專利名稱：高密度發酵生產沼澤紅假單胞菌發酵液的方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵，特別是指一種高密度發酵生產沼澤紅假單胞菌發酵液的 方法。
背景技術：
光合細菌作為一種營養豐富的光能自養菌，本身含有多種營養物質和生理活性物 質，具有進行光合作用、發酵以及固氮、產氫等功能，近幾十年來受到廣泛的關注，在人類生 活的多方面都具有重要作用，在廢水處理、單細胞菌體蛋白生產、水產養殖、農牧業、生產食 用色素等方面的應用有著不可替代的生物學作用，特別是近年來作為生物制品的綠色、環 保作用更加受到各界人士的重視。隨著現代工業、農業、養殖業的可持續發展，傳統的光合 細菌生產的方法已不能滿足各行業的需求，大規模、高密度發酵生產已成為光合菌生產的 方向，選擇合適的菌株以及適當的培養條件是大規模工業化生產的關鍵技術步驟。
目前傳統的光合細菌生產一般有室內和室外培養兩種方法。室內培養適用比較少量的 生產，用透明的玻璃瓶(桶)或塑料瓶(桶)作容器，白熾燈作光源，在30°C培養，周期為7-10 天；室外培養適用規模較大的生產，用透明的大桶作容器或在地上挖出池子，以日光為光源 和能源，受季節影響很大，一般在發酵溫度在高于25V，且低于35-38°C的季節才能生產， 生產周期受氣溫的影響在5-15天不等，產品質量的穩定性也不能有效保障。并且傳統方法 生產光合細菌受季節等因素的影響不易進行規模化工業大生產。沼澤紅假單胞菌seudomonas /^h1Siri1S)是研究和應用較為廣泛的一種 光合細菌，屬于外硫紅螺菌科紅假單胞菌屬，最佳生長方式是利用各種有機化合物作碳源 和電子供體進行光照厭氧培養。
發明內容
本發明的目的在于提供一種高密度發酵生產沼澤紅假單胞菌發酵液的方法，用兩 步法發酵生產沼澤紅假單胞菌，與傳統的生產方法相比較具有生產周期短和產品質量穩定 的優勢，更易于大規模工業化生產。本發明的整體技術構思是
高密度發酵生產沼澤紅假單胞菌發酵液的方法，包括如下工藝步驟
A、將沼澤紅假單胞菌ASl.2349接種到種子培養基中，采用光照培養法進行擴大培養 制成種子液，按照體積比為種子培養基種子罐=200-300 1000的比例裝料，將種子培養基 滅菌后，按照體積比為原始菌種種子培養基=3-5 100的接種量將原始菌種接入種子罐， 培養條件為溫度，光照強度3000-4000LX，靜止培養4_6天，發酵液呈淡紅色，用顯 微鏡觀察計數，菌體細胞卵形，生長正常，無雜菌污染，含菌量35-40億/毫升以上，終止培 養；
B、將步驟A中的種子液接種到發酵培養基中，采用暗培養法進行發酵制成沼澤紅假 單胞菌發酵液，按照體積比為發酵培養基發酵罐=60-70 100的比例裝料，將發酵培養基滅菌后冷卻，按照體積比為種子液發酵培養基=8-10 100的接種量將步驟A中制成的種 子液接入冷卻后的發酵培養基，發酵條件為溫度^_32°C，通風量按照發酵液通風量=1 0. 3-0. 5vvm，培養周期M-36小時，顯微鏡觀察菌體細胞生長正常，無雜菌，終止發酵；
其中步驟A、B中種子培養基、發酵培養基pH=7. 0-7. 5，且由如下百分含量的原料組成 葡萄糖 0. 18%-0. 2% 硫酸銨 0. 18%-0. 22% 酵母膏 0. 12%-0. 18% 乙酸鈉0. 16%-0. 2% 氯化鈉0. 08%-0. 1% 余量為水。本發明中的具體的工藝步驟和工藝條件是
步驟A中種子培養基的滅菌條件為溫度121°C、時間20-30分鐘。步驟B中發酵培養基的滅菌條件為溫度121_125°C、時間25_35分鐘，滅菌冷卻至 35°C以下后向發酵培養基中接入種子液。步驟B中終產物——沼澤紅假單胞菌發酵液可采用最大或然值法(MPN5管法)測 定活菌含量。本發明中發酵的檢測結果如下
