一種優化改良的耐高溫植酸酶phyth及其基因和應用的制作方法

專利名稱：一種優化改良的耐高溫植酸酶phyth及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種優化改良的耐高溫植酸酶 PHYTH及其基因和應用。
背景技術：
植酸(Phytate，Phytic acid, IP6)又稱肌醇六磷酸脂，結構復雜。植酸分子含有 6個磷酸基團，帶有豐富的磷，植酸是飼料中磷的重要貯存形式。磷是動物機體必需礦物元 素，單胃動物體內缺乏分解植酸的植酸酶(Phytase，催化植酸及植酸鹽水解的酶)，造成飼 料中磷的利用率僅有1/3或更低，為了補充有效磷的不足，必須在飼料中添加無機磷酸鹽， 常用的為磷酸氫鈣和骨粉。這樣不僅大大增加了飼料的成本，而且大量的植酸磷不能被利 用而直接排出體外，造成磷源的浪費及嚴重的環境問題。單胃動物飼料中通過添加植酸酶， 可以提高飼料中植酸磷的利用率，減少磷的排出對環境的污染。植酸酶(EC3. 1. 3. 8)即肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷 酸(或磷酸鹽)的一類酶的總稱。當飼料中存在足量的植酸時，添加適量植酸酶可以替代 部分補加的無機磷酸鹽。同時也避免植酸磷與動物體內的多種金屬離子以及蛋白質螯合成 相應的不溶性復合物，而導致動物對這些營養元素無法有效利用。隨著生物技術的發展，特別是DNA重組技術的應用，使各種微生物來源的植酸 酶基因的大規模表達成為可能。目前來源于Escherichia coli，Aspergillus niger、 Aspergillus fumigatus、Selenomonas ruminantium等微生物的植酸酶已經在巴斯德畢赤 酵母中得到表達。但是，顆粒飼料生產中需要經歷一個短暫的高溫階段，一般在85-95°C。 植酸酶本身就是一種蛋白質，在高溫條件下會變性失活。現在大多數商品植酸酶都不能耐 高溫，高溫制粒過程造成酶活的急劇下降，無法滿足實際應用要求。如何使植酸酶既能短暫 耐高溫又能在動物體中具有高酶活是目前飼料用植酸酶制劑急需解決的一個問題。來源于大腸桿菌植酸酶APPA具有高比活性的優點，并且已經被克隆并測序 (The complete Nucleotide sequence of the Escherichia coli gene appA reveals significant homology between pH2. 5 Acid phosphatase and glucose—l—phosphatase· Journal of Bacteriology, Sept. 1990，p. 5497-5500)該基因全長 1299bp，編碼 432 個氨基 酸。N端的22個氨基酸為信號肽。APPA的最適溫度為60°C，但其熱穩定性較差，在60°C下 保溫10分鐘其剩余酶活性別僅為50%，在80°C下保溫10分鐘其剩余酶活性在15%以下， 因此，在動物飼料制粒過程中酶活性損失過大，剩余不到20%的活性，使得其在具體的應用 中受到限制，因此如何利用基因工程的手段來提高其熱穩定性，是解決其應用的關鍵點。

發明內容
本發明的目的是通過對大腸桿菌植酸酶APPA的改造，使改造后的植酸酶在溫度 的耐受性方面更加優良，最終達到工業化生產的要求。本發明的目的是提供一種優化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因。
本發明的再一目的是提供一種優化改良大腸桿菌Escherichia coli的植酸酶 APPA耐熱性的方法。本發明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重組載體。本發明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重組菌株。本發明的再一目的是提供一種表達植酸酶PHYTH的方法。本發明的再一目的是提供上述植酸酶PHYTH的應用。大腸桿菌植酸酶APPA的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示MKAILIPFLS LLIPLTPQSA FAQSEPELKL ESVVIVSRHG VRAPTKATQLMQDVTPDAffP 60TffPVKLGffLT PRGGELIAYL GHYQRQRLVA DGLLAKKGCP QSGQVAIIADVDERTRKTGE 120AFAAGLAPDC AITVHTQADT SSPDPLFNPL KTGVCQLDNA NVTDAILSRAGGSIADFTGH 180RQTAFRELER VLNFPQSNLC LKREKQDESC SLTQALPSEL KVSADNVSLTGAVSLASMLT 240EIFLLQQAQG MPEPGffGRIT DSHQffNTLLS LHNAQFYLLQ RTPEVARSRATPLLDLIKTA 300LTPHPPQKQA YGVTLPTSVL FIAGHDTNLA NLGGALELNW TLPGQPDNTPPGGELVFERff 360RRLSDNSQffI QVSLVFQTLQ QMRDKTPLSL NTPPGEVKLT LAGCEERNAQGMCSLAGFTQ 420IVNEARIPACSL 432本發明優選采用定點飽和基因突變和易錯PCR隨機突變及突變重組的方法對SEQ ID NO. 1所示的大腸桿菌來源的植酸酶APPA進行改造，并經過高通量突變篩選的方法篩選 得到耐高溫植酸酶PHYTH，本發明的植酸酶PHYTH和原有大腸桿菌植酸酶APPA相比，去除前 22個氨基酸的信號肽序列后，有12個氨基酸的差異，突變位點由+45L，+70D，+81S，+133V, +139A, +159H, +209T, +238T, +281T, +316E, +318N, +379T 突變成 +451，+70E, +81T, +133L, +139S, +159K, +209S, +238L, +281S, +316C, +318Q, +379C，突變后的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2所示 MQSEPELKLE SVV I VSRHGV RAP TKA TQLM QDV TPDAWP TWPVK I GWL TP
