專利名稱：與谷子株高基因緊密連鎖的分子標記SIsv0641的制作方法
與谷子株高基因緊密連鎖的分子標記Sl SV0641技術領域
本發明屬于分子生物學領域，涉及一種分子標記，具體地，涉及一種與谷子株高基 因緊密連鎖的分子標記。本發明還涉及該分子標記的引物、該分子標記在谷子株高基因定 位或谷子遺傳育種中的用途、一種谷子株高基因定位方法、以及一種谷子育種方法。
背景技術：
谷子(Setaria italica L. Beauv.)是起源于我國的重要糧食作物，主要在我國的 北方種植，在國家糧食生產和糧食安全中占有較為重要的地位。谷子是二倍體自花授粉作 物，其基因組較小，約470Mb，這些特性使其很適合作為基因組研究的對象。
目前，遺傳連鎖圖譜的構建已成為基因定位、圖位克隆以及基因組結構與功能研 究的重要基礎。而分子標記又是構建遺傳連鎖圖譜的基礎。株高作為關系到作物高產和穩 產的重要農藝性狀，直接關系到品種的株型、抗倒伏性、區域布局和產量構成性狀。因此，迫 切需要發現與谷子株高基因緊密連鎖的分子標記。發明內容
本發明人依據全基因組序列，經過大量的實驗和不懈的努力，提供了一種與谷子 (Setaria italica L. Beauv.)株高基因緊密連鎖的分子標記SIsv0641，并由此提供了下述 發明
本發明的一個方面涉及一種與谷子株高基因緊密連鎖的分子標記SIsv0641，其核 苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。其中加邊框部分為引物設計區段
520bp
IctCACTGCAAGACTCGACCT] cggcaggcatttatgcgctggctgcatcctgcacctcctccctcTCCCTCGCCCTGGTTTTGCTTGCGAGAGAGGCCAAAATGGCAGGAGACTATTATATAAAGTCTGCCCTGGCCATGTC TCTGAATCTGAGGGGGCGTTTTCTTCCCGTGTCTTATTTTTAGCACGTGTCACATCGAATGTTTAGATACTAATTAG GAGTAGTAAACGTAGACTATTTACAAAACCAATTACATAAGTGGAATCTAAACGGCGAGACGAATCTATTAAGCCTA ATTAATCCATCATTAGCAAATATTTACTGTAGCAACACATTGTCAAATCATGGACTCCTTTCCCTGTTGTTTTCTTG GTTGCAACTAGCGCCGTGCCACTTGGCTACTTGCGTGCGTTCAGCGAGCGTGCAGCCGTGCAGGTGCTTATATAGGTAGTAGAGGTCCAGAGCTACTAGCTAGGGATAGCAGACGGGCATGCAGTGGC |AATGGCATGGATGGGAl |AGCG(SEQ ID NO 1)
在本發明中，術語“與谷子株高基因緊密連鎖的分子標記”是指這樣的分子標記， 在遺傳連鎖圖譜中，該分子標記與谷子株高基因的遺傳連鎖距離小于2cM或者小于3cM;或 者在谷子的大于400個樣本中，非矮株型的樣本中含有該分子標記。
本發明的還一方面涉及本發明的分子標記的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示
SIsv0641F CTCACTGCAAGACTCGACCT(SEQ ID NO 2)
SIsv0641R :CGCTTCCCATCCATGCCATT(SEQ ID NO :3)。
本發明的分子標記也可以為含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA片段；該 DNA片段的長度為適當長度，但并不特別限定，例如，小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于 2，OOObp、小于 1，500bp、小于 1，200bp、小于 1，OOObp、或者小于 800bp。
在本發明的一個實施方案中，所述分子標記(含有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列 的DNA片段)為谷子基因組中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SEQ ID NO 1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因組中的序列，優選地，為谷 子基因組中SEQID NO :1的5’端和/或3’端的上下游序列。本領域技術人員可以理解， 只要擴增或者檢測谷子基因組DNA中的該分子標記，必然能夠檢測或擴增得到含有SEQ ID N0:1所示的序列。SEQ ID NO :1的5，端和/或3，端的上下游序列的長度為適當長度，并 不特別限定，例如，滿足分子標記的長度小于10，OOObp、小于5，OOObp、小于2，OOObp、小于 1，500bp、小于 1，200bp、小于 1，OOObp、或者小于 800bp。
在本發明的一個實施方案中，所述分子標記(含有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列 的DNA片段)所包含的SEQ ID NO 1的5，端和/或3，端可操作地連接有人工序列和/或 控制序列，例如啟動子、增強子、終止子、酶切位點、引物序列等等。其中，術語“可操作地” 在本發明中定義為一種如下構象，在該構象中，控制序列例如啟動子被適當地置于SEQ ID NO 1的一個位置上，以致該控制序列指導SEQ ID NO 1編碼的多肽的產生。