河北省微生物研究所檢測中心按照《中華人民共和國行業標準-光合細菌菌劑》(NY 527-2002)記載的方法，對利用本發明的方法制備的沼澤紅假單胞菌發酵液進行測試，菌體 濃度可以達到70億/毫升以上，最高可以達到77. 6億/毫升(目前光合細菌產品沒有國家 標準，國家行業標準的要求僅是不低于5億/毫升)。本發明所具備的實質性特點和顯著的技術進步在于
1、生產周期短，發酵液中的菌體濃度高。采用上述培養基配方和生產工藝發酵生產沼 澤紅假單胞菌，發酵生產周期短，僅為M 36小時；菌體濃度可以達到70億/毫升以上。2、生產成本低，工藝容易控制。用兩步法發酵生產光合細菌原料的總固形物含量 不超過1%，且全部為市售化工原料，生產成本低廉，用通用式發酵罐發酵生產工藝易控制， 產品質量穩定，可以達到大規模工業化生產的要求。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步描述，但不作為對本發明的限定，本發明的保 護范圍以權利要求書所記載的內容為準，任何依據本發明說明書所作出的等效技術手段替 換，均不脫離本發明的保護范圍。實施例1
高密度發酵生產沼澤紅假單胞菌發酵液的方法，包括如下工藝步驟
A、將沼澤紅假單胞菌ASl.2349接種到種子培養基中，采用光照培養法進行擴大培養 制成種子液，按照體積比為種子培養基種子罐=200 1000的比例將原始菌種接入IOOOml 三角瓶中，將種子培養基滅菌后，按照體積比為原始菌種種子培養基=3 100的接種量將 菌種接入三角瓶中，培養條件為溫度，光照強度3000-4000LX，靜止培養4_6天，發酵液 呈淡紅色，用顯微鏡觀察計數，菌體細胞卵形，生長正常，無雜菌污染，含菌量35-40億/毫 升以上，終止培養；
B、將步驟A中的種子液接種到發酵培養基中，采用暗培養法進行發酵制成沼澤紅假單 胞菌發酵液，按照體積比為發酵培養基發酵罐=60 100的比例裝料，將發酵培養基滅菌后 冷卻，按照體積比為種子液發酵培養基=8 100的接種量將步驟A中制成的種子液接入冷卻后的發酵培養基，發酵條件為溫度，通風量按照發酵液通風量=1 :0. 3vvm,培養周 期M-36小時，顯微鏡觀察菌體細胞生長正常，無雜菌，終止發酵；
其中步驟A、B中種子培養基、發酵培養基pH=7.0，且由如下百分含量的原料組成 葡萄糖0. 18 硫酸銨0. 18% 酵母膏0. 12% 乙酸鈉0.16% 氯化鈉0.08% 余量為水。發酵罐采用通用式發酵罐。步驟A中種子培養基的滅菌條件為溫度121°C、時間20-30分鐘。步驟B中發酵培養基的滅菌條件為溫度121_125°C、時間25_35分鐘，滅菌冷卻至 35°C以下后向發酵培養基中接入種子液。步驟B中終產物——沼澤紅假單胞菌發酵液可采用最大或然值法(MPN5管法)測 定活菌含量。實施例2
高密度發酵生產沼澤紅假單胞菌發酵液的方法，包括如下工藝步驟
A、將沼澤紅假單胞菌ASl.2349接種到種子培養基中，采用光照培養法進行擴大培養 制成種子液，按照體積比為種子培養基種子罐=300 1000的比例裝料，將種子培養基滅菌 后，按照體積比為原始菌種種子培養基=5 100的接種量將原始菌種接入種子罐，培養條 件為溫度32°C，光照強度3000-4000LX，靜止培養4_6天，發酵液呈淡紅色，用顯微鏡觀察計 數，菌體細胞卵形，生長正常，無雜菌污染，含菌量35-40億/毫升以上，終止培養；
