南非等，目前苜蓿根腐病還沒有在我國發 生的報道。2007年我國發布并實施的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》將檢 疫性有害生物由原來的84種增加到435種，而苜蓿疫霉根腐病菌就是新增病害之一，到目 前為止，各口岸對對苜蓿疫霉根腐病菌的檢疫還處于無據可依的狀態，因此需要盡快建立 檢測方法和標準，防止該危險性病原菌傳入我國。相比普通PCR擴增方法，LAMP恒溫擴增技術具有以下優點(1)特異強，4條引物 對靶序列的6個特異序列區的識別，保證了 LAMP擴增的高度特異性，( 敏感性高，其瀑 布式擴增大大提高了擴增效率，大大高于傳統PCR方法，(3)擴增溫度恒定，無需精確控溫， LAMP方法實現了等溫條件下擴增，無需頻繁升降溫及精確的溫度控制，簡單的水浴鍋即可 實現擴增，從而大大降低了儀器的投入，(4)操作簡便，無需復雜的程序設計，大大降低了核 酸擴增的技術要求。本發明應用LAMP引物恒溫擴增技術運用于苜蓿疫霉根腐病菌的快速檢測，特異 性、靈敏度比普通變溫擴增PCR方法更高，同時可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供用于檢測苜蓿疫霉根腐病菌的LAMP引物組。本發明用于檢測苜蓿疫霉根腐病菌的LAMP引物序列為F3 :5， -AAACCTATCAGCGAAGGC-3，B3 5’ -ATATTGGACATAACGAGCCT-3’FIP 5' -TCACCATGCATGCGTACTTAGTGGATTTCCTAAGTTCGCACCA-3'BIP 5‘ -GTGCAGCGTTGACGTGTTAAACGGAACTTTCGTTTTGGAGGA-3‘用上述引物組隊待測樣品DNA進行恒溫擴展，若結果產生梯狀DNA條帶，則該樣品 含有苜蓿疫霉根腐病菌，若擴增結果沒有出現條帶，則該樣品中不含有苜蓿疫霉根腐病菌。3
與現有技術相比，本發明的進步在于檢測儀器簡單，無需昂貴的PCR儀，只需簡 單的水浴鍋或其他溫控設備即可，降低了實驗室投入，適合基層實驗室推廣。
附圖.LAMP引物組恒溫擴增結果。2號泳道為苜蓿疫霉根腐病菌，能擴增出梯狀 DNA條帶，其余泳道為對照，除了基因組DNA條帶外，均未擴增出梯狀條帶。M :DL2000Marker, 1 :H20，2，苜蓿疫霉根腐病菌，3 大豆疫霉，4 苧麻疫霉，5 惡疫 霉，6 馬鈴薯緋腐疫霉，7 辣椒疫霉，8 馬鈴薯晚疫病菌，9 大豆疫霉，10 煙草疫霉
具體實施例方式LAMP引物設計1 TTCGAGCCAGCAGAATGAGAAAGCGAGGACAAGAAGGATCAAGTCATGAGAAGACAAGAG61 AACGACAACCAGACAATCTACCGGTAGTCGTCGATAAGAGACCAAATAAATGTAGACTCG121 TCTGCGGCACGTGTTACTGATACACCGAAAAAAATGCAGTTTTACAGCTGTCTATTCAGA181 AAAAACTGTAGTTCAAGTGAAACATATGTTTCTTTCGCTATGTACATACGTAATTAAATG241 AAATTATAGTTTACGTTTTTAGCATCTGCCTCCATATCTACAGAATTCAACTTTATTCAA301 ACGACCAAGTTTTGTAGGTAATATCACATGATCCAAATCGATTCACATTCGGTATTGCAAF3361 TGTAAACCTTCGGTATCATTTGGTGTATGCAACGGGGCCCCACGAGAGCAATTTCCATAAF2LF421 TCCAGTACCAATGTGCTGGATTTTGAAACC TATCAGCGAA GGCTGTCCCAAAACCAGTAGFlBlLB481 GGATTTCCTAAGTTCGCACCAATTAATAGTCAGTACTTTAACTAAGTACGCATGCATGGTB2B3541 GATTAATACTCGGTGTTGCGAGGACGTGCAGCGTTGACGTGTTAAAACTTCTTCGATGGG601 CTAAACGCGCACTTCCTCCAAAACGAAAGTTCCGATGGAA GGCTCGTTATGTCCAATATT661 AACTCCATTTAGAGCTTTGCATCAATTTGTGGCGATGAAATGGGTACTAACTTTATGTCT
