專利名稱：一種弓形蟲檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種弓形蟲檢測試劑盒及其應用。
背景技術：
弓形蟲病是由剛地弓形蟲引起的一種人畜共患的原蟲病。弓形蟲可感染多種動 物45種哺乳動物，70種鳥類和5種冷血動物。貓和貓科動物是弓形蟲的終末宿主，在終末 宿主體內弓形蟲主要侵襲小腸上皮細胞，造成腸道疾病。而在中間宿主(如豬、牛、羊等)體 內，弓形蟲侵入腸壁經血液或淋巴進入單核巨噬細胞系統的細胞內寄生，并擴散到全身各 處組織器官，如腦、淋巴結、肝、心、肺、肌肉等，造成全身多器官性的病變，對中間宿主的危 害相當大。豬是弓形蟲的主要易感動物，據有關報道顯示，我國豬場的弓形蟲感染率最高， 約26. 6%，最高可達60%。現有的弓形蟲檢測方法很多，大致可以分為三大類，即病原學診斷方法、血清學診 斷方法和分子生物學診斷法。病原學診斷方法包括組織學診斷、動物接種試驗和細胞培養 法。病原學診斷需要一定數量實驗動物，而且實驗周期較長。血清學診斷方法包括美藍染 色試驗(DT)、間接熒光抗體試驗(IFAT)、凝集試驗和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。分子生物 學診斷方法主要是聚合酶鏈式反應(PCR)，該方法比前兩種方法快速，靈敏，但需要使用特 殊的PCR儀，不適于基層應用。
發明內容
本發明的目的是提供一種弓形蟲檢測試劑盒及其應用。本發明提供的試劑盒基于 環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術，可以快速檢測 弓形蟲。本發明提供了檢測弓形蟲的專用引物，由以下三對環介導等溫擴增所用引物 組成；一對引物是與弓形蟲基因組中GenBank Accession Number AF146527基因(核 苷酸序列如序列表的序列1所示)結合的內側引物對，一對引物是與弓形蟲基因組中 GenBankAccession Number AF146527基因結合的外側引物對，一對引物是與弓形蟲基因組 中GenBank Accession Number AF146527基因結合的環形引物對。所述專用引物的靶區域具體可為序列表的序列1自5’末端第301-511位核苷酸 所示的DNA。所述內側引物對由上游引物FIP和下游引物BIP組成，所述上游引物FIP的核苷 酸序列具體可為序列表中的序列4，所述下游引物BIP的核苷酸序列具體可為序列表中的 序列5 ；所述外側引物對由上游引物F3和下游引物B3組成，所述上游引物F3的核苷酸序 列具體可為序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列具體可為序列表中的序列3 ； 所述環形引物對由上游引物LF和下游引物LB組成，所述上游引物LF的核苷酸序列具體可 為序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列具體可為序列表中的序列7。F3 :5，-TGGGAAGCGACGAGAGTC-3，(序列表的序列 2)；
B3 :5，-TGGATTCCTCTCCTACCCCT(序列表的序列 3)；FIP :5，-CCGGTGTCTCTTTTTCCACCCTTTTTTCGGAGAGGGAGAAGATGTTT-3，(序列表的序 列4)；BIP :5，-TCGTGGTGATGGCGGAGAATTTTCCTCCTCCCTTCGTCCAA-3，(序列表的序列 5)；LF :5，-GGAAAAGCAGCCAAGCCG-3，(序列表的序列 6)；LB :5，-GAATTGAAGAGTGGAGAAGAGGGCG-3，(序列表的序列 7)。應用所述專用引物檢測弓形蟲的原理如下根據弓形蟲GenBank Accession Number AF146527基因(序列表的序列1)部分 區域(序列1自5’末端第301-511位核苷酸)設計一組用于環介導等溫擴增的引物，即內 側引物對(內側上游引物FIP和內側下游引物BIP)、外側引物對(外側上游引物F3和外側 下游引物B3)和環形引物對(環形上游引物LF和環形下游引物LB)。三對引物和所述區域 變異區域的八個特定區域的序列完全配對(見表1)，可以確保反應的徹底進行，也保證了 檢測方法的特異性。表1專用引物與序列1所示基因的結合區域
權利要求
