專利名稱：從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交總rna的方法
技術領域：
本發明屬于一種從動物脂肪組織中提取總RNA的方法，特別是一種涉及到提取動 物脂肪組織中總RNA樣品用于基因芯片研究的方法。
背景技術：
脂肪組織不僅是機體的能量儲存庫，還是體內最大的內分泌器官。動物脂肪組織 在生后初期有細胞數量的增生，但仍以細胞體積的增大為主，特別是在后期或成年期極易 在體內貯積。脂肪代謝包括脂肪動員(脂肪降解)、體內運轉和脂肪貯存(脂肪合成)。動 物體脂的沉積量是脂肪合成代謝和分解代謝的一種平衡狀態。當合成代謝增強，或分解代 謝降低時，會打破原有的平衡而導致脂肪沉積量的增加。當脂肪分解多于合成時，則體內脂 肪減少。深入了解脂肪代謝的調控機制，將有助于控制動物脂肪的沉積量和提高胴體品質。 為了尋找調控指脂肪沉積的關鍵新基因，將采用基因芯片、生物信息學分析、等現代分子生 物學技術篩選一批與肌內脂肪沉積相關的差異表達新基因，而其首要任務則為高質量、高 純度RNA的提取。目前RNA的提取技術已非常成熟，也有大量利用各種方法和商業化試劑成功提取 高質量RNA的文獻報道，盡管這些方法和試劑具有諸多優點，如方法簡單、提取的RNA質量 高等，但當遇到組織RNA的豐度極低，且RNA產品中常伴有基因組DNA污染等問題時，按照 常規步驟操作往往不能取得理想的結果；由于組織的特異性，脂肪組組織富含脂類物質，單 位體積細胞數較少，成熟脂肪細胞內含有各種細胞器、細胞核以及與其他類型細胞不同的 一個大的中央脂滴。且單位細胞RNA含量也相對較少，每毫克組織樣品所含總RNA的量小 于0. 05 μ g，因而所提RNA的得率較低，這增加了從脂肪組織提取RNA的難度。而且用于基 因芯片的脂肪組織中的RNA—般都是用試劑盒提取的，價格比較昂貴，試劑盒的購買都是 來自國外，購買起來也十分不方便。因此，擺脫試劑盒的束縛，尋求一種常規、經濟和快捷的 方法提取動物脂肪組織中的總RNA以用于基因芯片研究，并且在實際操作中應根據試驗的 需要選擇或改進相應的方法，以期達到預期的目的，顯得尤為迫切。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種方便、快捷的從動物脂肪組織中提取用于基 因芯片雜交的總RNA的方法。為了解決上述技術問題，本發明提供一種從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜 交的總RNA的方法，包括以下步驟1)、組織研磨和Trizol裂解選擇以下任意一種方式取0. 4 0. 6g液氮速凍脂肪，于液氮條件下研磨成組織粉末，然后將組織粉末用 5ml Trizol進行充分裂解，得裂解組織；取Ig的脂肪，于液氮條件下進行研磨；然后加入9 Ilml的Trizol進行裂解，得裂解組織；2)、氯仿抽提在裂解組織中加入1. 8 2. 2ml氯仿進行RNA提取，劇烈震蕩后于 4°C高速離心15min ；3)、氯仿再次抽提取步驟2)所得的上清，加入氯仿，氯仿與上清的體積比為 1 2 4;劇烈震蕩后于4°C高速離心15min;4)、異丙醇沉淀取步驟3)所得的水相(位于上層)，加入與水相等體積的異丙 醇，均勻混合(輕柔上下顛倒5-6次)后，然后于冰上放置5分鐘，再4°C高速離心IOmin ；5)、總RNA洗滌在步驟4)所得的沉淀中加入質量濃度75%的乙醇，將沉淀吹打 懸浮，于4°C高速離心8min ；質量濃度75%的乙醇是步驟1)中Trizol體積的55 65% ；6)、總RNA溶解將步驟5)所得的沉淀于室溫超凈臺內進行干燥，得總RNA沉淀； 再用RNase-free水溶解總RNA沉淀。作為本發明的從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法的改進 步驟2) 5)中的高速離心的速度為15300Xg。作為本發明的從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法的改進 步驟1) 步驟6)在無RNA酶污染狀態下進行。且上述所有步驟連續無間隔的進行；若因 突發事件無法繼續試驗，可暫將Trizol裂解后的組織液(即步驟1)所得的裂解組織)直 接保存于-80°C保存。在本發明中，步驟3)為必須的一個關鍵步驟。在本發明中，動物是是畜類，優選豬。本發明方法的檢測結果表明所得總RNA樣品完全滿足RT-PCR、構建cDNA文庫， 制基因芯片等相關實驗的要求，為進一步從分子水平研究豬脂肪沉積及其代謝特性提供方 法上的參考依據。本發明具有如下有益效果1.通過此方法提取的總RNA，質量高，Ig脂肪組織中約可提出120 μ g總RNA，濃度 達1 μ g/μ 1，可以完全滿足并可直接用于后續研究基因芯片雜交用。2.本方法操作簡單，所用試劑經濟實惠，方法簡單易行。3、本方法相對于昂貴的試劑盒提取總RNA用于基因芯片實驗，成本低。