RGGELIAYLG60
HYQRQRLVAE GLLAKKGCPQ TGQVAI IADV DER TRK TGEA FAAGLAPDCA
I TVH TQAD TSl 20
SPDPLFNPLK TGLCQLDNSN V TDAILSRAG GSIADF TGKR Q TAFRELERV
LNFPQSNLCL1 80
KREKQDESCS L TQALPSELK VSADNVSLSG AVSLASML TE IFLLQQAQGM
PEPGWGRL TD240
SHQWN TLLSL HNAQFYLLQR TPEVARSRA TPLLDL I K TAL SPHPPQKQAY
GV TLP TSVLF300300
IAGHDTNLAN LGGALCLQffT LPGQPDNTPP GGELVFERffR RLSDNSQffIQVSLVFQTLQQ 360MRDKTPLSLN TPPGEVKLCL AGCEERNAQG MCSLAGFTQI VNEARIPACS L 411或者包括大腸桿菌植酸酶APPA的信號肽序列，在APPA氨基酸序列中的第66位用 I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替代V，第160位用S替代 A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代T，第302位用S替代T，第 337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3
所示
MKAILIPFLSLLIPLTPQSAFAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQL
MQDVTPDAffP60
TffPVKIGffLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVAEGLLAKKGCPQTGQVAIIAD
VDERTRKTGE120
AFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGLCQLDNSNVTDAILSRA
GGSIADFTGK180
RQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADNVSLS
GAVSLASMLT240
EIFLLQQAQGMPEPGffGRLTDSHQffNTLLSLHNAQFYLLQRTPEVARSRA
TPLLDLIKTA300
LSPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALCLQffTLPGQPDNTP
PGGELVFERff360
RRLSDNSQffIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLCLAGCEERNAQ
GMCSLAGFTQ420
IVNEARIPACSL 432
該植酸酶PHYTH在溫度的耐受性方面更加優良，在75 °C水溶液中保溫5分鐘:
酶活在90%以上，而未改良的APPA植酸酶在75°C水溶液中保溫5分鐘，剩余酶活不足原來 的10% ；將該優化改良的植酸酶PHYTH添加到飼料中，經90°C高溫制粒處理，其酶活仍保留 90%以上，而未改良的APPA植酸酶經90°C高溫制粒處理，酶活保留不足原來的20%，說明 本發明的經過改良的植酸酶PHYTH達到了工業化生產的耐高溫要求。本發明還提供了上述優化改良的耐高溫植酸酶PHYTH的基因序列，其堿基序列如 SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示SEQ ID NO. 4 atgcaaagcgaacccgaattaaaattagagtcagtcgtgatcgtgtcaagacacggcgtt60
cgtgctccaactaaagcaactcagcttatgcaagacgtaactcctgatgcgtggcccaca120
tggccagtcaaaatagggtggttgactccgagaggtggtgaattgattgcttacttagga180
cattatcagcggcaaagattagtggctgaggggctactagcgaaaaagggatgtccacaa240
actggtcaagtggctattatcgcggatgttgatgaaaggactagaaaaaccggtgaggct300
ttcgctgccggattagcacccgattgtgcaatcacagttcatacgcaagctgacacttct360
tcacccgatccactttttaatcctctaaaaacaggtttgtgtcaattggataactccaat420