本發明的另一方面涉及一種重組載體，其含有本發明的分子標記。所述重組載體 可以是插入有本發明的分子標記的表達載體或者克隆載體。本發明的還一方面涉及一種重 組細胞，其含有該重組載體。
本發明的還一方面涉及本發明的分子標記的制備方法，包括下述步驟使用非矮 株型的谷子的基因組DNA作為模板，以上述引物進行PCR擴增，得到的擴增產物即含有所述 分子標記；優選地，還包括將PCR擴增產物進行純化的步驟。在本發明的一個實施方案中， 所述非矮株型的谷子為張谷1號、張雜谷3號、或張雜谷3號自交產生的F2代中的非矮株型。
對本領域技術人員而言，可以理解，也可以DNA化學合成的方法得到本發明的分 子標記。
本發明的還一方面涉及所述分子標記的檢測方法，包括下述步驟
(1)根據本發明的分子標記的核苷酸序列設計引物；
(2)以被檢測谷子的基因組DNA作為模板進行擴增；
(3)判斷擴增產物中是否存在該分子標記。
例如，可以以被檢測谷子的基因組DNA為模板，以上述引物(SEQID NO :2和SEQ ID NO 3)進行PCR擴增，得到擴增產物。可以將得到的擴增產物進行測序或者凝膠電泳。
本發明的還一方面涉及本發明的分子標記在谷子株高基因定位或檢測中的用途。
本發明的還一方面涉及一種谷子株高基因定位的方法，包括使用本發明的分子標 記的步驟。
本發明的還一方面涉及本發明的分子標記在谷子輔助育種中的用途。
本發明的還一方面涉及一種谷子輔助育種方法，包括檢測本發明的分子標記的步驟。
本發明的分子標記可用于今后的分子標記輔助育種中，本領域技術人員可以理 解，比如通過檢測是否存在本發明的分子標記來篩選谷子的理想株型(例如，可以參考， DNA分子標記在小麥抗病育種中的用途，隴東學院學報(自然科學版)，2006年4月第16卷 第1期，P65-69)。檢測出具有本發明的分子標記的為非矮株型，不具有該分子標記的為矮 株型。所述檢測可以是PCR檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發明的分子標記引物。 所述檢測還可以通過測序方法進行。該谷子輔助育種方法具有簡便、快速、高通量的優點。
在本發明中，具體地，所述谷子可以為張谷1號、谷子A2不育系、張雜谷3號、或張 雜谷3號自交產生的F2代。其中，谷子A2不育系、張雜谷3號自交產生的部分F2代(株 高為IOOcm左右)，是矮株型；張谷1號、張雜谷3號、或張雜谷3號自交產生的另一部分F2 代(株高為130cm左右和150cm左右)為非矮株型。
發明的有益效果
本發明提供了與谷子株高基因緊密連鎖的分子標記，并將谷子基因組DNA與谷子 株高基因聯系起來，更有利于谷子分子標記輔助育種體系的建立；所述分子標記與株高基 因的遺傳緊密連鎖距離為2. IcM0本發明的分子標記可以簡便、快速、高通量地應用于谷子 輔助育種。
圖1 分子標記引物(SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3)對F2代480個單株擴增的部分結果。
M 表示 marker，其為 200bp DNA Ladder ；其分子量包括4000bp、3000bp、2500bp、 2000bp、1800bp、1600bp、1400bp、1200bp、1000bp、800bp、600bp、400bp、以及 200bp。泳道 1-12為F2代中12株非矮株型的單株的PCR擴增產物；泳道13- 為F2代中12株矮株型 的單株的PCR擴增產物。結果顯示非矮株型的植株中條帶大小為520bp，矮株型的植株中 條帶大小小于520bp。
關于生物材料保藏的說明
本發明涉及以下生物材料
1.張谷1號種子，其于2010年9月6日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)， 保藏編號為CCTCC NO :P201012，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心， 430072。
2.谷子A2不育系種子，其于2010年9月6日保藏于中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :P201013，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保 藏中心，430072。
3.張雜谷3號種子，其于2010年9月6日保藏于中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :P201010，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保 藏中心，430072。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規產品。
實施例1 谷子F2代分離群體的構建
父本為張谷1號株型高(非矮株型，株高為150cm左右)，抗拿捕凈(拿捕凈是 一種除草劑)，旗葉長而窄，剛毛紅色，穎殼紅色，可育，葉色偏綠。
母本為A2不育系株型矮(矮株型，株高為IOOcm左右)，不抗拿捕凈，旗葉短而 寬，剛毛綠色，穎殼綠色，部分不育，葉色偏黃。
父本和母本雜交得到Fl (張雜谷3號，非矮株型，株高為130cm左右)。
Fl代自交產生F2代群體，共480個單株。對480個F2代個體進行株高性狀分析， 發現非矮株型360株(株為高130cm左右和150cm左右)，矮株型120株(株高為IOOcm左 右)。
實施例2 父母本以及Fl代、F2代個體基因組DNA的提取
用CTAB法分別提取實施例1中的父母本、Fl代、以及480個F2代個體的基因組 DNA,具體方法如下