1.一種檢測弓形蟲的專用引物，由以下三對環介導等溫擴增所用引物組成；一對引物 是與弓形蟲基因組中GenBank Accession Number AF146527基因結合的內側引物對，一對 引物是與弓形蟲基因組中GenBank Accession Number AF146527基因結合的外側引物對， 一對引物是與弓形蟲基因組中GenBank Accession Number AF146527基因結合的環形引物對。
2.如權利要求1所述的專用引物，其特征在于所述內側引物對由上游引物FIP和下 游引物BIP組成，所述上游引物FIP的核苷酸序列是序列表中的序列4，所述下游引物BIP 的核苷酸序列是序列表中的序列5 ；所述外側引物對由上游引物F3和下游引物B3組成，所 述上游引物F3的核苷酸序列是序列表中的序列2，所述下游引物B3的核苷酸序列是序列表 中的序列3 ；所述環形引物對由上游引物LF和下游引物LB組成，所述上游引物LF的核苷 酸序列是序列表中的序列6，所述下游引物LB的核苷酸序列是序列表中的序列7。
3.權利要求1或2所述的專用引物在制備試劑盒中的應用；所述試劑盒用于檢測待測 樣本中是否含有弓形蟲和/或輔助鑒定弓形蟲。
4.一種含有權利要求1或2所述的專用引物的試劑盒；所述試劑盒用于檢測待測樣本 中是否含有弓形蟲和/或輔助鑒定弓形蟲。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括溶液B；所述溶液B由溶 劑和溶質組成；所述溶劑為水；所述溶質及其濃度如下所述上游引物F3為2. 4-3. 6pmol/ μ 1，所述下游引物Β3為2. 4-3. 6pmol/μ 1，所述上游引物FIP為20-28pmol/μ 1，所述下 游引物BIP為20-28ρπιΟ1/μ 1，所述上游引物LF為IO-Hpmol/μ 1，所述下游引物LB為 10-14pmol/y 1。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述溶液B中，所述上游引物F3為3pmol/ μ 1，所述下游引物Β3為3ρπι01/μ 1，所述上游引物FIP為24ρπι01/μ 1，所述下游引物BIP 為24ρπι01/μ 1，所述上游引物LF為12pm0l/l·! 1，所述下游引物LB為12pmol/y L·
7.如權利要求4或5或6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括溶液A；所述 溶液A由溶劑和溶質組成；所述溶劑為水；所述溶質及其濃度如下KC1為16. 67nmol/yl, MgSO4 · 7H20 為 13. 33nmol/y 1，(NH4)2SO4 為 16. 67nmol/y 1，鈣黃綠素為 0. 083nmol/y 1， MnCl2 · 4H20 為 lnmol/μ 1，四種脫氧核苷酸各 2. 33nmol/y 1，甜菜堿為 0. 33ymol/y 1，IM pH8. 8Tris-HCl 為 33· 33nmol/y 1，Tween-20 為 0. (體積百分含量)，Bst DNA 聚合酶 為 0. 80U/y 1。
8.—種檢測來自死亡動物的樣品中是否攜帶弓形蟲的方法，是用權利要求1或2所 述專用引物對來自死亡動物的樣品的總DNA進行環介導等溫擴增反應，檢測擴增產物，確 定來自死亡動物的樣品中是否攜帶弓形蟲；所述環介導等溫擴增反應的條件為60-65°C、 30-90min。
9.權利要求1或2所述專用引物或權利要求4至7中任一所述試劑盒在檢測待測樣本 中是否含有弓形蟲中的應用。
10.權利要求1或2所述專用引物或權利要求4至7中任一所述試劑盒在輔助鑒定弓 形蟲中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種弓形蟲檢測試劑盒及其應用。本發明提供的試劑盒，包括三對引物，即與弓形蟲基因組中Gen Bank Accession Number AF146527基因結合的內側引物對、外側引物對和環形引物對。本發明的弓形蟲檢測試劑盒，檢測靈敏度高，最低可檢測出10個拷貝的靶DNA，操作簡單方便，特別適于養豬場的常規體檢，基層臨床醫學檢測工作及現場即時檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102002531SQ20101056117
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者吳文學, 朱引潔, 索勛, 鄒杰, 郭盼盼 申請人:中國農業大學