gtgaccgacgctatattatcaagagcaggaggctctatcgccgattttactggtaaaagg480
caaacggctt tcagggaattagagagagtgttgaattttccccagtccaatttgtgccta540
aaaagagaga aacaagatgaatcctgttcgttgacacaagccttgccgtctgagctcaaa600
gtctcagcggacaacgtgagtctgtcaggtgcagtatcattagcttcaatgttgacggaa660
attttcctgttgcaacaggctcagggaatgccagaacctgggtggggtagattaactgac720
agtcaccagtggaataccttattgtcgttgcacaatgctcagttctatcttctgcagagg780
acacctgaggttgctcgaagtagagcaacccctcttttggatctaattaaaaccgccttg840
agcccccacccacctcaaaaacaagcatacggtgtcacattacctacatcggttcttttt900
attgccgggcatgatactaacttagccaatttagggggcgctctatgcttgcagtggaca960
ctacctggtcaaccggataatactccgccaggcggagaattagtgttcgaacggtggaga1020
CggttgtCggataattctcaatggatccaagtatcattggttttccagactttgcagcaa1080
atgagggataagacccccctatcgctgaacactcccccaggtgaagttaagctctgcttg1140
gcaggctgcgaagaaagaaatgcccagggaatgtgctccttagccggcttcactcagatt1200
gtaaatgaagccaggattcctgcctgttccCtg1233
SEQ ID NO.5
包含信號序列的突變后核苷酸序列
atgaaagcgatcttaatcccatttttatctcttctgattccgttaaccccgcaatctgcattcgct
caaagcgaacccgaattaaaattagagtcagtcgtgatcgtgtcaagacacggcgtt60
cgtgctccaactaaagcaactcagcttatgcaagacgtaactcctgatgcgtggcccaca120
tggccagtcaaaatagggtggttgactccgagaggtggtgaattgattgcttacttagga180
cattatcagcggcaaagattagtggctgaggggctactagcgaaaaagggatgtccacaa240
actggtcaagtggctattatcgcggatgttgatgaaaggactagaaaaaccggtgaggct300
ttcgctgccggattagcacccgattgtgcaatcacagttcatacgcaagctgacacttct360
tcacccgatccactttttaatcctctaaaaacaggtttgtgtcaattggataactccaat420
gtgaccgacgctatattatcaagagcaggaggctctatcgccgattttactggtaaaagg480
caaacggctttcagggaattagagagagtgttgaattttccccagtccaatttgtgccta540
aaaagagaga aacaagatgaatcctgttcgttgacacaagccttgccgtctgagctcaaa600
gtctcagcggacaacgtgagtctgtcaggtgcagtatcattagcttcaatgttgacggaa660
attttcctgttgcaacaggctcagggaatgccagaacctgggtggggtagattaactgac720
agtcaccagtggaataccttattgtcgttgcacaatgctcagttctatcttctgcagagg780
acacctgaggttgctcgaagtagagcaacccctcttttggatctaattaaaaccgccttg840
agcccccacccacctcaaaaacaagcatacggtgtcacattacctacatcggttcttttt900
attgccgggcatgatactaacttagccaatttagggggcgctctatgcttgcagtggaca960
ctacctggtcaaccggataatactccgccaggcggagaattagtgttcgaacggtggaga1020
CggttgtCggataattctcaatggatccaagtatcattggttttccagactttgcagcaa1080
atgagggataagacccccctatcgctgaacactcccccaggtgaagttaagctctgcttg1140
gcaggctgcgaagaaagaaatgcccagggaatgtgctccttagccggcttcactcagatt1200
gtaaatgaag ccaggattcc tgcctgttcc ctg
本發明還提供了一種優化改良大腸桿菌Escherichia coli的植酸酶APPA耐熱性