F3 CGGTATTGCAATGTAAACCTB3 :ATCACCATGCATGCGTACFIP :TCCAGCACATTGGTACTGGATTATATCATTTGGTGTATGCAACGGBIP :AACCTATCAGCGAAGGCTGTCCTGACTATTAATTGGTGCGAACLF :TGGAAATTGCTCTCGTGLB :AAACCAGTAGGGATTTCC試劑和設備水浴鍋，引物由上海英俊生物技術有限公司合成，Bst DNA聚合酶購自NEB，甜菜堿 (Betaine)、DNTPmix 購置 Sigma,，標本來源本發明說采用的苜蓿疫霉根腐病菌、大豆疫霉、馬鈴薯緋腐疫霉等購自ATCC，惡疫 霉、煙草疫霉、苧麻疫霉、辣椒疫霉、馬鈴薯晚疫霉等來自我國不同地區的分離物，見下表編碼種名來源編碼種名來源1苜猜疫霉根腐病菌Phytophthora. medicaginis美國2大豆疫霉Λ sojae美國3苧麻疫霉只boehmeriae中國4惡疫霉尸cactorum中國5馬鈴薯緋腐疫霉P. erythroseptica美國6辣椒疫霉Λ capsici美國7馬鈴薯晚疫霉Λ infestans中國8大豆疫霉P. sojae中國9煙草疫霉Λ nicotianae中國實施例1、苜蓿疫霉根I奪病菌LAMP引物檢測方法DNA 提取50mg 左右菌絲，用 Qiagen Dneasy Plant Mini Kit 試劑盒提取 DNA。反應體系每反應的混合液總體積為25 μ 1IO^ThermoPolBuffer2. 5μ 1IOmM DNTPmix1 μ 15Μ Betaine1 μ 110 μ MFIP2μ 110 μ MBIP2μ 110 μ MF30. 5μ 110 μ ΜΒ30.5 μ 110 μ MLF1μ 110 μ M LB1μ 18U/y IBst 酶1μ 1DDH2012μ 1
模板 DNA 0. 5μ 125 μ 1反應程序65°C反應lh。結果2號泳道為苜蓿疫霉根腐病菌，出現梯狀特異性條帶，其余泳道除了基因組 DNA條帶外，均未出現梯狀條帶，結果表明本發明引物對的特異性強，對其它同屬其它真菌 如大豆疫霉、苧麻疫霉、惡疫霉、馬鈴薯緋腐疫霉、辣椒疫霉、馬鈴薯晚疫霉、煙草疫霉等等 沒有非特異性條帶出現。0075]序列表0076]<210>10077]<211>200078]<212>DNA0079]<213>人工序列0080]<400>10081]CGGTATTGCAATGTAAACCT 200082]<210>10083]<211>180084]<212>DNA0085]<213>人工序列0086]<400>20087]ATCACCATGCATGCGTAC 180088]<210>10089]<211>450090]<212>DNA0091]<213>人工序列0092]<400>30093]TCCAGCACATTGGTACTGGATTATATCATTTGGTGTATGCAACGG 450094]<210>10095]<211>430096]<212>DNA0097]<213>人工序列0098]<400>40099]AACCTATCAGCGAAGGCTGTCCTGACTATTAATTGGTGCGAAC 430100]<210>10101]<211>170102]<212>DNA0103]<213>人工序列0104]<400>50105]TGGAAATTGCTCTCGTG 170106]<210>16
<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6AAACCAGTAGGGATTTCC
權利要求
1.一種用于苜蓿疫霉根腐病菌常溫快速檢測的LAMP引物組，其特征在于，序列為 F3 :5’ -CGGTATTGCAATGTAAACCT-3‘B3 :5， -ATCACCATGCATGCGTAC-3，FIP :5’ -TCCAGCACATTGGTACTGGATTATATCATTTGGTGTATGCAACGG-3’ BIP :5’ -AACCTATCAGCGAAGGCTGTCCTGACTATTAATTGGTGCGAAC-3， LF :5’ -TGGAAATTGCTCTCGTG-3’ LB :5’ -AAACCAGTAGGGATTTCC-3’
2.一種用于苜蓿疫霉根腐病菌常溫快速檢測方法，其特征在于，用權利要求1中的 LAMP引物組對待測樣品進行DNA擴增，擴增條件63°C 1小時，如果電泳結果顯示特異梯狀 譜帶，則該樣品含有苜蓿疫霉根腐病菌，如果結果沒有出現特異梯狀譜帶，則樣品中不含有 苜蓿疫霉根腐病菌。
3.基于權利要求1和權利要求2的用于苜蓿疫霉根腐病菌常溫快速檢測試劑盒。
全文摘要
用于常溫快速檢測苜蓿疫霉根腐病菌的擴增用核酸引物，上述LAMP擴增用核酸引物包含FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物、LF引物和LB引物，本發明的LAMP檢測體系具有良好的特異性、能在63℃條件下，快速、方便、高效的檢測苜蓿疫霉根腐病菌，能滿足口岸對苜蓿疫霉根腐病菌快速檢測的需要。
文檔編號C12Q1/68GK102051415SQ20101056657
公開日2011年5月11日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者劉鵬, 崔鐵軍, 廖芳, 張裕君, 王金成, 黃國明 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心