結合附圖對本發明的具體實施方案作進一步詳細說明圖1是本發明的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的降解結果；圖 2 是 Agilent 2100bioanalyzer 檢測 RNA 的完整性結果。
具體實施例方式實施例1、一種從豬皮下脂肪中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法，依次進行 以下步驟，下述步驟1) 步驟6)均在無RNA酶污染的狀態下進行1)、組織研磨和Trizol裂解將豬皮下脂肪組織切取IOOmg左右放入研缽，在液氮環境中研成粉末，裝入1. 5ml 的印pendorf管，再加入Iml的Trizol劇烈搖晃約5min ；使其充分裂解，得裂解組織；
2)、氯仿抽提在步驟1)所得的裂解組織中加入200 μ 1氯仿進行RNA提取，劇烈振蕩3分鐘待 其充分混合后，于室溫放置5min，再于4°C，15300rmp離心15min ；離心后可見明顯分層，吸 取上層清澈液體(即上清，約600 μ 1)；3)、氯仿再次抽提在步驟2)所得的上清中加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩片刻(約3分鐘)后，于室溫 放置5min，于4°C，15300rmp離心15min，離心后可見明顯分層，吸取上層清澈液體(作為水 相，約 500 μ 1)；4)、異丙醇沉淀在步驟3)所得的水相中加入等體積的異丙醇輕輕混勻(輕柔上下顛倒5-6次)， 然后于冰上放置5分鐘，再于4°C，15300rmp離心IOmin ；5)、總 RNA 洗滌棄步驟4)所得的上清，在步驟4)所得的沉淀中加入質量濃度75%乙醇(經DEPC 處理，無RNA酶)0. 6ml，振蕩混勻后，4°C，15300rmp離心8min ；6)、總 RNA 溶解棄步驟5)所得的上清，將步驟5)所得的沉淀用濾紙吸干殘余液體，置超凈臺面自 然風干(約20min左右)；加入20 30 μ 1 RNase-free水溶解。實施例2、提取的總RNA濃度測定和以期用于基因芯片雜交的質量檢測(以實施例 1所得的溶液作為樣品)l)nanodrop-1000spectrophotometry 測定樣品在 260、280 及 230nm 的光密度及 RNA濃度，并計算RNA的純度。2)電泳檢測① RNA 變性取 RNase-free 1. 5ml 離心管，加入 1. 5 μ L RNA, 5. 5 μ L RNA變性緩沖液，65°C變性20min，稍離心，加入1. 5μ L 6 X loading buffer (RNA專用)。②瓊脂糖凝膠電泳配制2%的瓊脂糖凝膠，100V恒壓，IOmin電泳。③RNA電泳 圖拍照及分析。3) RNA完整性分析Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA的完整性，并對RNA質量 進行評分。總RNA質量檢測結果采用nanodrop-lOOOspectrophotometry進行檢測，所獲 得 RNA 的 OD (260nm) /OD (280nm)比值在 1. 90-2. 00 之間，OD (260nm) /OD (230nm)比值在 1.60-1. 90之間。RNA濃度在eOO-lOOOng/yL之間。所獲得的濃度及產量完全滿足基因芯 片雜交的要求。因此，可推算得知實施例1所得的總RNA為12 20 μ g。通過電泳結果檢測，發現RNA基本沒有降解，電泳條帶清晰無拖尾現象，且純度 高、完整性好。進一步RNA完整性檢測結果顯示，RNA完整性好，總RNA質量評分均在8. 0以上， 完全可滿足并可直接用于基因芯片雜交的要求。上述樣品耗費不超過10元，大大節約了成 本。對比例1、將同實施例1的IOOmg左右的豬皮下脂肪組織按照目前常規的Trizol/ 氯仿一次性12000 Xg離心提取法提取RNA，結果如下總RNA質量檢測結果采用nanodrop-lOOOspectrophotometry進行檢測，所獲得 RNA 的 OD (260nm) /OD (280nm)比值在 1. 90-2. 00 之間，但 OD (260nm) /OD (230nm)比值在 1.00-1. 30之間。所提取的RNA量小于2 μ g。所得產物不適宜直接用于芯片雜交。