的方法，具體地，是通過定點飽和基因突變和易錯PCR隨機突變及突變重組的方法改變SEQID NO. 1所示的來源于大腸桿菌Escherichia coli的植酸酶APPA的多個氨基酸，包括其氨 基酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L 替代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代 T，第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T。本發明還提供了包含上述優化改良的植酸酶基因PHYTH的重組載體，將本發明的 優化改良的植酸酶基因PHYTH插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸 序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選為將 本發明的植酸酶基因PHYTH插入到質粒pPICzalphaA上的EcoR I和Not I限制性酶切 位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調控，得到重組酵母表達質粒 pPICz α A-PHYTH。本發明還提供了包含上述植酸酶基因PHYTH的重組菌株，優選重組菌株是畢赤酵 母菌株Χ33。本發明還提供了表達上述植酸酶PHYTH的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)重組菌株進行發酵，誘導重組植酸酶的表達；3)發酵結束后，回收并純化所表達的植酸酶ΡΗΥΤΗ。具體地，將重組酵母表達質粒？？1(2(14- 附^，轉化到酵母宿主菌株乂33中，用高 濃度的抗生素平板篩選高拷貝的轉化子，將篩選到的轉化子，在7L的發酵罐中進行發酵， 發酵過程中，每隔24h取發酵液測定0D_以及菌體濕重，取上清液進行植酸酶活性檢測。發 酵結束最終平均發酵酶活達到14300U/mL，實現的植酸酶PHYTH的高效表達。本發明還提供了上述植酸酶PHYTH在飼料添加劑中的應用。本發明為了解決現有技術的不足，利用基因工程手段對大腸桿菌植酸酶APPA的 進行改良，以解決大腸桿菌植酸酶APPA熱穩定性差，不能適用于工業生產的要求，經過優 化改良的植酸酶PHYTH其熱穩定性得到很大的提高，在75°C水溶液中保溫5分鐘，剩余酶活 在90%以上，能夠滿足工業生產中高溫制粒的要求。并且通過高通量篩選，獲得高表達量的 菌株，進一步滿足工業化生產降低成本的要求，因此，本發明的優化改良的植酸酶可在飼料 工業中顯示出巨大的應用潛力。


圖1為pPICz α A-PHYTH酵母菌株在7升發酵罐中的發酵情況。圖2為植酸酶APPA和PHYTH在不同ρΗ值環境下的相對酶活曲線圖。圖3為植酸酶APPA和PHYTH經不同溫度處理后的相對酶活曲線圖。
具體實施例方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》 (第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行； 所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實驗材料和試劑1、菌株與載體
大腸桿菌菌株ToplO、畢赤酵母 X33、載體 pPICzalphaA，Zeocin 購自 Invitrogen 公司，載體PECO購自Gentarget公司。2、酶與試劑盒PCR酶，質粒提取，膠純化，限制性內切酶、試劑盒購自上海生工公司。3、培養基大腸桿菌培養基為LB (1 %蛋白胨，0. 5 %酵母提取物，1 % NaCl，pH7. 0)。LB-AMP為 LB培養基加100ug/mL氨芐青霉素。LB-Zeo為LB培養基加25ug/mLZeocin。酵母培養基為YPD (1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖)。酵母篩選培養基為 YPDzeo (YPD+100mg/L zeocin)。酵母誘導培養基BMGY(I %酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% ΥΝΒ、0. 00004 % Biotin、l%甘油(V/V))和BMMY(除以0.5%甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同)。重組酵母發酵培養基本鹽培養基磷酸氫二銨5%、磷酸二氫鉀0. 5%、七水硫酸 鎂1.5%、硫酸鉀1.95%、硫酸鈣0. 1%、氫氧化鉀0. 1%、消泡劑0.03%。高壓后每升加 4. 35 毫升 PTMl。PTMl (微量鹽溶液)硫酸銅0. 6 %、碘化鉀0. 018 %、一水硫酸錳0. 3 %、二水鉬 酸鈉0. 02 %、硼酸0. 002 %、六水氯化鈷0. 05 %、氯化鋅2 %、七水硫酸鐵6. 5 %、濃硫酸 0. 5%、生物素 0. 02%。實施例1、大腸桿菌植酸酶基因APPA的合成及克隆以已公布的大腸桿菌來源的植酸酶基因APPA序列作為參考，應用生物軟件 UPGENE，根據畢赤酵母最適密碼子人工合成該基因。根據基因5’端設計PCR引物含有EcoRI內切酶位點，3’端設計PCR引物含NotI 內切酶位點，起引物序列如下5，端弓丨物 PHYTH-Fl :gtaGAATTCatgcaaagcgaacccgaattaaaattag3'端引物 PHYTH-Rl :attGCGGCCGCttacagggaacaggcaggaatcctg以合成基因為模板，用上述引物進行PCR擴增，將擴增得到的片段克隆到載體 pECO上，得到重組載體pECO-PHYTH。