(1)稱取1. Og新鮮葉片，剪碎放入研缽，用液氮研磨后加入:3ml 1. 5XCTAB，研磨成 勻漿轉入15ml的離心管中，然后往研缽中加入Iml 1. 5 X CTAB沖洗再轉入離心管中。混勻 后于65°C水浴30分鐘，期間不時緩慢搖勻。
其中1. 5XCTAB 配方如下(IL)
CTAB15g
IM Tris. Cl (pH 為 8. 0)75ml
0. 5M EDTA30ml
NaCl61. 4g
加去離子水定容至1L，使用前加入終濃度為0. 2% (2ml)的巰基乙醇。
(2)待冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇04 1)，輕輕混勻，至下層液變為 深綠色。
(3) 4200rpm離心10分鐘，將上層水相移到新的15ml離心管，加2倍體積預冷的無 水乙醇，混合靜止5分鐘。于-20°C放置30分鐘沉淀DNA。
(4) 4200rpm離心10分鐘，棄掉上清，加入Iml 75%乙醇洗滌沉淀1次，倒置離心 管干燥DNA，加入200 μ 1 TE溶解DNA。
(5)用0. 8%的瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA。
(6)將得到的父母本以及Fl代、F2代個體的基因組DNA存于_20°C備用。
實施例3 分子標記的制備
以實施例2中提取的父本、Fl代、或F2代中的非矮株型的基因組DNA為模板，以 分子標記引物(SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 3)進行PCR擴增。
PCR反應體系如下
無菌水20·2μ1
10*Buffer (含 Mg2+)2. 5 μ 1
dNTPs (25mM)0. 15μ 1
Taq 酶(5υ/μ1)0. 15 μ 1
正向引物
反向引物
模板
總體積0. 5μ 10.5μ 11.0μ 1 25 μ 1
PCR反應程序如下
94°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸40秒，運行35個循 環；最后72°C延伸3分鐘。PCR擴增產物可以在4°C保存。
將擴增產物純化，得到分子標記。純化后進行測序，結果如SEQ IDNO :1所示。
對本領域技術人員而言，可以理解，也可以通過DNA化學合成的方法得到該分子 標記。
實施例4 分子標記弓I物的初步篩選
對父本進行de novo 測序(60X contig N50 :22K, scaffold N50 :320K ；Total size :400Mb)，母本重測序(10X)。
根據父母本測序數據，利用SOAP軟件(例如S0AP2. 20，可以從http://SOap. genomics, org. cn/下載，也可以使用其它的序列比對軟件)比較父母本之間的序列差異， 然后基于差異的序列，在父本5’端和3’端外側約50bp位置，隨機選取20bp左右的長度， 用primerpremier軟件隨機設計引物，一共設計了 1105對引物，下面的表1中示出了其中 的部分引物的序列(SEQ ID NO :2-41)。
表1 :1105對隨機引物中的部分引物
權利要求
1.一種與谷子株高基因緊密連鎖的分子標記，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；或 者其為含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA片段。
2.一種重組載體，其含有權利要求1所述的分子標記。
3.—種重組細胞，其含有權利要求2所述的重組載體。
4.權利要求1所述的分子標記的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO 2和SEQ ID NO 3 所示。
5.權利要求1所述的分子標記的制備方法，包括下述步驟使用非矮株型的谷子的基因組DNA作為模板，以權利要求4所述的引物進行PCR擴增； 優選地，還包括將PCR擴增的產物進行純化的步驟；具體地，所述非矮株型的谷子為張谷1 號、張雜谷3號、或張雜谷3號自交產生的F2代中的非矮株型。
6.權利要求1所述的分子標記的檢測方法，包括下述步驟(1)根據權利要求1的分子標記的核苷酸序列設計引物；(2)以被檢測谷子的基因組DNA作為模板進行擴增；(3)判斷擴增產物中是否存在該分子標記。
7.權利要求1所述的分子標記在谷子株高基因定位或檢測中的用途。
8.一種谷子株高基因定位的方法，包括使用權利要求1所述的分子標記的步驟。
9.權利要求1所述的分子標記在谷子輔助育種中的用途。
10.一種谷子輔助育種方法，包括檢測權利要求1所述的分子標記的步驟。
全文摘要
本發明屬于分子生物學領域，涉及一種分子標記，具體地，涉及一種與谷子株高基因緊密連鎖的分子標記，其核苷酸序列如SEQ IDNO1所示，或者其為谷子基因組中含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA片段。本發明還涉及該分子標記的引物、該分子標記在谷子株高基因定位或谷子遺傳育種中的用途、一種谷子株高基因定位方法、以及一種谷子育種方法。本發明發現了與谷子株高基因緊密連鎖的分子標記SIsv0641，將谷子基因組DNA序列與谷子株高基因聯系起來，更有利于谷子分子標記輔助育種體系的建立。
文檔編號C12N5/10GK102031259SQ20101055330
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月22日 優先權日2010年11月22日
發明者全志武, 夏秋菊, 張耕耘, 彭小華 申請人:深圳華大基因科技有限公司