通過電泳結果檢測，發現RNA基本沒有降解，電泳條帶較為清晰無拖尾現象，純度
一般，完整性一般。 進一步RNA完整性檢測結果顯示，RNA完整性一般，總RNA質量評分均在7. 0-8. 0 之間，不可直接用于基因芯片雜交的要求。對比例2、將同實施例1的IOOmg左右的豬皮下脂肪組織按照Qiagen公司生產的 RNeasyLipid Tissue Mini Kit試劑盒進行提取RNA (3580元/kit)，每個樣品制備至少需 要70元，結果如下總RNA質量檢測結果采用nanodrop-lOOOspectrophotometry進行檢測，所獲 得 RNA 的 OD (260nm) /OD (280nm)比值在 1. 90-2. 00 之間，但 OD (260nm) /OD (230nm)比值在 1. 70-2. 00之間。約500mg的脂肪組織樣品提取的RNA量約在12-25 μ g左右。所得產物可 直接用于芯片雜交。通過電泳結果檢測，發現RNA完全沒有降解，電泳條帶清晰無拖尾現象，純度高、 完整性好。進一步RNA完整性檢測結果顯示，RNA完整性好，總RNA質量評分均在8. 5-9. 5之 間，并完全滿足且可直接用于基因芯片雜交的要求。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法，其特征是包括以下步驟1)、組織研磨和Trizol裂解選擇以下任意一種方式取0.4～0.6g液氮速凍脂肪，于液氮條件下研磨成組織粉末，然后將組織粉末用5ml Trizol進行充分裂解，得裂解組織；取1g的脂肪，于液氮條件下進行研磨；然后加入9～11ml的Trizol進行裂解，得裂解組織；2)、氯仿抽提在裂解組織中加入1.8～2.2ml氯仿進行RNA提取，震蕩后于4℃高速離心15min；3)、氯仿再次抽提取步驟2)所得的上清，加入氯仿，氯仿與上清的體積比為1∶2～4；震蕩后于4℃高速離心15min；4)、異丙醇沉淀取步驟3)所得的水相，加入與水相等體積的異丙醇，均勻混合后，然后于冰上放置5分鐘，再4℃高速離心10min；5)、總RNA洗滌在步驟4)所得的沉淀中加入質量濃度75％的乙醇，將沉淀吹打懸浮，于4℃高速離心8min；所述質量濃度75％的乙醇是步驟1)中Trizol體積的55～65％；6)、總RNA溶解將步驟5)所得的沉淀于室溫超凈臺內進行干燥，得總RNA沉淀；再用RNase free水溶解總RNA沉淀。
2.根據權利要求1所述的從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法， 其特征是所述步驟2) 5)中的高速離心的速度為15300X g。
3.根據權利要求2所述的從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法， 其特征是所述步驟1) 步驟6)在無RNA酶污染狀態下進行。
全文摘要
本發明公開了一種從動物脂肪組織中提取用于基因芯片雜交的總RNA的方法，包括以下步驟1)組織研磨和Trizol裂解；2)氯仿抽提在裂解組織中加入氯仿進行RNA提取；3)氯仿再次抽提取步驟2)所得的上清，加入氯仿抽提；4)異丙醇沉淀取步驟3)所得的水相，加入與水相等體積的異丙醇，均勻混合；5)總RNA洗滌在步驟4)所得的沉淀中加入質量濃度75％的乙醇，將沉淀吹打懸浮；6)總RNA溶解將步驟5)所得的沉淀于室溫超凈臺內進行干燥，得總RNA沉淀；再用RNase-free水溶解總RNA沉淀。采用該方法提取用于基因芯片雜交的總RNA具有方便、快捷的特點。
文檔編號C12N15/10GK101984054SQ20101055178
公開日2011年3月9日 申請日期2010年11月19日 優先權日2010年11月19日
發明者伍婷, 汪以真, 袁章琴 申請人:浙江大學