實施例2、基因定點突變對去除了信號肽的大腸桿菌植酸酶APPA進行蛋白結構自動建模分析 (swissmodel)，分析其二級結構和三級結構。APPA共有410個氨基酸殘基，其中共有20個a 螺旋，其15-23個氨基酸殘基為酸性植酸酶所共有的保守序列RAGVRAPT。該蛋白共有兩個 結構域N端的134個氨基酸殘基與C端的152的氨基酸殘基共同組成結構域1，其余中間 124氨基酸殘基組成結構域2，保守序列與活性中心均位于結構域1中。在不破壞其二級結 構與活性中心的前提下，對活性中心附近以及二級結構連接處進行氨基酸定點突變。共預 測了 17 個待突變位點，分別為:+7L, +45L，+70D, +77G，+112T，+133V，+150G, +159H，+210G， +238T, +2623E, +281T, +297S, +316E, +343S, +379T, +4061 針對性的設計了 17 對飽和突變 引物，目的基因突變位點統一為NNK，NNK左右各取15個堿基構成正向引物；反向引物與正 向引物完全互補，其中，N代表A，T，C，G等四種堿基，K代表G，T等兩種堿基。PCR產物經DpnI酶切處理后轉化BL21感受態細胞，在LB-Amp平板篩選陽性突變 重組克隆。通過定點突變PCR得到10個相關氨基酸位點突變的陽性克隆，突變位點為+45L，+70D, +133V, +159H, +238T, +262E, +281T, +296S, +316E, +379T 突變成 +451，+70E, +133L, +159K, +238L，+2621，+281S，+296N, +316C，+379C。對陽性突變位點進行隨機重組得到最優 組合，其含有 8 個突變位點，為 +45L，+70D, +133V，+159H，+238T，+281T，+316E，+379T 突變 成+451，+70E, +133L, +159K, +238L, +281S, +316C, +379C，該克隆命名為 pEC0-PHY_M8。實施例3、基因易錯PCR隨機突變以上述pEC0-PHY-M8為模板，進行易錯PCR隨機突變擴增，具體地擴增方法是第一輪擴增以載體啟動子引物T7-F和T7-R為引物進行PCR擴增，反應體系如 下
權利要求
1.一種優化改良的耐高溫植酸酶PHYTH，其特征在于，其氨基酸序列為SEQ IDN0.2所示。
2.根據權利要求1所述的植酸酶PHYTH，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDN0. 3所示。
3.一種優化改良的耐高溫植酸酶基因PHYTH，其特征在于，編碼權利要求1或2所述的植酸酶。
4.如權利要求3所述的植酸酶基因PHYTH，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
5.一種優化改良植酸酶APPA耐熱性的方法，其特征在于，通過基因突變改變SEQ ID NO. 1所示的來源于大腸桿菌Escherichia coli的植酸酶APPA的多個氨基酸，包括其氨基 酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替 代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代T， 第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T。
6.包含權利要求3或4所述的植酸酶基因的重組載體。
7.根據權利要求6所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為PPICzα A-PHYTH。
8.包含權利要求3或4所述的植酸酶基因的重組菌株。
9.一種表達權利要求1或2所述優化改良的植酸酶PHYTH的方法，其特征在于，包括以 下步驟1)用權利要求7所述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)重組菌株進行發酵，誘導重組植酸酶的表達；以及3)發酵結束后，回收并純化所表達的植酸酶PHYTH。
10.權利要求1或2所述的植酸酶PHYTH在飼料添加劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種優化改良的耐高溫植酸酶PHYTH及其基因和應用。其氨基酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代T，第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T。本發明為了解決現有技術的不足，利用基因工程手段對大腸桿菌植酸酶APPA的進行改良，以解決大腸桿菌植酸酶APPA熱穩定性差，不能適用于工業生產的要求，經過優化改良的植酸酶PHYTH其熱穩定性得到很大的提高，可在飼料工業中顯示出巨大的應用潛力。
文檔編號C12N9/16GK102002487SQ20101056626
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月24日 優先權日2010年11月3日
發明者吳迪, 張娟, 汪云飛, 羅長財, 謝建華, 陳麗芝 申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司