B、將步驟A中的種子液接種到發酵培養基中，采用暗培養法進行發酵制成沼澤紅假單 胞菌發酵液，按照體積比為發酵培養基發酵罐=70 100的比例裝料，將發酵培養基滅菌后 冷卻，按照體積比為種子液發酵培養基=10 100的接種量將步驟A中制成的種子液接入 冷卻后的發酵培養基，發酵條件為溫度32°C，通風量按照發酵液通風量=1 0. 5vvm，培養 周期M-36小時，顯微鏡觀察菌體細胞生長正常，無雜菌，終止發酵；
其中步驟A、B中種子培養基、發酵培養基pH=7. 5，且由如下百分含量的原料組成 葡萄糖0. 2% 硫酸銨0. 22% 酵母膏0. 18% 乙酸鈉0.洲 氯化鈉0.1% 余量為水。發酵罐采用通用式發酵罐。步驟A中種子培養基的滅菌條件為溫度121°C、時間20-30分鐘。步驟B中發酵培養基的滅菌條件為溫度121_125°C、時間25_35分鐘，滅菌冷卻至 35°C以下后向發酵培養基中接入種子液。步驟B中終產物——沼澤紅假單胞菌發酵液可采用最大或然值法(MPN5管法)測 定活菌含量。
權利要求
1.高密度發酵生產沼澤紅假單胞菌發酵液的方法，其特征在于包括如下工藝步驟A、將沼澤紅假單胞菌ASl.2349接種到種子培養基中，采用光照培養法進行擴大培養 制成種子液，按照體積比為種子培養基種子罐=200-300 1000的比例裝料，將種子培養基 滅菌后，按照體積比為原始菌種種子培養基=3-5 100的接種量將原始菌種接入種子罐， 培養條件為溫度，光照強度3000-4000LX，靜止培養4_6天，發酵液呈淡紅色，用顯 微鏡觀察計數，菌體細胞卵形，生長正常，無雜菌污染，含菌量35-40億/毫升以上，終止培 養；B、將步驟A中的種子液接種到發酵培養基中，采用暗培養法進行發酵制成沼澤紅假 單胞菌發酵液，按照體積比為發酵培養基發酵罐=60-70 100的比例裝料，將發酵培養基 滅菌后冷卻，按照體積比為種子液發酵培養基=8-10 100的接種量將步驟A中制成的種 子液接入冷卻后的發酵培養基，發酵條件為溫度^_32°C，通風量按照發酵液通風量=1 0. 3-0. 5vvm，培養周期M-36小時，顯微鏡觀察菌體細胞生長正常，無雜菌，終止發酵；其中步驟A、B中種子培養基、發酵培養基pH=7. 0-7. 5，且由如下百分含量的原料組成葡萄糖 0. 18%-0. 2% 硫酸銨 0. 18%-0. 22% 酵母膏 0. 12%-0. 18%乙酸鈉0. 16%-0. 2% 氯化鈉0. 08%-0. 1% 余量為水。
2.根據權利要求所述的高密度發酵生產沼澤紅假單胞菌發酵液的方法，其特征在于所 述的步驟A中種子培養基的滅菌條件為溫度121°C、時間20-30分鐘。
3.根據權利要求1所述的高密度發酵生產沼澤紅假單胞菌發酵液的方法，其特征在于 步驟B中發酵培養基的滅菌條件為溫度121-125°C、時間25-35分鐘，滅菌冷卻至35°C以下 后向發酵培養基中接入種子液。
全文摘要
本發明屬于微生物發酵，特別是指一種高密度發酵生產沼澤紅假單胞菌發酵液的方法。以沼澤紅假單胞菌AS1.2349作為原始菌種，依次采用光照培養法進行擴培，將擴培制成的種子液接入發酵培養基采用暗培養法進行發酵制成沼澤紅假單胞菌發酵液。本發明解決了現有技術存在的周期長、產品質量不易得到控制等問題。具有發酵周期短、產品質量穩定、生產成本低等優點。
文檔編號C12R1/38GK102061279SQ201010552678
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月22日 優先權日2010年11月22日
發明者唐兆宏, 李軍, 李賓, 章淑艷, 趙叢波, 陳文杰, 馬清河, 魏亞新 申請人:河北省微生物研究所